マウス心臓移植における急性抗体介在拒絶の確立と解析

サマリー

本研究は、心臓移植後の急性抗体介在拒絶反応の実用的なマウスモデルを確立し、強健なDSA産生、典型的な病理学的変化、中程度の同種移植生存率を特徴としました。

要約

心臓移植受容者の同種移植失敗の主な要因の一つは抗体介在拒絶反応(AMR)です。したがって、マウスAMRモデルはその基礎となるメカニズムを解明し、革新的な治療法の開発を促進するための重要なツールとして機能します。本研究では、受容マウスを3つのグループに分けました:非感作(NS)、前感作(PS)、およびシクロスポリンA処理による前感作(PS + CsA)。平均同種移植生存率6.8±0.7日を示したNS群は、心臓移植(CT)後4日以内に血清DSA値の上昇や同種移植片C4d染色の陰性が認められず、急性細胞拒絶が優勢な病理を示唆しました。この研究では、CTの1週間前に皮膚移植(ST)で受容者を前感作し、免疫系を前活性化することで急性AMRモデルを確立しました。このアプローチは重度のAMR表現型を誘発することに成功し、同種移植の生存期間が2.8 ±0.4日、ST後およびCT後のDSA-IgGレベルの有意な上昇、CT後12時間以内に血管炎の早期病理的兆候および広範なC4d沈着が示されています。しかしながら、このモデルの極めて厳しさゆえに、その広範な適用は制約されています。STによる同時期のT細胞活性化を最小限に抑え、より特異的な急性AMRモデルを確立するために、本研究ではシクロスポリンAを投与しました。その結果、PS + CsA群の同種移植生存期間は5.2±0.4日でした。血清DSA-IgG値はST後7日目には有意に上昇し、CT後5日間は高水準を維持しました。CT後2日目の病理評価では、重大な血管炎およびC4d沈着が確認され、これらは中等度重度急性AMRの診断基準に該当します。結論として、本研究はCT後の急性AMRの非常に実用的かつ翻訳可能なマウスモデルを確立し、堅牢なDSA産生、特徴的な病理学的変化、中程度の同種移植生存率を特徴としました。

概要

心臓移植(CT)は末期^心臓病のゴールドスタンダード治療法として依然として有効です。移植後の中央値生存は現在13年を超えていますが、長期的な移植片失敗は依然として避けられません^。抗体介在拒絶反応(AMR)は^CT3後の遅期移植片喪失の主な要因です。研究により、AMRによる移植片の喪失率はT細胞介在拒絶によるものを上回り、後期発症AMRの移植片失敗リスクは初期^AMRの約2倍であることが示^{されています。}したがって、早期発見と適時の介入は移植片生存率向上に不可欠です。

AMRはドナー特異的抗体(DSA)によって引き起こされ、補体活性化、血管炎症、虚血損傷を通じて移植片の失敗を引き起こします⁶。DSAが血管内皮に結合すると、内皮損傷が始まり血栓症を促進し、急性および慢性の炎症反応を引き起こします。DSA介在性損傷の主なメカニズムは補体依存性細胞毒性および抗体依存性細胞傷害経路に関わる⁷。抗C5抗体エキュリズマブやB細胞破壊剤リトキシマブなどの標的治療法は開発されていますが、末期AMRの臨床結果は依然として満足のいくものではありません^7,8,9。したがって、急性動物モデルを用いたさらなる機構的調査が、疾患の進行をより深く理解し、新たな治療標的を特定するために不可欠です。

マウスの血管化ヘテロトピCTモデルは、特に虚血再灌流損傷および拒絶反応の研究において確立されたプラットフォーム^です。移植片の機能は通常、心拍強度の毎日の腹部触診によって監視され、これは機能状態を反映し、移植片不全を定義します¹³。しかし、従来のモデルでは移植直後のAMR発症を検出できず、DSA形成を誘導し急性AMRを引き起こすために前感作が必要です。さらに、マウスの系統は免疫反応性に違いがあります。例えば、C57BL/6マウスは補体活性化が強いのに対し、BALB/cマウスはTh2偏った応答を好む^14,15。したがって、前感作戦略と受容株選択の両方がモデル性能の重要な決定要因です。

