本研究では、16S rRNAシーケンシングを用いて、健康な対照群、未治療のPD患者、ピリベジル治療を受けたPD患者の腸内細菌叢を比較し、ピリベジル治療に関連する微生物組成の違いを特定しました。
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本研究では、16S rRNAシーケンシングを用いて、健康な対照群、未治療のPD患者、ピリベジル治療を受けたPD患者の腸内細菌叢を比較し、ピリベジル治療に関連する微生物組成の違いを特定しました。
本研究は、ピリベジル療法がパーキンソン病(PD)患者の腸内細菌叢を変化させるかどうかを明らかにし、ピリベジルによる腸内細菌叢の変化とその臨床的意味を理解するための理論的参考資料を提供することを目指しました。糞便サンプルは16SリボソームRNA(16S rRNA)遺伝子シーケンシングを用いて分析されました。ピリベジルを服用したPD患者(ピリベジル群)、ピリベジルを服用しなかったPD患者(PD群)、および健康な対照群(空白群)を比較しました。空白群と比較して、ブ ドウ球菌、ロドコッカス属、その他の属の相対的な存在比はPD群で高かったのに対し、 アクロモバクター と デルフティア 属の相対的存在比は低かった。さらに、 アクロモバクター、デルフティア 、 ステノトロフォモナスの 相対的な個体数はピリベディル群でPD群より高く、一方で ブドウ球菌、ロドコッカス 、その他の種の相対的個体数は低かった。健康な個人と比較して、PD患者の腸内細菌叢に有意な変化が見られました。ピリベジルを服用している患者の腸内細菌叢は、未治療の患者と有意に異なります。これらの結果は、パウキン病患者におけるピリベジルと腸内細菌叢の変化との関連を示唆しています。
パーキンソン病(PD)の発症率は徐々に増加しています。しかし、その病因や病因はまだ完全には解明されていません。さらに多くの研究で、腸内細菌叢はパーキンソン病の発症や発症と密接に関連していることが示されています。彼ら1は、PD患者の腸内細菌叢構成が健康な人と異なり、腸内病原体の増加がPD発症と関連している可能性があることを記録しました。Scheperansら2は、PD患者の腸内におけるプレボテラおよびバクテロイデスの相対的な存在量が減少していることを確認しました。 そしてこれらの細菌属は腸の関門機能と強く関連していることが示されています。
腸内細菌叢とパーキンソン病の関連を調査した研究がいくつかあります。研究によれば、ディスバイオシスはPDの病態生理に重要な役割を果たし、炎症や代謝障害を含む複数のメカニズムを通じて運動・非運動症状に影響を与える可能性があります。さらに、PDの薬物治療は腸内マイクロバイオームの組成を変化させることが示されており、薬剤と腸内細菌叢の複雑な相互作用が強調されています。
非選択的ドーパミン受容体作動薬として、ピリベジルはパーキンソン病の管理に重要な役割を果たします。ドーパミン受容体を刺激することで患者の運動症状を改善することができます。しかし、臨床的使用はしばしば副作用、特に吐き気、嘔吐、腹痛などの消化器症状によって制限されます。これらの副作用の根本的なメカニズムは不明であり、ピリベジルによる腸内細菌叢の変化と関連しているかどうかはまだ不明です。
腸内細菌叢と有害薬物反応の関連は近年、ますます注目を集めています。Hill-BurnsらはPD患者の腸内細菌叢を解析し、腸内細菌叢の多様性が薬物療法への反応と関連していることを発見しました。さらに、ドーパミン作動薬は腸の運動性や微生物組成に影響を与える可能性があります。これらの変化のメカニズムは腸内輸送タイミングの変化に関わると考えられており、それが微生物の多様性や個体数に影響を与えます。さらに、腸内細菌叢は薬物の吸収や代謝に影響を与え、これらの薬剤の効果や副作用に影響を与えます。しかし、パーキンソン病によく使われる薬剤であるピリベジルが腸内細菌叢の構造を調節するかどうか、またそのような微生物シフトと消化管への副作用との関連について、依然として体系的な研究は不足しています。
本研究では、健康な対照群、未治療のPD患者、ピリベジル治療を受けたPD患者の腸内細菌叢構造を比較しました。我々は、ピリベジル治療がPD患者の腸内細菌叢の構成に明確な変化をもたらし、これらの微生物変化がピリベジル関連の消化管副作用と関連している可能性があると仮説を立てました。ピリベジルに関連する特定の微生物変異を特定し、それらが消化器系の副作用と関連する可能性を探ることで、ピリベジル関連の副作用のメカニズムを理解するための理論的基盤を提供することを目指しました。
