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方法論記事

空間トランスクリプトームデータ解析の実践的ワークフロー：データ取得から高度な解析まで

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DOI:

10.3791/70188

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2026年8月21日

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1Rehabilitation Medicine Center, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 2Department of Neurology, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 3School of Rehabilitation Medicine, Nanjing Medical University

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、空間トランスクリプトームデータの解析に向けた再現可能なワークフローを提示します。公開データの取得から、Seuratを用いた品質管理、データの統合、空間的特徴の検出、細胞型のデコンボリューション、関心領域（ROI）のアノテーション、そして細胞間相互作用の解析に至るまでの手順を、透明性のある実行を支援する実用的なチェックポイントと共に解説します。

要約

空間的トランスクリプトーム解析（ST）は、組織切片内におけるmRNA分子の2次元的な空間的コンテクストを保持したままゲノムワイドな遺伝子発現をプロファイリングする手法であり、組織構造や微小環境に関連する生物学的研究を可能にします。しかし、データのインポート、品質管理、統合、デコンボリューション（逆畳み込み）、空間統計、および可視化には、多くの場合、複数のソフトウェア環境と再現可能なパラメータ選択が必要となるため、ST解析は依然として困難な課題となっています。本プロトコルでは、公開STデータセットを用いたRでの実用的な計算ワークフローを提示します。具体的には、データの取得とソフトウェアのセットアップから始まり、Seuratに基づくデータの読み込み、品質管理、正規化、複数サンプルの統合、クラスタリング、および空間可変遺伝子解析までを順に説明します。その後、リファレンスガイドに基づくSPOTlight解析や、教師なしのSTdeconvolveトピックモデリングを含む相補的なデコンボリューション戦略を適用し、続いてGiottoを用いた空間的な細胞間相互作用解析と、カスタムPython Dashアプリケーションを使用したインタラクティブな関心領域（ROI）の選択を行います。スクリプトベースの実行、明示的なパラメータの根拠、期待される出力、およびトラブルシューティングのチェックポイントを重視することで、本プロトコルは、データセットおよびプラットフォーム固有のパラメータ評価を経た後、標準的なアレイベースのSTデータセットおよび関連プラットフォームに適応可能なフレームワークを提供します。

概要

空間トランスクリプトミクス（ST）は、組織切片内におけるメッセンジャーRNA（mRNA）分子の空間座標を保持したまま、ゲノムワイドな遺伝子発現を測定する革新的な技術群である。ST法には、位置バーコード化アレイを用いるシーケンシングベースのアプローチと、完全な組織微小環境内で転写シグナルをマッピングするin situイメージングアプローチが含まれる1,2。空間的なコンテキストを保持することで、STは組織構造、細胞近傍の組織化、細胞間コミュニケーション、および組織解離後では十分に解明できない微小環境に関連する生物学的プロセスの解析を可能にする3。

公開STデータリポジトリの急速な拡大により、二次解析や手法開発においてかつてない機会がもたらされています3。CROSTデータベースなどのリソースは、複数の種や技術プラットフォームにわたる数百の空間分解能トランスクリプトームデータセットをキュレートしており、一方でSTOmicsDBのような特化型のコレクションは、Stereo-seqなどの特定の解析手法に焦点を当てています4,5。このようなデータの豊富さがあるにもかかわらず、空間データ構造の複雑さ、解析ツールの多様性、および再現可能なワークフローを実装する上での技術的ハードルにより、計算解析は依然として困難な課題となっています6,7,8,9,10,11。

単一のソフトウェア環境に依存することによる制限を解消するため、相補的な解析ツールを活用した統合的な計算ワークフローを本稿で提示します。既存の包括的なST解析エコシステムには、主にSeurat、Giotto、およびSquidpy6,7,12などのPythonベースのフレームワークが含まれます。SquidpyのようなPythonベースのツールは空間グラフ解析において広範な機能を提供していますが、主要な計算パイプラインを単一のプログラミング言語環境に集約することで、言語間での技術的な障壁を最小限に抑えることができます。したがって、言語間の技術的障壁を軽減するため、コアパイプラインは主にRで実装されています。このRベースのワークフローにおいて、シングルセルおよび空間トランスクリプトームのワークフローで一般的に使用されているSeuratを、データの読み込み、品質管理、正規化、次元削減、可視化、およびマルチサンプルの統合に使用します。その後、Giottoを用いて空間ネットワークの構築およびリガンド・受容体に基づく細胞間通信解析を行います。このように、本パイプラインはSeuratによる前処理および統合とGiottoによる空間解析を連携させ、2つのツールセット間のデータ転送を明示的かつ再現可能な形式で維持しています。