これまでの研究では、皮膚移植(ST)後の腎移植に異なるラット株を用い、AMRモデルを確立し、その特性を解析し、^{豊富な経験を}積み重ね^ました。2021年には、基礎研究のためにCTでST誘導急性AMRマウスモデルをさらに確立し、高い安定性を示し^ました。異種輸血による比較的非効率な前感作や、より複雑で時間のかかる脾臓リンパ球輸注²¹とは異なり、STは堅牢で安定、かつシンプルな感作プロトコルを提供します。このモデルは、急性AMRによる血清DSA値の上昇や観察可能な同種移植損傷の早期検出を促進し、急性AMRの介入研究に特に適しています。しかし、STによって引き起こされる急性AMRは通常重篤で、慢性損傷の進行を覆い隠すために大きな組織損傷を引き起こします。本研究は、このモードを確立するために用いられた方法論と手順の詳細な説明、モデルの免疫学的および病理学的特徴の分析、そして実践経験の要約を目的としています。

プロトコル

すべての動物実験は、広東省の実験動物管理規則、ヘルシンキ宣言、3Rs原則に厳格に従って実施されました。この実験プロトコルは広州ジェニオバイオテック有限公司委員会(承認番号JENNIO-IACUC-2024-A027)によって承認されました。オスのBalb/cおよびC57BL/6マウス(生後6〜8週、体重20〜25g)は、すべて特定の病原体フリー(SPF)グレードで、市販の供給源から入手しました。本研究で使用される試薬および装置は 材料表に詳細記載されています。

1. 動物の調理

1. SPFグレードのマウスは適切な動物施設のシステムに収容してください。
2. 図1に示されたように、マウスを3つの実験グループに分けます
   1. 非感作群(NS):CTのドナーとしてBalb/cマウス、受体としてC57BL/6マウスを使用します。
   2. 前感作群(PS):ST投与はBalb/cマウスをドナーに、C57BL/6マウスを受容者として使用し、1週間後にCTを実施。
   3. 前感作+シクロスポリンA群(PS + CsA):STの提供者としてBalb/cマウス、受容者としてC57BL/6マウスを使用し、1週間後にCTを行います。ST投与当日から、移植片失敗または移植標本採取まで、2 mg/(kg·d)のCsAを皮下注射します。

2. 術前準備

1. ドナーマウスは手術前に食事や水分を奪われないようにし、受贈マウスは8時間の空腹で水分を断ち切らない状態にしてください。
2. 麻酔
   1. 誘導のためにマウスを麻酔誘導チャンバーに入れます(イソフルラン濃度:3%-4%;流量:300-500 mL/分)(機関承認プロトコルに従って)。誘導チャンバーを振って動物が完全に麻酔されているか確認してください。
      注意:動物が横向きに寝返り、うつ伏せに戻ろうとしない場合は、完全麻酔を示しています。
   2. 手術用プラットフォームの維持濃度を調整した後、誘導室からマウスを取り出し、鼻を麻酔マスクに固定します(イソフルラン濃度:1.0%〜2.5%;流量:100-200 mL/min)、マウスが完全に麻酔されているか確認します(指で足や尾を押す。反応がなければ完全麻酔を示します)。

