本プロトコルは、非炎症条件下で pks+大腸菌 をマウスに定着させるために必要な手順と、便中での pks+大腸菌 の拡大の定着と評価のための非侵襲的手法を説明しています。
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この記事について
サマリー
要約
pks+大腸菌は、特に早期発症の若年患者の急速に増加する中で、大腸がん(CRC)の発症にますます関与していることが示されています。pks+大腸菌株はジェノトキシン・コリバクチンを産生し、これはCRCに関連する二本鎖DNA断裂や細胞増殖・分化経路の変異を引き起こすことが知られています。本記事では、マウスにおける非炎症条件下でのpks+大腸菌の定着方法について、細菌接種の調製から定着の検証まで詳述しています。一晩の潜伏後、pks+大腸菌株のE. coli NC101を抗生物質で調整されたマウスに経口ガベージで投与します。便中コロニゼーションは、乳糖発酵グラム陰性コロニー形成単位(CFU)の数を定量化し、定量的なPCR増幅によって評価されます。このプロトコルを用いて、C57BL/6マウスにE. coli NC101を成功させた後、食物繊維イヌリンの補給がPKS+大腸菌の増殖を促進し、CFUの回復増加、腸内細菌科の増加、clbPレベルの増加を反映することが示されましたジーン。まとめると、このモデルはCRCの発生に関与する主要な病原体を標的とした予防的および治療的治療の研究を可能にします。
概要
腸内細菌叢は宿主の健康や疾患に重要な役割を果たすことが知られており、腸内微生物の不安定、すなわち特定の潜在的に病原性細菌(病原性細菌)の過剰増殖は、心血管疾患、炎症性腸疾患(IBD)、がんを含むいくつかの疾患状態の特徴として知られています。pks+大腸菌は、IBD2および大腸がん(CRC)患者の大腸組織サンプルで健康な個人と比較して濃縮される病原体です。pks+大腸菌の腫瘍促進活性は、ポリケチド合成酵素(pks)遺伝子クラスターの発現およびジェノトキシン・コリバクチン4の産生に関連しています。コリバクチンは大腸上皮細胞の核に転座し、二本鎖DNA断裂5の形成とCRC関連経路6の変異を引き起こします。pks+大腸菌の定着は、大腸炎関連CRC(CAC)の前臨床モデルにおいて、腫瘍の開始7および腫瘍進行3に寄与することが示されています。最近では、コリバクチン誘発変異誘発が早期発症CRC 8,9と関連しています。50歳未満の若年層に発症する早期発症CRCの発生率は近年増加しており、現在のCRC率全体の減少を逆転させる可能性があります。
pks+大腸菌がCRCの発生や宿主の健康の他の微生物介在性側面に果たす役割は、引き続き解明されています。さらに、炎症10、ルミナール鉄濃度11、食事因子12,13など、いくつかの要因がpks遺伝子発現に影響を与えることが示されており、微生物叢標的介入の道が開かれています。ここでは、マウスにおけるpks+大腸菌株NC101(大腸菌NC101)のマウス株を用いた経口口漏りによる腸定殖法の方法を説明しています。他のモデルでは、口腔ガベージおよび直腸綿棒採取で単一定着した無菌(GF)マウスの炎症および発がんに対するE. coli NC101の効果を評価しています。3、遺伝的感受性(IL-10-/-)大腸炎モデル3,14、化学的に誘発された大腸炎症および腸関壁破壊モデル15。しかし、pks+大腸菌によるコスト効率の高い定着は、抗生物質で事前処理された特定の病原体フリー(SPF)マウスにおいても非炎症条件下で得られ、定着と拡大のためのニッチを作ることができます14,16,17。マウス糞便中のpks+大腸菌の検出および定量方法も提示されており、clbP遺伝子の定量的PCR(qPCR)増幅、腸内細菌科の存在比のqPCR評価、グラム陰性乳糖発酵菌特異的なMacConkey寒天培地上のコロニー形成単位(CFU)の回収などが含まれます。これらの方法は、pks+大腸菌の存在とコリバチン産生の検証や、細菌叢標的介入に対するpks+大腸菌増殖の違いを評価するために、互換または併用して使用されることがあります。
本プロトコルは、食物繊維イヌリンが pks+大腸菌 の定着および拡大、qPCRによるCFUの回復に与える影響を評価するために用いられます。イヌリンは腸内で有益な ビフィドバクテリウム および ラクトバチルス 種の増殖を促進することが示されたプレバイオティクスであり、腸の恒常性に重要な役割を果たす短鎖脂肪酸の産生も増加することが示されています。しかし、イヌリンは PKS+大腸菌 の増殖やコリバチン産生を促進することも示されており、DSS治療されたアデノマ性大腸ポリー症(Apc)Min/+ CRCモデルでは腫瘍形成の増加につながっています。本実験は、炎症や腸管障壁の障害なしにマウスモデルで食事イヌリンに反応した pks+大腸菌 の拡大を評価する。
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プロトコル