このフレームワークでは、2つの相補的なデコンボリューション戦略が実装されています。1つはscRNA-seqデータを使用して細胞型の比率を推定するリファレンスガイド法であるSPOTlightであり、もう1つは潜在的な転写パターンを特定する非教師ありトピックモデリング法であるSTdeconvolveです8,11。これらの出力は空間的な細胞不均一性の相補的な視点を提供しますが、ユーザーがプロトコルに記載されている任意の整合性解析を行わない限り、定量的なクロスバリデーションとしては扱われません。また、インタラクティブな関心領域（ROI）アノテーション用のカスタムPython DashアプリケーションであるSelect Spatial Spotsが統合されており、以降のダウンストリーム解析に使用可能な標準的な座標ベースのアノテーションファイルをエクスポートします。

実用性に関しては、本ワークフローは主に標準的なアレイベースのSTデータ（例：解像度 55 µm のVisium）を対象としており、パラメータの評価後に他の組織型へ適応させることが可能です。解析前に、主要な制限事項を考慮する必要があります。第一に、参照ガイド付きデコンボリューションモジュールは、高品質で組織が一致したscRNA-seqリファレンスに依存します。第二に、サブセルラーまたはシングルセルに近いプラットフォームでは、統合前に前処理の変更、空間的なビンの集約、または画像ベースの細胞セグメンテーションが必要になる場合があります2。代表的なマウス結腸データセットは、本ワークフローが空間ドメインおよびマーカーで定義された組織構成をどのように評価できるかを示すデモンストレーションとして使用されており、あらゆるプラットフォームへの汎用的な互換性を証明するものではありません。

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プロトコル

本プロトコルで解析されるすべての生物学的データセットは公開されており、厳格にデモンストレーション目的で使用されています。特定のデータアクセッション番号およびソースリポジトリは、関連する手順の中で提供されます。元のデータセットは、各ソース研究に適用される機関の倫理ガイドラインに従い、元の研究者によって作成されました。必要なすべてのソフトウェアおよびRパッケージのバージョンを確認するには、材料表を参照してください。

ハードウェア要件：このワークフローに必要な計算メモリは、解析するサンプル数およびスポット数に応じて変動します。一般的な空間トランスクリプトームデータセット（例：最大3サンプルで、1サンプルあたり約3,000スポット）の場合、パイプラインの実行には最低16 GBのRAMを搭載した標準的なワークステーションで十分です。ただし、SCTransform正規化やデコンボリューション中の行列分解など、メモリ負荷の高い計算ステップにおいて最適なパフォーマンスと安定性を確保するためには、32 GB以上のRAMを搭載することを強く推奨します。