3. STによる プレセンシテーション(グループ2および3向け)

1. ドナー尾皮採取
   1. 麻酔を受けたドナーマウスの尾皮を75%アルコールで消毒してください。
   2. メスで尾(遠位1/3付近)を切断し、左手で鉗子で切断し、右手でメスで尾の静脈の間の皮膚を切り裂き、下の白い腱を露出させます。その後、鉗子で尾骨を固定し、曲がった鉗子で切開部の皮膚を挟み、慎重に剥がします。
   3. 剥がれた皮膚を、組織を下向きにして無菌の氷水入ったビーカーに入れます。後で使うために1.0cm×1.0cmの皮を切り取ります。
2. 受主背側ST
   1. 麻酔を受けたマウスの背中の毛をヘアクリッパーで剃り、アルコール75%で消毒し、滅菌用のカーテンを敷きます。
   2. メスで皮膚を切開し、皮膚の縁を歯付き鉗子で握り、1.0cm×1.0cmより少し大きめの皮膚をティッシュハサミで切り取り、移植床を作ります。
   3. ドナーマウスの皮膚移植片を組織側を下にして移植ベッドに置きます。移植片をトリミングした後、顕微鏡下で8-0を用いてドナー皮膚を受容者の皮膚に縫合しますナイロン糸で、ドナースキンが移植ベッドに均等に配置されるようにします。
   4. 傷口を滅菌の接着包帯で覆い、意識を取り戻したらネズミを飼育ケージに入れます。

4. CT

1. ドナー心臓採取
   1. 麻酔をかけたドナーマウスの胸部と腹部の毛をヘアクリッパーで剃り、75%アルコールで消毒し、滅菌用のカーテンを敷きます。
   2. メスで腹部の正中切開を行い、下腔静脈の上部部分を露出させ、注射器を使って50 U/mLのヘパリン化冷生食塩水1 mLを下腔静脈に注射します。
   3. ティッシュハサミを使って胸腔を開き、心臓を露出させます。上行大動脈を隔離し、最初の枝の前に切断すること;肺動脈を分離し、分岐点で横断します。下大静脈および肺門の結合組織を6-0非外傷性縫合糸で結紮し、結紮部位の遠位組織を組織ハサミで切断し、心臓を取り出します。
   4. 採取した心臓を素早く2 mLの高張性クエン酸アデニン(HCA)溶液に入れ、氷水の混合物で保存して後で使用します。頸椎脱臼法でドナーマウスを安楽死させてください。
2. 受章者CT
   1. 麻酔を受けたマウスの腹部の毛をヘアクリッパーで剃り、75%アルコールで消毒し、滅菌用のカーテンを敷きます。
   2. 歯状の鉗子で皮膚を持ち上げ、骨突起から膀胱基部まで腹部の正中線切開を組織ハサミで行います。切開部の両側に無菌で湿ったガーゼを敷いて保護します。
   3. 滅菌綿棒を使って腸のループを切開の右側に押し込み、湿ったガーゼで包みます。腹膜を鈍く解離した後、下大静脈と腹大動脈を露出させ、腰静脈を結紮し、血管クランプで大動脈と大静脈の遠位末端および近位末端への血流を止めます。
   4. 顕微鏡の下で、マイクロハサミを使って静脈壁を約2mm切り開き、ドナー心臓の肺動脈の直径に合わせて切り開きます。同様に、動脈壁を1〜2mm切開し、ドナーの上行大動脈の直径に合わせます。
   5. ドナーの心臓を取り、ドナー心臓と受け手の下腔静脈の間に12-0非外傷性縫合糸を用いてエンド・トゥ・サイド吻合を行います。同様に、ドナーの上行大動脈と受領者の腹部大動脈の間で端側吻合を行います(最後の結び目を結ぶ際は生理食塩水で内腔の空気を洗い流し、吻合時には4°Cの生理食塩水をドナー心臓表面に断続的に滴らせて冷却します)。
   6. 血管クランプを外し、心臓への血流を回復させます(冠動脈の正常な充填が確認され、心臓はピンク色に変わり、1〜2分以内に再び鼓動が始まります)。腸ループを再挿入した後、4-0ナイロン縫合糸で腹腔を閉じます。
      注意:術中出血が0.5 mLを超える場合は、液体量を維持するために皮下生理食塩水を投与してください。
   7. 術後は、マウスを37°Cの温熱プラットフォームに置いてモニタリングします。受け取ったネズミが意識を取り戻したら、再びケージに戻します。ネズミは術後、通常の食事と水分摂取を再開します。