すべての処置は、モントリオール大学病院センター(CRCHUM)の施設動物ケア委員会の承認を得て、カナダ動物ケア協議会のガイドラインに従って実施されました。7週間齢のマウスを市販の供給元から入手し、実験開始の1週間前に順応させました。この方法の回路図は 図1に示されています。本研究で使用された動物、試薬、機器の詳細は 材料表に記載されています。
図1: pks+大腸菌 の調製および定着の概説。 4日目(D)-4:ガベージの4日前に抗生物質をマウスに投与開始。D-1:ガヴェージの24時間前に抗生物質を除去。 pks+大腸菌 培養を準備し、一晩の潜伏させてください。D0: pks+大腸菌 接種を準備します。接種後、できるだけ早くマウスに pks+大腸菌 またはビークルコントロール(生理食塩水)を経口ガベージ で 投与してください。D7+ マウスの糞便を採取し、 pks+大腸菌 の定着を検出・定量します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
1. 抗生物質治療
- アンピシリン、コリスチン、ストレプトマイシンを滅菌飲料水中で希釈し、最終濃度をアンピシリン1 mg/mL、コリスチン 1 mg/mL、ストレプトマイシン 5 mg/mL にします。
- 3日間、 飲料 水中の抗生物質を自由に使用してください。
- 抗生物質を除去し、大 腸菌 NC101接種剤で24時間の洗浄期間を経て無菌水へのアクセスを回復します。
注意:抗生物質溶液は各実験ごとに新鮮に準備してください。抗生物質溶液の適切な摂取量は必ず監視してください。必要に応じて、甘味料を加えることもあります。
2. 大腸菌 NC101接種源の調製(最大n=12匹のマウス)
注意:ステップ2.1から2.8は無菌技術で実施してください。
- 溶菌ブロス(LB)を準備し、オートクレーブ処理します。
- グリセロールストックからLB寒天プレートに無菌接種ループを用いてストリーク 大腸 菌NC101。37°Cで一晩抱卵します。
- 無菌LBブロス5mLを、LB寒天プレートからの単一コロニーを接種ループで培養管内に接種します。37°Cで150rpmのベンチトップインキュベーションシェーカーで一晩培養します。
- 培養チューブを1500 x g で室温で5分間遠心分離します。
- 上澄液を取り除き捨て、チューブの根元に淡白な沈着物として現れる細菌ペレットは避けてください。
- 細菌ペレットを0.9%滅菌生理食塩水5mLに再懸浮させます。
- 洗うときは、4から6までの手順を繰り返します。
- セル密度計を使って600nm(OD600)の光学密度を測定し、滅菌生理食塩水を使ってOD600 を0.625(~1 x 108 CFU/マウス)に調整します。
注意:ステップ3でブロスに細菌汚染が入らないように、2〜3mLの無菌LBブロスを別管で一晩培養してください。一晩の培養後もスープは透明なままで、細菌汚染がないことが示されます。開始時OD600 が0.625未満の場合は、4から6までのステップを繰り返し、より小さな体積でペレットを再懸浮させます。大 腸菌 NC101の正確な用量を確保するために、ガベージ液の連続希釈を一晩かけてプレート付け・培養する必要があります。各希釈に対するCFUの数は、細菌懸濁液中の初期CFU量を推定するために用いられます。
3. 大 腸菌 の経口ガヴェージ NC101
- 細菌接種物を優しくかき混ぜて、均等に分布させてください。
- ガベージ針を1 mLの注射器に装着し、0.2 mLの細菌接種液を充填して気泡を取り除きます。
- ネズミをケージから外し、親指と人差し指の側面で耳の後ろから肩甲骨までの皮膚を優しく、しかししっかりと掴みます。同じ手の中指か薬指で尾を固定します。
- マウスを直立させ、ガベージ針を口の側面に差し込みます。ガベージ針の先端を口の天井に沿って滑らせ、食道と胃に入り、ネズミの頭を優しく押し戻して首を伸ばします。抵抗を感じたら、ガベージ針を外してください。必要ならマウスをもう一度スクラフ(爪)にし直してから再挑戦してください。
- 細菌接種剤(0.2 mL)をゆっくりと注射し、針を挿入時と同じ角度で引き抜きます。
- ネズミをケージに戻し、残りのネズミを処理します。
注意:細菌接種は、調製後できるだけ早く投与されるべきです。対照マウスには0.9%滅菌生理食塩水(車両)を0.2mL投与してください。ガベージ針の長さ、ゲージ、球状の直径は、各実験におけるマウスの平均体重に基づいて決定すべきです。5分後から動物施設を出る前に、マウスの呼吸パターンや活動を確認しましょう。呼吸困難や呼吸困難が観察された場合は、承認されたプロトコルに従って安楽死させてください。経口ガベージは訓練を受けた研究スタッフのみが行うべきです。口腔ガベージの誤投与は、食道穿孔や肺への注射による深刻な合併症や死亡につながる可能性があります。経験豊富な研究スタッフによる実施では、この手術による死亡は期待されません。この実験に使われたマウスはSPF条件下で飼育されるべきです。ケージ間の汚染を防ぐためには、個別に換気されたケージを使用し、ネズミは生物学的安全キャビネット内で操作する必要があります。ケージを開ける前に、手とケージの蓋の外側を適切な消毒剤(例:加速過酸化水素)で拭く必要があります。このプロトコルで使用されるマウス操作のためのPPE要件には、ガウン(使い捨てまたは再利用可能)と手袋が含まれます。ホストアニマル施設から追加のPPEが求められることもあります。コントロールマウスを含むすべての操作はまず行うべきです。
