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方法論記事

壊死性皮膚感染症の化 膿性連鎖球 菌マウスモデル

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DOI:

10.3791/70159

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2026年3月6日

 , 
1Department of Biomedical Sciences, Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University, 2Department of Molecular Microbiology, Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

この記事について

サマリー

本プロトコルは、細菌負荷と病変進行を独立的に定量化できる、 化膿性連鎖球菌 のマウス皮下感染モデルを記述します。この方法は、細菌の病原性因子、宿主免疫応答、または組織損傷を減らす治療的介入の役割を評価するための標準化かつ再現性の高いプラットフォームを提供します。

要約

化膿性連鎖球菌 は、急速かつ広範な組織破壊を伴う重篤な壊死性軟部組織感染症を引き起こすヒト病原体です。これらの感染症の研究における重要な課題は、細菌の複製や宿主介有組織損傷を独立して評価できる実験モデルの欠如です。本記事では、この制限を克服するために、 S. pyogenes 壊死性皮膚感染の標準化かつ再現可能なマウス皮下モデルを提示します。プロトコルは、対数相細菌接種の調製、マウスの皮下感染、病変発生の縦断的モニタリングを記述しています。主なステップには、鎖長の標準化のための細菌培養超音波検査、潰瘍面積の定量解析のための病変のデジタル画像診断、組織均質化とプレートによる細菌負荷の測定が含まれます。この多用途モデルは、特定の細菌遺伝子、宿主因子、治療的介入が感染進行や組織病理に与える影響を評価するために容易に適応可能です。細菌および宿主のパラメータの再現性かつ定量的な評価を可能にすることで、この方法は病因の研究や浸潤性連鎖球菌感染時の組織損傷を抑える戦略の検証に強力なプラットフォームを提供します。

概要

化膿性連鎖球菌(グループA型、GAS)は、壊死性軟部組織感染症(NSTIs)を引き起こす重要なヒト病原体であり、皮膚およびその下の組織を急速に破壊します。これらの感染症の病因を研究するには、局所的な組織損傷を再現しつつ、細菌の複製や宿主介在性病理の独立評価を可能にする動物モデルが必要です5。多くの従来の感染モデル、例えば全身接種やin vitro細胞培養システムは、細菌負荷と組織損傷を分離する能力に限界があり、病原性因子や宿主反応の具体的な寄与を評価するのが困難です6。

この方法の全体的な目的は、S. pyogenes壊死性皮膚感染の標準化かつ再現可能なマウス皮下モデルを提供することです。この技術の根拠は、病原体の複製と宿主介在の組織損傷を切り離す扱いやすいin vivoシステムを構築することにあります。このモデルは一般的な実験用マウス株に非常に適応性が高いです。SKH1(無毛株)株は病変モニタリングの容易さのためによく用いられますが、脱毛後の有毛株(例:C57BL/6J)でも効果的に機能します。発表された報告では、通常、性別または単一性別(多くは女性)を用い、報告された特定の実験条件下で類似した病変領域や細菌負荷が見つかることが多いです。しかし、宿主の遺伝的背景や性別は、一部の環境でGAS疾患の重症度に影響を与えることがあり、実験設計や結果解析時に考慮すべきです。このモデルの代替モデルに対する大きな利点は、局所的な病変を縦断的にモニタリングできるため、同一動物の潰瘍面積と細菌負荷を時間経過とともに正確に独立的に定量化できることです。適切に選ばれた接種と株を用いることで、皮下感染は局所的に発生し、病変の進行や解決の研究が可能です。とはいえ、感染が局所的かどうかは株、接種株、宿主に依存します。特定の臨床分離株(またはcovRS変異を獲得する株)や十分に大きな接種株は、免疫能力のあるマウスに細菌血症や致死性疾患を拡散させる可能性があります10。著者は、モデルを新しい分離株に適応させる際に株、接種量、ルート、宿主修飾の有無を報告し、接種量を滴定すべきです。このアプローチは再現性が高く、アクセスしやすく、組織学や免疫プロファイリングを含む多様な下流解析と互換性があります。