腸内細菌叢はPD11の病因の研究において重要な方向性です。本研究は、PD患者の腸内細菌叢に対するピリベジルの影響を観察することで、薬物関連腸内細菌叢の変化の臨床的意義を明確にし、ピリベジルの臨床使用および安全性管理の最適化のための参考資料を提供します。
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本研究は安徽中国医薬大学第一附属病院倫理委員会によって審査されました(倫理審査番号:2025AH-101、倫理承認日:2025-07-02)。
研究対象
安徽中国医学大学第一附属病院のPD患者かつ健康な対照群患者が登録されました。追跡分析のために新鮮な糞便サンプルが採取されました。新鮮な糞便サンプルを採取し、無菌のEPチューブに移し、直ちに液体窒素で速凍し、その後-80°Cで長期保存されました。パーキンソン病患者の対象基準は以下の通りです:(1) 臨床的に診断されたパーキンソン病;(2) 年齢>70歳;(3) ピリベジル群:登録後にピリベジル単独療法を開始し、この薬剤への事前曝露はなかった;パーキンソン病群については、抗パーキンソン病薬による治療を受けていないこと;(4) 重篤な心臓病、肝疾患、腎臓病、がんなどの他の重篤な全身疾患がないこと。登録前に、各参加者から書面によるインフォームドコンセントが取得されました。除外基準は以下の通りです:(1) 重度の運動障害などの重度のPD合併症;(2) 最近抗生物質治療を受けたこと;(3) 炎症性腸疾患、過敏性腸症候群など、研究結果に影響を与える可能性のある他の健康状態の存在;(4) ピリベディルにアレルギーがある。健康な対照群(ブランクグループ)は、神経系または主要な消化器系疾患の既往がない年齢相性(>70歳)の個人でした。
すべての参加者は登録前に通常の食事習慣を維持することが求められました。プロバイオティクス、プレバイオティクス、食物繊維サプリメント、その他の栄養補助を受けていない人はいませんでした。さらに、すべての参加者はサンプル採取の少なくとも3か月前、抗生物質治療を受けていませんでした。研究中には標準化された食事介入は行われませんでしたが、すべての参加者に腸内細菌叢への潜在的な交絡影響を最小限に抑えるため、安定した生活習慣と食事を維持するよう指示されました。
研究グループ
本研究コホートは3つのグループに分けられました:PD群(n = 10):抗パーキンソン病薬を服用していない患者から採取した糞便サンプル。ピリベジル群(n=10):パーキンソン病患者からピリベジル(50mg、1日2回)治療を21日連続で行った後に採取した糞便サンプル。ブランク対照群(n=5):健康な個人から採取した糞便サンプル。
16SリボソームRNAシーケンス
シーケンスは他の研究で報告されているように、シーケンスプラットフォーム上で行われました。簡単に言えば、糞便標本から全微生物DNAが、ドーデシル硫酸ナトリウム(SDS)法を用いて分離されました。抽出されたDNAの完全性は1%アガロースゲル電気泳動で検証され、DNA濃度と純度は分光光度計で測定されました。細菌の16S rRNA遺伝子の超可変領域V3-V4は、変性プライマー341F(5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3')および806R(5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3')を用いてゲノムDNAから増幅され、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)熱サイクル装置を用いました。細菌の16S rRNA遺伝子の増幅は以下の熱条件下で行われました。94°Cで2分間の初期前変性ステップ、その後94°C変性30秒、55°Cのアニーリング30秒、72°Cの伸長30秒の28サイクル。最後の延長は72°Cで10分間行われ、その後反応は4°Cで維持されました。 PCR混合物には2×PCRマスターミックス25 μL、順方向プライマー(10 μM)2 μL、逆プライマー(10 μM)2 μL、テンプレートDNA10 ng、そして最後にddH2Oから50 μLまでが含まれています。PCR反応は三回ずつ行われました。