4. 糞便サンプルの採取
- ステップ3.3で説明した通り、1.5mLのマイクロ遠心管でマウスの糞便ペレットを採取します。ネズミはすぐに排泄するはずです。あるいは、ネズミをきれいで空のケージに入れて、最大30分ほど離脱を待つ方法もあります。
- 液体窒素にチューブを入れてサンプルをスナップフリーズします。サンプルは-80°Cで保存し、さらなる分析まで待ちます。
注意:実験開始前に、マウスにpks+大腸菌が感染していないかを確認するために、便中のclbAの検出またはclbPのリアルタイムPCR定量を行うべきです。1週間以上定着を維持するためには、実験条件によっては抗生物質の事前投与なしに再発性細菌ガベージ(ステップ2.1〜3.6)が必要になる場合があります。このプロトコルを初めて実施する際は、投与頻度を最適化するために、CFU回収またはリアルタイムPCRによる便中の大腸菌NC101の定量化を少なくとも週に一度行うべきです。
5. 糞便細菌DNA抽出
- 製造元の指示に従い、DNA抽出キットを使って採取した便サンプルから細菌DNAを抽出してください。
- 分光光度計でDNA濃度を測定し、5 ng/μLに調整します。
6. clbA および 大腸菌 16S遺伝子の検出による定着の確認
- 製造元の指示に従い、適切なマスターミックスとPCR用機器を用いて、 clbA および大 腸菌 16SリボソームRNA(rRNA)遺伝子(補足表1)をPCRで同時に増幅します。
- 以前に述べたように、アガロースゲル電気泳動により大腸菌NC101に定着したマウスのclbAおよび大腸菌16S遺伝子を可視化します19。非定着マウスはclbAバンドを欠くはずです。
7. CFU回収による 大腸菌 NC101の定量化
注意:無菌技術を用いて7.1-7.7のステップを実行してください。
- 空の1.5mLマイクロ遠心分離機チューブを重くします。
- 1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに約20mgの便を加え、追加したサンプルのチューブの重さを記録します。
- 各チューブに0.9%滅菌生理食塩水200μLを加えます。
- 室温で便が柔らかくなるまで10〜15分待ち、各管を最大速度で5分間渦巻きして均一な懸液を作ります。未消化の食品の小さな粒子が見えます。
- 各懸濁液を100μLをマッコンキー寒天プレートに移し、L字型スプレッダーで均等に均等に広げます。
- プレートは37°Cで一晩孵化します。
- ピンクコロニーの数を数え、各糞便ペレットの重さとプレートされた体積で正規化します。
注:マッコンキー寒天はグラム陰性菌を選択します。さらに、乳糖を発酵させることができる細菌(大 腸菌など)はピンク色のコロニーを形成し、発酵できない細菌は無色または黄色のカラーを形成します。このプロトコルではピンクコロニーのみをカウントすべきです。コロニー数が数えられない場合は、0.9%の無菌生理食塩水を用いて初期均質酸の連続希釈を行うことがあります。サンプルあたりのコロニー数を計算する際は希釈係数を考慮してください。
ペレット重量 = ペレットサンプルを含むマイクロ遠心分離機チューブの重量 - 空のマイクロ遠心分離機チューブの重量。
8. clbP 遺伝子の定量化
- clbPおよびユニバーサル16S rRNA遺伝子(補足表1)を、製造元の指示に従い適切なマスターミックスと機器を用いて定量PCRでリアルタイムPCRを行います。
9. 腸内細菌科の定量化
- 適切なマスターミックスと機器を用いて定量PCRを用いて 腸細菌科 および汎用16S RNA遺伝子(補助)を増幅し、リアルタイムPCRを行います。
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結果
エンドポイントの便中のclbAおよび大腸菌16S遺伝子の増幅と可視化は、PCRおよびゲル電気泳動による結果、NC101定型マウスでは両遺伝子が確認される一方、対照マウスでは大腸菌16S遺伝子のみが確認され、大腸菌NC101は存在しないことが確認されました(図2B)。
予想通り、イヌリンを補給した食事を受けた15隻の大腸菌NC101コロニーマウスは、マッコンキー寒天上での便均質菌のCFU回復率向上(図2C)、clbP遺伝子の増加(図2D)、腸細菌科の個体数増加により、1週間後に大腸菌NC101の増殖が認められました(