このプロトコルは複数のGAS株(HSC511や他のM1T1 10,12などのM1型分離株を含む)および臨床用NSTI分離株に適用されています。病原性表現型はEMMタイプや分離株ごとに異なるため、研究者は接種量を実証的に最適化し、プロトコルを新しい株に翻訳する際に全身的な拡散を監視すべきです。

このプロトコルは、細菌の病原性、宿主免疫応答、侵襲感染時の組織保存を標的とした新規治療戦略を研究したい微生物病原学、免疫学、トランスレーショナルリサーチの研究者に適しています。その標準化された定量的な設計により、介入の厳密な評価が可能であり、病原体の複製と宿主介有組織損傷の相互作用を研究するための多様なプラットフォームを提供します。

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プロトコル

すべての動物実験は、マーシャル大学医学部の施設動物ケア・利用委員会(IACUC)および動物資源施設の遵守に従って実施されました。 化膿性連鎖球菌 を含むすべての処置は、PHS保証のAAALAC認定動物施設で、バイオセーフティレベル2(BSL-2)の封じ込めのもと、機関のバイオセーフティプロトコルに従って実施されました。実験的なワークフローは 図1に示されています。

注:試薬、材料、機器の具体的な詳細は 材料表に記載されています。

1. 接種用細菌の調製

  1. 凍結ストックから Streptococcus pyogenes HSC5を10.5mLのC培地(0.5%ペプトネ、1.5%酵母抽出物、10 mM K2HPO4、0.4 mM MgSO4、17 mM NaCl)に接種して一晩培養します。37°Cで16〜20時間静置培養します。
  2. 一晩培養した600 nm(OD600)の光学密度を測定します。6,000 x g の培養液10 mLを室温で5分間遠心分離します。
  3. 細菌ペレットを、1%酵母エキスを補った新鮮で予熱されたトッド・ヒューイットブロス0.5mLに再懸浮させます。
  4. 再懸濁細菌を円錐形のチューブで、1%酵母抽出物を補足した予温トッドヒューイットブロス500mlを接種し、OD600を0.05の開始値にします。
  5. 37°Cでチューブを振動せずに孵化させます。OD600を30分ごとに監視してください。
  6. 培養液がOD600~0.00~0.200に達したら、6,000 x g で遠心分離し、4°Cで5分間採取します。
  7. 上澄液を捨て、ペレットを氷のように冷たく無菌リン酸塩緩衝(PBS)溶液10mLに再懸濁させます。
  8. 6,000 x g で4°Cで5分間、サスペンションを遠心分離します。 最終ペレットを1mLの氷のように冷たい無菌PBS溶液に再懸浮させます。サスペンションは冷やしておけ。
    注:この濃縮細菌懸浮液は、超音波検査に進む前に最大30分間氷上に保管できます。

2. 細菌濃度の標準化

  1. 1mLの細菌懸濁液をマイクロ遠心分離機チューブに移します。カップホーンソニックケーターを使って氷の上で懸濁液をソニック処理し、長い S. pyogenesの連鎖を断ち切る。
    注意:超音波検査中は適切な聴覚保護具を着用してください。この処置は高周波の騒音を発生させ、聴力にダメージを与える可能性があります。
  2. ソニックケーターを1分間のパルスを5サイクル(ソニケーターに依存)を供給するように設定します。効果的な連鎖破壊を確認するために、超音波サスペンションの10μL滴を顕微鏡スライドに置き、カバースリップで覆い、40倍で可視化します。
    注:超音波処理の目的は、長い鎖を主に短い鎖(理想的には1鎖あたり1〜4細胞)と単一のコッキに減らすことです。長い鎖(>10セル)がまだ存在する場合は、超音波検査サイクルを繰り返します。
  3. 超音波検査された細菌を無菌PBS溶液で1:100希釈して準備します。
  4. 希釈した細菌10μLをカウントチャンバー/細菌ヘモサイトメーターに投与します。
  5. 顕微鏡でチャンバーの10個の大きな正方形の細菌鎖の数を数えます。
  6. 細菌濃度(コロニー形成単位/mL)を次の式で計算します:濃度=(総数/10)×希釈因子×1.25 ×10 6。
    注意:細菌細胞の各鎖は単一のCFUとして数えられます。
  7. 超音波処理済みの細菌ストックを氷で冷たいPBSで希釈し、最終的な作動濃度を1 ×10 8 CFU/mLにします。