5. 術後ケアとモニタリング

1. 一般的な条件観測
   1. 手術後のマウスの痛みの状態を毎日観察し、食欲減退、活動減少、傷口の過剰な舐めや掻き、攻撃性の増加などを確認してください。
   2. 手術後は毎日、赤み、腫れ、滲出物、膿性感染の症状を確認し、手術創を観察してください。必要に応じて、傷口を洗浄・消毒してください。
2. 心臓移植片の生存率の観察
   1. 移植された心拍の強さを確認するために、毎日の観察と触診を必ず行ってください。必要に応じて、マウスに麻酔をかけ、切開して心拍を観察します。
      注:移植された心臓の心拍が完全に停止した場合、それは移植片失敗として記録され、生存期間が記録されます。

6. 術後評価

1. DSAレベル検出
   1. NS群では、CT後の術後0日目、4日目、7日目に血液サンプルを採取し、移植後のDSAレベルを監視します。PSグループでは、ST後0日目、4日目、7日目およびCT後1日目と3日目にサンプルを採取し、前感作後のDSA動態を評価します。PS+CsA群では、ST後0日目、4日目、7日目およびCT後1日目、3日目、5日目に血液を採取し、CSAがDSAレベルに与える影響を評価します。
   2. 受給マウスの血液サンプルを遠心分離し、血清(2000 x g、10分、4°C)を採取します。血清をPBSで10回希釈し、ドナーマウスの脾臓細胞と37°Cで30分間培養します。
   3. 350 × g 、4 °Cで5分間遠心分離した後、上清液を廃棄します。細胞を1 mLのPBSで優しくピペットし、その後の遠心分離後にこの洗浄を2回繰り返します。
   4. 細胞をフルオレセイン・イソチオシアネート(FITC)抗マウスIgG抗体およびフィコエリスリン(PE)抗マウスIgM抗体で4°Cで1時間インキュベートします。
   5. PBSで細胞を洗浄した後、5 ×^{10 6} /mLの濃度に再懸浮させます。
   6. フローサイトメトリーを用いて2つの抗体を個別に検出し、平均蛍光強度(MFI)を解析して、受容マウスのDSA(IgG、IgM)レベルを評価します(パラメータ設定:解析のために10,000イベントを取得)。FSCAとSSCAでデブリを排除し、その後FSCAとFSCHゲートを適用してダブルトを除去します。負のコントロールを含め、各チャンネルの電圧を調整して負の人口を10^{0-10 1} の範囲内に配置します。
2. 心臓移植片の組織病理学的検査
   1. CT後6時間、12時間、1日、2日、3日、4日、5日にグラフトを採取してください。採取後、グラフトを4%パラホルムアルデヒドに固定し、定期的にパラフィンに埋め込み、切開し、ヘマトキシリン・エオシン(H&E)で染色します。400倍の光学顕微鏡でグラフトの病理学的変化を観察してください。
3. C4d染色
   1. パラフィンを埋め込んだ標本を4μmの区画に切り、42°Cの水で平らにし、60°Cのオーブンで30分間乾燥させます。
   2. キシレンI、キシレンII、エタノール、脱イオン水を順に使用して組織を脱硫化し、水和させます。
   3. 切片をEDTA抗原回収液に浸し、95〜100°Cで約15分間加熱し、室温まで冷却します。
   4. 切片を3%過酸化水素溶液で室温で10〜15分間培養し、内因性ペルオキシダーゼを不活性化させます。
   5. 抗C4d抗体(1:200)を抗体希釈剤で希釈し、切片と共に4°Cで一晩インキュベートします。孵化後はPBSで切面を洗い流します。
   6. 対応する二次抗体を加え、室温で30分間インキュベークした後、PBSで洗浄します。
   7. DABクロモゲン溶液を加え、室温で30秒間培養して着色します。
   8. ヘマトキシリンでカウンターステインを行い、エタノールで脱水し、キシレンに浸し、中性樹脂でマウントします。
   9. 400倍の光学顕微鏡でグラフトの染色結果を観察してください。