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ディスカッション
コリバクチン産生のpks+大腸菌の促進発がん効果は、近年、早期発症型CRC9の増加や「西洋式」食事法12の採用と関連しており、これらは今後数十年にわたりCRCの傾向を形作り続ける要因です。pks+大腸菌の定着モデルの多くは大腸炎関連がんの文脈で示されており、非炎症状態下でのpks+大腸菌の特徴付けは認められていません。本プロトコルは、マウスにおけるpks+大腸菌定殖法を記述しており、CRCの発生および治療抵抗性に関与する病原体を含む宿主と微生物叢の相互作用の研究や、この細菌の有害影響を緩和することに焦点を当てた標的マイクロバイオータ修飾治療戦略の探求を可能にします20,21。
このプロトコル全体を通じて、すべてのグループで最適な
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開示事項
著者には利益相反を主張するものはありません。
謝辞
この研究はカナダ健康研究所(CIHR、助成金CSV-198232)からの助成金によって資金提供されました。CRCHUMの動物施設に感謝します。フィギュアは BioRender.com を用いて作成されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.9%無菌生理食塩水 | バクスター | JF7634 | |
| 10%イヌリンカスタムダイエット | テクラッド | TD.240286 | 代表選挙結果 |
| 50 ppm FeS04(無繊維)カスタムダイエット | テクラッド | TD.120515 | 代表選挙結果 |
| 生後8〜12週のメスのB6マウス | チャールズリバー研究所 | C57BL/6 | 代表的な結果 |
| アンピシリン、ナトリウム塩、nbsp; | ワイセント社 | 400-110 XG | |
| ベンチトップ遠心分離機 | フィッシャー・サイエンティフィック | 75004381 | |
| セル密度計 | バイオクロム | 80-2116-30 | |
| 培養チューブ、13mL | サーステット | 62.515.006 | |
| EcNC101 | 該当なし | 該当なし | ノースカロライナ大学チャペルヒル校のクリスチャン・ジョビン博士から寄贈されました。 |
| ガベージ針、38mm x 22 G | ハーバード・アパラタス・カナダ | 34-024 | 現在は利用できません - 代替案としてInstech Labs(FTP-22-38)で入手可能です。 |
| インキュベーティング軌道シェーカー | VWR | 980153 | |
| 接種ループ | フィッシャー・サイエンティフィック | 22-363-595 | |
| L字型スプレッダー | フィッシャー・サイエンティフィック | 14-665-230 | |
| 溶原性ブロス | ワイセント社 | 800-060 LG | 粉末35g、水1Lを加えます。使用前にオートクレーブ消毒してください。 |
| 溶原性ブロス寒天; | ワイセント社 | 800-011 LG | 粉末35g、水1Lを加えます。使用前にオートクレーブ消毒してください。 |
| マッコンキー寒天 | ベクトン・ディキンソン | 211387 | マッコンキーパウダー50gを1Lの水に加えます。使用前にオートクレーブ消毒。nbsp; |
| 微生物DNA抽出キット | キアゲン | 47016 | |
| 微生物インキュベーター | フィッシャー・サイエンティフィック | 150152633 | |
| マイクロ遠心分離チューブ、1.5mL | アルティデント・サイエンティフィック | 73-M150-C | |
| PCRローター - 遺伝子ストリップチューブ | アルティデント・サイエンティフィック | 73-V100-RG | |
| ペトリ皿 | サーステット | 82.1472.001 | |
| リアルタイムPCR SYBRグリーンマスターミックス | ThermoFisher | A25742 | |
| リアルタイムPCRサーマルサイクラー | コルベット研究 | RG-3000A | |
| スクリューキャップチューブ、15mL | サーステット | 62.554.502 | |
| ナトリウム・コリスタイム | フレゼニウス・カビ | C309306 | |
| ストレプトマイシン硫酸塩 | ミリポール・シグマ | S9137 | |
| ツベルクリンスリップチューブ、1mL | ベクトン・ディキンソン | 309659 | |
| 渦 | フィッシャー・サイエンティフィック | 12-812 |
参考文献
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