3. マウスの皮下感染

  1. 感染の前日に、各マウスの左後ろ側腹を剃ります。電動クリッパーを使って、約2cm×2cmの範囲の毛を完全に取り除きます。
  2. 誘導チャンバーでマウスを麻酔します(誘導4%、維持イソフルラン1.5%)。感染の同期を維持するために、マウスを小規模で管理しやすいバッチ(例:1バッチ5〜10匹)で処理します。
  3. 27Gの針を装着した1 mLの注射器を使い、細菌接種物100 μLを抽出します。
  4. マウスをイソフルランチャンバーから取り出し、すぐに麻酔をかけたマウスの剃った後側腹部に皮下で針を刺し、面取りを上に向けて挿入します。
  5. 100μLの全容量をゆっくりと注入して局所的なブレブを作ります。針を抜いて。
  6. ネズミをケージに戻し、麻酔が完全に回復するまで監視してください。
  7. 実験コホートのすべてのマウスに対してステップ3.2〜3.5を繰り返します。
  8. PBS中に残った細菌接種点を連続10倍希釈して準備します。
  9. 各希釈液のうち5μLを寒天プレートにスポットプレートします。投与量を確認するために、37°Cで無酸素プレートを一晩培養します。

4. 感染進行の縦断的モニタリング

  1. 感染したマウスは少なくとも1日に一度、不快の兆候がないか監視してください。特に高病原株や免疫抑制された宿主を使用する際には、確立された人道的エンドポイントを遵守してください。
  2. ステップ3.2で説明された手順に従って、各マウスに麻酔をかけます。
  3. マウスをイソフルランチャンバーから取り出し、識別ラベルの隣に横向きに置きます。個々のマウスを縦方向に追跡するために、実験開始前に各動物にマーキング(例:耳パンチ、イヤータグ)を付けてください。
  4. マウスの真上に取り付けられたカメラを使って病変部位のデジタル写真を撮影します。
  5. 画像解析ソフトウェア(ImageJ/Fiji)でデジタル画像を開きます。ツールバーから フリーハンド選択 ツールを選択してください。
  6. 画像で目に見える潰瘍の周囲を手動でなぞってください。
  7. 分析メニューを開き、「測定」を選択して、トレースされた周囲の範囲内の面積を計算してください。
  8. 各マウスの各時刻で測定面積を平方ミリメートル単位で記録します。
    注:この時点で実験は一時停止可能です。マウスはケージに戻され、次の観察時点または終点までモニタリングを続けます。

5. 組織採取と細菌負荷の定量化

  1. 実験的エンドポイントで、二酸化炭素吸入と子宮頸部脱臼を用いてマウスを安楽死させます。この方法はマーシャル大学IACUCが承認しています。
  2. 無菌手術用ハサミと鉗子を使い、病変全体と周囲組織の最小限の部分を無菌的に切除します。切除には皮膚の全厚と下皮下組織が含まれ、通常は筋肉層まで広がりますが、感染が筋肉筋膜に目に見えて侵入している場合は除きます。
  3. 組織を、あらかじめ計量済みの滅菌2 mLスクリューキャップマイクロ遠心機に移し、そこに1 mLの滅菌PBSと2つの滅菌2.8mmステンレス製ビーズを含みます。
  4. 組織の重さを記録してください。
  5. 機械的均質装置を6.5 m/sに設定し、60秒間均質化します。
  6. 過熱を防ぐために、チューブを5分間氷の上に置いてください。
  7. 組織を6.5 m/sで60秒の第2サイクルで均質化します。
  8. 無菌PBSを希釈剤として使用し、96ウェルプレート上で組織均質酸を連続10倍希釈して製製します。各希釈液のうち5μLを寒天プレートにスポットプレートします。
  9. プレートを37°Cで24〜48時間無酸素的に孵化します。例えば、嫌気性ガス発生装置のサシェと嫌気性指示器を備えた密閉された瓶の中にプレートを置きます。
  10. 30〜300個の植民地をプレートに数えてみてください。組織均質物質1 mLあたりのコロニー形成単位(CFU/mL)を計算します。