1. データの取得とディレクトリ構造の準備

  1. 公開されている空間トランスクリプトームデータセット（例：GEOアクセッション GSE169749、投稿日 2021年3月26日、最終更新日 2022年3月6日）およびシングルセルRNA-seqリファレンスデータ（例：GEOアクセッション GSE264408、投稿日 2024年4月19日、最終更新日 2024年12月10日）を入手する。
  2. リポジトリから生データアーカイブ（例：GSE169749_RAW.tar）をダウンロードし、アーカイブを解凍する。
    注：本プロトコルで使用している代表的なデータセットでは、解凍後のディレクトリにサンプルごとの複数のファイルが含まれており、ファイル名には通常GEOサンプルのアクセッション番号（例：GSM5213483）が組み込まれている。
  3. Seuratの Load10X_Spatial 関数と互換性のある標準的なディレクトリ構造にファイルを整理する。
    1. メインのデータディレクトリ（例：./data/）を作成する。
    2. サンプルごとに専用のサブディレクトリ（例：./data/sample_A1/）を作成する。
    3. 各サンプルの以下の必須ファイルを、それぞれのサブディレクトリに転送（コピーまたは移動）する。
      1. filtered_feature_bc_matrix.h5 ファイルをサンプルのメインサブディレクトリに配置する。
      2. 各サンプルディレクトリ内に spatial/ サブフォルダを作成する。
      3. 以下のファイルを spatial/ サブフォルダに配置する： tissue_positions_list.csv.gz, scalefactors_json.json.gz, および tissue_hires_image.png.gz.
    4. spatial/ フォルダ内の .gz ファイルを解凍する。元のファイル名が Load10X_Spatial 関数で要求される形式（例：tissue_positions_list.csv）と完全に一致していることを確認する。
      注：スムーズな読み込みを実現するための最終的な整理構造は、サンプルA1を例として以下のパターンに従う必要がある：
      ./data/sample_A1/filtered_feature_bc_matrix.h5
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_positions_list.csv
      ./data/sample_A1/spatial/scalefactors_json.json
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_hires_image.png

2. ソフトウェア環境のセットアップ

  1. R（バージョン 4.4.3 以降）をインストールします。
  2. GitHub リポジトリ（https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow、再現性のためにコミットハッシュ 2d85e18 を使用）から解析スクリプト（1_ReadSpatialData.R から 8_Giotto_Communication.R）を取得します。
  3. スクリプト setup.R を実行して、CRAN および Bioconductor から必要な R パッケージをインストールします。
    注：本ワークフローで使用される特定のパッケージバージョンの包括的なリストは、Table of Materials に記載されており、関連する GitHub リポジトリ（https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow）内の session_info.txt ファイルでも確認可能です。
  4. 公式ドキュメントに記載されているインストールコマンドを実行して、Giotto Suite をインストールします。
    1. 公式インストールURL（https://giottosuite.com/articles/installation.html）にアクセスし、セットアップスクリプトを取得します。
    2. ステップバイステップの指示に従い、必要な Python 環境およびシステム依存関係を初期化します。
  5. 視覚化を強化するための追加パッケージをインストールします。
    1. install.packages(c("ggprism", "colorBlindness")) を実行します。
  6. カスタムツール Select Spatial Spots をインストールします。オペレーティングシステムが Windows、macOS、または Linux であり、Python バージョン 3.8 以降がインストールされていることを確認してください。このステップは任意です。
    1. GitHub リポジトリ（https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots、再現性のためにコミットハッシュ d20946e を使用）にアクセスし、ソースコードをダウンロードしてツールを取得します。
    2. ツールのディレクトリに移動し、Python の依存関係をインストールします： pip install -r requirements.txt
  7. SCTransform 正規化を高速化するため、BiocManager::install("glmGamPoi") を実行して glmGamPoi パッケージをインストールします。
    注：コアワークフローには、ステップ 2.1～2.3 および 2.6 に記載されているパッケージのみが必要です。Rfast2 パッケージは、モランの I 統計量の計算を高速化するために使用されます。ステップ 2.5 の任意パッケージは、Prism スタイルのテーマ（ggprism）を用いた論文投稿用プロットの作成および、色覚多様性に配慮したパレット（colorBlindness）へのアクセスのためのものです。ステップ 2.6 のツールは、インタラクティブなスポット選択機能を可能にします。sessionInfo() コマンドを実行し、コンソールの全出力をテキストファイルに保存してください。これにより、長期的な再現性を確保するために不可欠な、正確なソフトウェアバージョンとパッケージの依存関係が記録されます。

3. 空間データの読み込みと品質管理(1_ReadSpatialData.R, 2_SpatialDataQC.R)