7. 統計解析

1. すべてのデータを提示するには平均±標準偏差を用いてください。
2. 常態分布の連続データのグループ比較には t検定 を、正規分布を守らない連続データのグループ比較にはマン・ホイットニーU検定を用います。
3. カプラン・マイヤー解析を用いて、心臓同種移植の生存期間をグループ間で比較します。
4. SPSSバージョン27.0を使ってすべてのデータを統計的に解析し、P値<0.05を統計的に有意とみなしてください。

結果

心臓同種移植の生存期間
マウスモデルの確立に成功した後、カプラン・マイヤー解析を用いてグループ間の移植片生存率を評価しました。予想通り、PS群のマウスはNS群に比べて心臓同種移植の平均生存期間が有意に短く(2.8±0.4日、±P<0.7日、P.0.01と、急性AMRに起因しました。急性AMRの治療戦略の将来評価を促進するため、同種移植の生存期間を延長し治療期間を広げるためにCsAが投与されました。結果は、PS + CsA群がPS群に比べて心臓同種移植の生存期間が有意に延長されたことが示されました(5.2±0.4日±2.80.4日、P<0.01、 図2A)。

DSAのレベル(IgGおよびIgM)
この研究では、各グループのマウス血清中のDSAレベルを定量化しました。NS群では、CT後7日目にのみDSA-IgGのMFIが有意に増加した(574.3 ± 42.72 対 410.5 ±...

ディスカッション

現在、末期AMRの治療は効果が薄く、早期診断のための信頼できる方法が不足^{しています。}このギャップを埋めるために、本研究は急性AMRマウスモデルを確立し、機構的調査を容易にしました。受験者はSTで前感作され、共生するaTCMR抑制のためにCsAを投与されました。病理学的解析では、PS+CsA群の同種移植は術後2日目には微小血管損傷やC4d沈着を含む典型的なAMR病変を発症し、DSAの著しい増加を伴いました。PS群と比較して、PS + CsA受容者は移植片生存期間が延長され、aTCMRの重症度が軽減されました。これらの発見は、再現性が高く特異的な急性AMRモデルの確立に成功したことを裏付け、将来の機構的および治療的研究のための実践的な基盤を提供します。

マウスCTモ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗C4Dモノクローナル抗体	ハイカルト・バイオテック(オランダ)	HP8034	免疫組織化学(補体沈着の検出)について
顕微外科器具の完全なセット	広州啓華医療機器有限公司		マウス心臓移植手術の実施に使用
連続ズーム立体外科顕微鏡	北京中天広正科技有限公司	TS-39NK	マウス心臓移植手術の実施に使用
シクロスポリンA	ノバルティス・ファーマシューティカルズ(スイス)	H20100673	受容マウスのTCMR阻害に使用
FITC 抗マウスIgG抗体	バイオ・レジェンド(アメリカ)	406001	DSA-IgGレベルのフローサイトメトリクス定量に使用
フローサイトメーター	ベクトン・ディキンソン、アメリカ合衆国	BD FACScalibur	受容マウスの血清DSAレベル評価に使用されます
PE抗マウスIgM抗体	バイオ・レジェンド(アメリカ)	406507	DSA-IgMレベルのフローサイトメトリクス定量に使用
小動物ガス麻酔システム	安徽正華生物計器機器有限公司	ZH-MZJ	全身麻酔用のイソフルランを装備
血管ブルドッグクランプ	ロボズ外科機器会社	RS-5481T	心臓移植中の血流を遮断するために使われます