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結果

S. pyogenesのマウス皮下感染モデルは、局所的で進行性の壊死性潰瘍を一貫して発生させ、細菌負荷と組織病理の同時定量化を可能にします。この標準化されたプロトコルからの代表的な結果は以下の通りです。

実験群は通常、病変の大きさや細菌負荷の有意な差を検出するのに十分な統計的検出力(例:80〜90%)を提供するために6〜10匹のマウスで構成されます(これは先行研究8,14,15に基づく)。データは適切な統計検定(例:2群のペアなしt検定、複数群の一方向ANOVAと事後検定)を用いて分析されます。対照群には、活性体(例:不妊PBS)を単独で注入したマウスと、変異株を試験する際に野生型(WT)親株に感染した並行群を含めるべきです。

野生型S. pyogenes株HSC5の1×107 CFU...

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ディスカッション

ここで述べるマウス皮下S . pyogenes 壊死性皮膚感染モデルは、重度の軟部組織感染のメカニズムを解明するための強固かつ再現性の高いシステムを提供します。その主な価値は、細菌負荷を組織病理から切り離し、宿主因子と病原体因子が独立して疾患進行にどのように寄与するかを機構的に研究できることにあります。この区別は特にS . pyogenes 感染症において重要であり、壊死性筋膜炎の重症度は細菌の増殖だけでなく、ストレプトリシンなどの病原性因子に対する宿主の過剰な炎症反応を反映することが多いです(18)。

一貫性があり解釈可能な結果を得るためには、いくつかの方法論的ステップが重要です。細菌接種の標準化が不可欠です。培養物はC培地で一晩培養し、Todd-Hewitt(THY)ブロスにサブカルチャーし、病原性因子の均一な発現を確保するために中期ログフェーズ(OD600 ≈ 0.200)で収穫してください。C培地の組成...

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開示事項

著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。

謝辞

この研究はマーシャル大学スタートアップ基金およびWV臨床・トランスレーショナルサイエンス研究所のベンチ・トゥ・ベッドサイド助成金(U54GM104942)によって支援されました。国立衛生研究所(NIH)がR21 AI163825(MGCへ)助成金を授与。マーシャル大学動物資源施設所長のジル・カーン博士(MA, DVM, MPH, DACLAM)とIACUC議長のモニカ・ヴァレントヴィック博士(PhD)に感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 mL シリンジBD309628皮下注射の場合
28-G針BD305109皮下注射の場合
細菌血球計/計数室ハウサー・サイエンティフィック02-671-6細菌のカウント(予防接種前)
BD BBL ガスパック EZ 嫌気性コンテナシステムベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー(BD)260001嫌気性潜伏のために
C57BL/6Jマウスジャクソン研究所664生後8〜12週
二酸化炭素(CO2)タンク現地サプライヤー該当なし安楽死のために
カップホーンソニケーター (例:Q700)クソニカ431C2細菌の鎖長を標準化するために
デジタルカメラ該当なし該当なし病変画像診断のために
エレクトリック・クリッパーズワール例:8655-200ネズミの側面を剃るために
FastPrep-24ホモジナイザーMPバイオメディカル116005500組織均質化のために
ImageJソフトウェア国立衛生研究所(NIH)該当なしhttps://imagej.nih.gov/ij/
イソフルランバクスター1001936060麻酔用
イソフルラン麻酔システム (チェンバー&ヴェポライザー)VetEquipなど該当なしマウス麻酔用
ペプトンベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー(BD)211677C培地の調製用
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)ギブコ10010023無菌、pH 7.4
S. pyogenes 株 HSC5カパロン研究所M1T1臨床分離株
SKH1マウスチャールズリバー研究所477生後8〜12週、無毛
ステンレス製ビーズ、2.8mmユニバーサル・メディカルD1133-28無菌
無菌外科用ハサミと鉗子ファインサイエンスツールなど該当なし無菌組織採取のために
トッド・ヒューイット・ブロスベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー(BD)249240細菌サブカルチャーについて
酵母抽出物など;(Cメディアの場合)ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー(BD)212750Cメディウムの調合用(ブロスサプリメントと同じ)

参考文献

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