  1. 空間データをSeuratオブジェクトに読み込みます。
    1. 使用法 Read10X_Image 高解像度の組織画像を手動で読み込み、以下を指定します。 image.dirおよびimage.name。
    2. 使用法 10X_Spatialのロード 〜を用いて 画像 ステップ3.1.1で作成した画像オブジェクトにパラメータを設定し、Seuratオブジェクトを作成します。
  2. 品質管理指標を算出する。
    1. 以下の方法を用いて、ミトコンドリアリードの割合を算出します。 パーセンテージ特徴量セット パターンを用いて ^mt-.
  3. QC指標に基づいたデータの可視化および解析を行う。
    1. のバイオリンプロットを作成する nCount_Spatial, nFeature_Spatial、および ミトコンドリア遺伝子割合 使用して バイオリンプロット.
    2. 以下を使用して、これらの指標の空間的特徴プロットを作成します。 SpatialFeaturePlot 組織領域外のスポットを特定するため。
      注：視覚的チェックポイント：組織領域外のスポットは、通常、低いUMIカウントを示します（nCount_Spatial < 500) および低遺伝子検出（nFeature_Spatial < 200)
    3. デモンストレーションのため、低品質のスポットを除去するフィルターを適用します（例： subset(seurat_obj, subset = nFeature_Spatial) > 200 & nCount_Spatial > 500)）。これは任意の手順です。
      注：空間トランスクリプトーム解析における品質管理（QC）の主な目的は、組織外のスポットなどの技術的なアーティファクトを特定し、注釈を付けることです。デモンストレーション用のVisium結腸データでは、nFeature_Spatial > 200 および nCount_Spatial > 500個の低複雑度または背景ノイズのスポットを除去します。RNA含有量が少ない組織や分解が進んだ切片については、閾値を上げる前にバイオリンプロットと空間的特徴プロットを確認してください。一方、密度が高い組織やUMI数が多い組織では、より厳格な閾値が適切である場合があります。ダブレット、組織の折り畳み、または明らかなアーティファクトが確認できない限り、高発現値のみに基づいてフィルタリングを行うことは避けてください。フィルタリングによって空間的な位置情報が物理的に削除されるため、後続の空間解析において組織構造の連続性が損なわれる恐れがあり、一般的に推奨されません。

4. データの前処理、統合、およびクラスタリング (3_IntegrationAndClustering.R)

  1. 個々のサンプルを正規化し、前処理します。
    1. assay = を指定し、各サンプルに個別にSCTransform正規化を適用します。 空間的.
  2. 複数のサンプルを統合します。
    1. 統合に向けて、SCT正規化済みのオブジェクトのリストを準備します。各オブジェクトに以下の項目が含まれていることを確認してください。 "RNA" ～をコピーすることによるアッセイ "空間的" アッセイ： spatial_list[[1]][["RNA"]] <- spatial_list[[1]][["空間的"]]
      ​注：～をコピーする "空間的" アッセイを標準化する "RNA" assayスロットは、もともと単一細胞のSeuratオブジェクト向けに設計されたダウンストリームの統合機能との互換性を確保するために必要な回避策として機能します。
    2. 使用方法 統合機能の選択 および PrepSCTIntegration 共通の可変的特徴を特定するため。
    3. 以下を用いてインテグレーションアンカーを特定する FindIntegrationAnchors 〜を用いて 正規化法 = "単一細胞転写解析（SCT）".
    4. IntegrateDataを用いてデータを統合します。 正規化手法 = "単一細胞トランスクリプトーム解析".
  3. 統合アッセイに対して、次元削減およびクラスタリングを行う。
    1. 統合データを用いて、以下の手法で主成分分析（PCA）を実行する PCAの実行.
    2. 累積寄与率を算出することで、下流解析に最適な主成分数（PC数）を決定します。累積寄与率が90%を超え、かつ限界利得が0.1%を下回る点など、プログラムを用いてエルボー点を特定します。その際は、以下のコードを使用してください。 3_統合およびクラスタリング.R、36-38行目得られた主成分（PC）の数は、以下のように定義される。 pc.use.
    3. 以下の条件でRunUMAPを実行します。 dims = 1:pc.use.
    4. 以下を用いて細胞をクラスター化します。 近接ノードの検索 〜を用いて dims = 1:pc.use およびFindClustersを用いて 解像度 = 0.5クラスターの安定性とマーカー遺伝子の整合性を確認した後にのみ、解像度を調整してください。
    5. 標的グループ間（例： "B1_結腸_d14" 対比 "A1_結腸_d0"）を用いて マーカーの同定 機能
      ​注：視覚的チェックポイント：統合が成功していれば、UMAPプロットにおいて、生物学的に異なるクラスターを維持しつつ、サンプルが適切に混ざり合って表示されます。
  4. 空間的に変動する遺伝子を特定する。
    1. 各元のサンプルについて、以下の操作を行う。 空間的に変動する特徴の抽出（FindSpatiallyVariableFeatures） 〜を使用して "モランズI（Moran's I）" ～における手法 "単一細胞転写解析（SCT）" 空間的自己相関を算出するためのアッセイ。