PCR混合物には2×PCRマスターミックス25 μL、前方向プライマー(10 μM)2 μL、逆プライマー(10 μM)2 μL、テンプレートDNA10 ng、そして最後にddH2Oから50 μLまでが含まれます。PCR反応は三回ずつ行われました。PCR産物は2%アガロースゲルから抽出され、ゲル抽出キットで精製されました。MGI V2用のUniversal Plus DNA Library Prep Kitがライブラリ構築に使用されました:(1) Splinter Link;(2) 磁気ビードスクリーンを用いて接合部の自己接合セグメントを除去する;(3) PCR増幅によるライブラリテンプレートの濃縮;(4) PCR産物を回収するための磁性ビーズ;(5) PCR産物の環化。ライブラリ検証の後、シーケンスが行われました。
品質チェックポイント:チェックポイント1(サンプル採取):サンプルは採取直後に速凍され、−80°Cで保存されました。 解凍や汚染の兆候が目に見えるサンプルはすべて廃棄されました。チェックポイント2(DNA抽出):許容純度:A260/A280 = 1.8–2.0、A260/A230 ≥1.8;完全性は1%アガロースゲル上の高分子量バンドのみで検証されました。チェックポイント3(PCR増幅):2%アガロースゲルに~460bpの単一バンドが増幅成功を示します(プライマー341F/806R、V3-V4領域);もし存在しないか非特異的であれば、アニーリング温度やテンプレート濃度を調整します。ライブラリーの調製には回収濃度≥0.5 ng/μlが必要でした。チェックポイント4(ライブラリの準備およびシーケンス):シーケンス施設が標準検証済みプロトコルに従って実施します。追加の社内チェックポイント(例:バイオアナライザーのサイズ設定)は適用されませんでした。
安全性と廃棄物処理:すべてのサンプル取り扱い時は手袋と白衣を着用しました。作業面は70%エタノールで清掃されました。すべての汚染消耗品(チップ、チューブ、ジェル)は、バイオハザード廃棄物として処分する前に、121°Cで20分のオートクレーブ処理が行われました。
バイオインフォマティクス
16S rRNA遺伝子の生シーケンスリードはまず脱多重化され、fastp(バージョン0.20.0)による高品質フィルタリングを受け、標準化されたスクリーニング基準のもとFLASH(バージョン1.2.11)で組み立てられました。簡単に言うと、(i) 生の300 bpシーケンスは、平均品質スコアが50 bpのスライディングウィンドウ内で20を下回った場合にトリミングされました。50 bp未満の切断されたリードや、塩基が曖昧なリードは除去されました。(ii) 配列アセンブリは10 bpを超える重なりに対してのみ実施され、重なり領域の最大ミスマッチ率は0.2に設定されました。組み立てられなかったペアリングされていないリードは除外されました。(iii) 個々のサンプルはバーコードおよびプライマーの配列に基づいて分割され、その後の向き調整が行われました。バーコードマッチングは正確なアライメントで行われ、プライマーマッチングは最大2つのヌクレオチドミスマッチを許容しました。16S rRNAリードはQuantitative Insights into Microbial Ecology(QIIME)パイプライン(バージョン1.8.0)を用いて解析されました17。タグシーケンスはFLASH(バージョン1.2.11)を用いてペアエンド読み取りに付加されました。トリミングはUPARSE(バージョン7.0.1090)を用いて最小長さ200 bp、平均品質25で行われ、その後97%のカットオフでクラスタリングして運用分類単位(OTU)を生成しました19。代表的なOTUリードはRDP Classifier 2.2によって分類され、信頼区間≥0.6でした。タグおよびリードの存在比はUSEARCHグローバル20を用いて比較して算出されました。キメラ配列の同定は、UCHIME(v4.2.40)21を用いたGoldデータベースとの比較に基づいて行われました。その後、Bray–Curtis不適合に基づくスパースデータセットに対して主座標解析(PCoA)を実施し、クラスタリングの配列類似度閾値を97%に設定しました。代表的なOTUおよび対応する分類学的プロファイルは、Rソフトウェア(バージョン3.1.1)を用いてさらに解析されました。線形判別解析効果サイズ(LEfSe)アルゴリズムは、線形判別解析(LDA)効果サイズに基づくもので、OTUレベルで有意な差異存在比を持つバイオマーカーをスクリーニングするために適用されました。この方法は、まずグループ間で一貫した差異を持つ特徴を特定し(複数グループ比較にKruskal-Wallis検定を用い)、その後LDAを用いて各差異豊富特徴の効果量を推定することで、統計的有意性と生物学的関連性の両方を強調します。LDAスコア>2.0は有意に存在比の増加と定義されます。