5. 単一細胞リファレンスデータのプリプロセッシング (4_scDataPreProcessing.R)

  1. Read10Xを使用してシングルセルRNA-seqのカウント行列を読み込み、Seuratオブジェクトを作成します。
  2. 標準的なQC、正規化、およびクラスタリングを実施します。
    1. ミトコンドリアリードの割合（percent.mt）を算出し、細胞をフィルタリングします（例：nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 7500 & percent.mt < 25）。
    2. vars.to.regress = "percent.mt"に設定し、SCTransformを用いてデータを正規化します。
    3. PCAおよびUMAPを実行し、ステップ4.3.2で説明されている動的PC選択法を用いて細胞をクラスタリングします。
  3. 細胞型のアノテーションを行います。
    1. AddModuleScoreを用いて、標準的な細胞型マーカー遺伝子のモジュールスコアを算出します。
    2. モジュールスコアと既知の生物学的知見に基づき、クラスターのアノテーションを行います。あるいは、メタデータから計算済みのアノテーションをインポートします。

6. SPOTlightを用いたリファレンスガイド下でのデコンボリューション (5_SPOTlight_Deconv.R)

  1. SPOTlight用データの準備。
    1. アノテーション済み単一細胞Seuratオブジェクトと空間SeuratオブジェクトをSingleCellExperimentオブジェクトに変換する。
    2. logNormCountsを用いて単一細胞データを対数正規化する。
  2. SPOTlightデコンボリューションの実行。
    1. modelGeneVarおよびgetTopHVGsを用いて、単一細胞データの高変動遺伝子（HVGs）を同定する。
    2. scoreMarkersを用いて細胞型マーカー遺伝子を算出し、高品質なマーカー（例：mean.AUC > 0.8）でフィルタリングする。
    3. 計算時間を短縮するため、各細胞型の単一細胞リファレンスを管理可能な数（例：50細胞）までダウンサンプリングする。
    4. weight_id = "mean.AUC", group_id = "cluster", gene_id = "gene"を指定して、SPOTlight関数でデコンボリューションを実行する。
  3. 結果の可視化とエクスポート。
    1. デコンボリューション結果マトリックス（スポットごとの細胞型割合）を抽出する。
    2. plotSpatialScatterpieを用いて、空間座標上の細胞組成を可視化する。
    3. AddMetaDataを用いて、デコンボリューション結果を空間Seuratオブジェクトのメタデータに追加する。期待される出力：各空間スポットの細胞型割合カラムを持つデコンボリューションマトリックス、局所的な細胞組成を示す空間スキャッターパイプロット、およびメタデータとしてデコンボリューション割合を含むSeuratオブジェクト。

7. STdeconvolveを用いたリファレンスフリーのデコンボリューション(7_STdeconvolve.R)

  1. 空間データの準備を行う。
    1. GetAssayData with slot = "counts"を使用して、空間Seuratオブジェクトから生カウント行列を抽出する。
    2. STdeconvolveのcleanCountsを用いて、低品質のスポットおよび遺伝子を除去する（例：min.lib.size = 100）。
  2. 潜在的な細胞タイプを特定する。
    1. restrictCorpus を用いて、最小限のスポット割合で発現している遺伝子でコーパスをさらにフィルタリングする（例：removeAbove=1.0、removeBelow = 0.05）。
    2. fitLDAを用いて、潜在的なトピック数（K）の範囲（例：Ks = seq(2, 9, by = 1)）にわたって潜在的ディリクレ配分法（LDA）モデルを適合させる。
    3. optimalModel with opt = "min"を使用し、最小パープレキシティに基づいて最適なモデルを選択する。
  3. 結果の解析と視覚化を行う。
    1. getBetaThetaを使用して、最適モデルから細胞タイプ（トピック）の割合（theta）および遺伝子プロファイル（beta）を抽出する。
    2. デコンボリューションされたトピックの生物学的解釈を助けるために、「Select Spatial Spots」ツール（ステップ9.3.3参照）で生成した関心領域（ROI）のアノテーションをインポートする。これらのアノテーションを vizAllTopics関数のgroupsパラメータとして使用し、デコンボリューションされた細胞タイプの割合を空間座標に再投影し、スポットをROIごとに色分けする。これはオプションのステップである。
      注：期待される出力：STdeconvolveは、スポットごとのトピック割合を表すtheta値と、各トピックの遺伝子プロファイルを表すbeta値を返すべきである。教師なしのSTdeconvolveの結果を、リファレンスガイド付きのSPOTlightの出力（ステップ6）と定量的に比較したい場合は、両方の割合行列（STdeconvolveのthetaとSPOTlightの行列）をエクスポートし、標準的なR関数を用いてスポットごとの相関または一致度指標（例：ピアソン相関またはスピアマン相関）を算出できる。SPOTlightとSTdeconvolveの定量的な比較はオプションであり、コアワークフローの実行に必須ではないが、そのような解析を行いたいユーザーのために、関連する出力行列がステップ6.3.1および7.3.1から利用可能である。

8. Giottoを用いた空間的な細胞間相互作用の解析(8_Giotto_Communication.R)

  1. SeuratオブジェクトをGiottoオブジェクトに変換します。
    1. createGiottoObject関数を使用し、生カウントマトリックスと空間座標を提供します。
  2. Giottoオブジェクトを前処理し、デコンボリューションの結果を追加します。
    1. normalizeGiottoを用いてデータを正規化します。
    2. addCellMetadataを使用して、細胞タイプのアノテーション（例：SPOTlightデコンボリューションによる主要細胞タイプ）を細胞メタデータに追加します.
  3. 空間情報を考慮した細胞間コミュニケーションを推定します。
    1. createSpatialNetwork を用い、method = "Delaunay" およびname = "Delaunay_network"を指定して空間ネットワークを作成します。
    2. リガンド・受容体データベースをR環境にロードします。ロードされたオブジェクトが、リガンドと受容体の遺伝子シンボルを表す2つの異なる列を持つデータフレーム形式であることを確認してください（例：Zenodoから提供されているコンパイル済みのマウスネットワーク：https://zenodo.org/api/records/15168114/files/lr_network_mouse.csv/content, version v6, 2025年4月7日公開）。
    3. cluster_column = "celltype_major"を指定してexprCellCellcomを実行し、空間的に近接している細胞タイプ間の有意なリガンド・受容体相互作用を特定します。期待される出力は、リガンド・受容体ペア、ソースおよびターゲットの細胞タイプ組み合わせ、log2 fold-change値、および調整済みP値を含む結果テーブルです。視覚化のために、有意な相互作用（例：p.adj < 0.05）を保持します。

9. select spatial spotsを用いたインタラクティブなスポット選択 (6_SelectSpatialSpots.R)

  1. インタラクティブツールのためのデータを準備します。
    1. GetTissueCoordinatesを使用して、Seuratオブジェクトから空間座標を抽出します。
  2. データをフォーマットしてエクスポートします。
    1. 座標データフレームの列ヘッダーが、正確にCELL_ID, X, Yとなるようにフォーマットします。
    2. フォーマットしたデータフレームをCSVファイルにエクスポートします。
  3. 関心領域（ROI）解析を行います。
    1. カスタムのSelect Spatial Spots Dashアプリケーションを起動し、CSVファイルをロードします。
    2. 空間的な位置に基づいて、スポットをインタラクティブに選択します。
    3. 選択したスポットのリストと、割り当てられたグループ/ROIラベルを新しいCSVファイルとしてエクスポートします。期待される出力：スポット識別子、X/Y座標、および割り当てられたグループ/ROIラベルを含むCSVファイルで、これはCELL_IDによってSeuratオブジェクトと照合可能です。

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結果

ワークフローの実装とデータ統合により、組織の主要な特徴が明らかになる

解析ステージごとの期待される出力を示すために、マウス大腸の空間トランスクリプトームデータにこの計算ワークフローを適用した。ワークフローの概略図（図1）に示すように、パイプラインはデータの取得と品質管理から始まり、空間特徴プロットによって組織の境界を画定した（図2A,B）。次に、解釈可能な生物学的変動を維持しつつ技術的なバッチ効果を低減させるため、Seuratのアンカーベースの統合ワークフローを用いた。統合後のUMAP可視化により、サンプルのアライメントと空間的なクラスターパターンが示された（図2C,D）。次元削減および後続のクラスター分析を導くため、累積分散に基づく主成分（PC）の定量的かつ動的な選択を実装した（付録図1...

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ディスカッション

本プロトコルでは、解析の深度と実用的なアクセシビリティを両立させた、空間トランスクリプトームデータ解析のための包括的な計算ワークフローを提供します。ステップバイステップのアプローチにより、初期のデータ取得から高度な空間解析に至るまでの完全な解析パイプラインを研究者に提示し、同時に重要な意思決定ポイントや潜在的な落とし穴についても強調して解説します。

本プロトコルのいくつかのステップは、後続の結果に大きな影響を与えるため、特に注意が必要です。品質管理およびフィルタリングのしきい値は、特定の組織型やテクノロジープラットフォームに合わせて慎重に調整する必要があります。フィルタリングが厳しすぎると生物学的に重要なスポットが除去される可能性があり、逆にしきい値が緩すぎるとテクニカルノイズが混入する可能性があるためです。また、正規化手法の選択は、その後のクラスタリングおよび差異発現解析の結果に大きく影響します。例えば、本パイプラインでは標準的な対数正規化（log-normalization）ではなくSCTransformを使用しています。これは、SCTransformがシングルセルおよび空間解...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益がないことを宣言します。

謝辞

著者らは、Seurat、Giotto、およびSPOTlightパッケージの開発者および maintainer の皆様によるサポートとドキュメント提供に感謝いたします。また、公開データリポジトリおよび、データセットを寛容に共有してくださった研究者の皆様の貢献に深く感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ggplot2Posit Software, PBCv4.0.0(CRAN)高度なデータ可視化
GiottoDries Labv4.2.2 (GitHub)空間ネットワークおよび細胞間コミュニケーション解析
patchwork Thomas Lin Pedersenv1.3.2 (CRAN)プロットの合成および配置
R software R Foundation for Statistical Computingv4.4.3コア実行環境 (macOS aarch64)
scaterDavis McCarthy et al.v1.34.1 (Bioconductor)シングルセル品質管理および可視化
scranAaron Lun et al.v1.34.0 (Bioconductor)シングルセル分散モデリングおよびマーカー検出
Select Spatial Spots (カスタムPythonツール)LeafLightv1.0.0 (GitHub)インタラクティブな空間関心領域 (ROI) 選択 (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)
Seurat Satija Labv5.3.0 (CRAN)空間データの前処理、統合、およびクラスタリング
SeuratObject Satija Labv5.2.0 (CRAN)シングルセルおよび空間データ用データ構造
SingleCellExperimentBioconductor Core Teamv1.28.1 (Bioconductor)scRNA-seq用標準データコンテナ
SPOTlightMarc Elosua-Bayes et al.v1.10.0 (Bioconductor)リファレンスガイド付き空間デコンボリューション
StdeconvolveJean Fan Labv1.3.2 (Bioconductor)教師なし潜在トピックモデリング
tidyversePosit Software, PBCv2.0.0 (CRAN)コアデータ操作およびフォーマットスイート

参考文献

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