統計手法
統計解析はSPSSを用いて実施されました。正規分布データは一方向分散解析(ANOVA)を用いて解析されました。正規分布に従わないデータはウィルコクソン順位和検定を用いて解析されました。すべての定量データは正規分布に従うパラメータの平均±標準誤差(SE)として表現され、正規分布でないデータは四分位範囲の中央値として示されました。p値<0.05は統計的に有意とされました。
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ピリベジル治療に関連する微生物多様性の違い
DNA抽出の品質管理結果(濃度範囲、純度)は 補足表1に示されています。PCR増幅の品質管理(バンドサイズ、回収濃度)は 補足表2に示されています。シーケンス品質管理指標(リードカウント、深さ、カバレッジ)は 補足表3に詳述されています。ACE、Chao1、InvSimpson、Shannon、Simpsonの各指標を用いて糞便サンプル中の腸内細菌叢を解析しました。ACEおよびChao1指数の結果は、ブランク群とPD群の間で腸内細菌叢の多様性に有意な差は見られませんでした。しかし、InvSimpson、Shannon、Simpsonの各指標の結果は、ブランク群の腸内細菌叢の多様性がPD群よりも有意に低いことが示されました(図1A)。PD群とピリベディル群(図1B
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パーキンソン病は、世界で2番目に多い神経変性疾患であり、アルツハイマー病に次ぐ23番目です。1970年以降、ピリベジルはドーパミン受容体作動薬としてPD24の治療に広く用いられています。しかし臨床では、ピリベジルは吐き気、嘔吐、消化器の不快感などの副作用を引き起こすことがあります。パーキンソン病の発症やドーパミン受容体作動薬による治療的介入が、腸内微生物群集のプロファイルを再構築できることが研究が進んでいます。
微生物叢の分析を成功させるには、いくつかの重要なステップが不可欠です。細菌の過剰増殖を防ぐために糞便サンプルを即時(30分以内)凍結すること;SDS法を用いた一貫したDNA抽出;厳格なPCR品質管理(2%アガロースゲルに単一~460塩基帯のチェック)、およびDNA純度の検証(A260/A280 1.8–2.0、A260/A230 ≥1.8)などです。PCRでバンドが得られない場合は、DNA純度を確認したり、アニー...
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著者たちは、競合する利害は存在しないと述べています。
本研究は、安徽省学術リーダー候補者資金プロジェクト(番号2022H287)、安徽省衛生衛生優秀人材プロジェクト(番号:ahsjhmypygc20230074)、安徽省伝統中医遺伝と革新に関する科学研究プロジェクト(2025CCCX017)、および安徽中医科大学基礎臨床統合特別プロジェクト(JCLCA2025009)の支援を受けました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2×反応バッファー（Taq MasterMix） | 康威 | CW0690 | |
| アガロース | （一般） | 該当なし | 分子生物学グレード |
| AxyPrep DNA Gel抽出キット | Axygen Biosciences | （提供されていません） | |
| 卓上高速冷凍遠心機 | Hunan Kosei | GTR116C | |
| DNA抽出試薬（SDS、フェノール、クロロホルム、エタノール） | （一般） | 該当なし | |
| DNBSEQ-G99 PE300シーケンシングプラットフォーム | MGI Tech Co., Ltd | DNBSEQ-G99 | |
| ゲル電気泳動装置 | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| ゲルイメージングシステム | Shanghai Jiapeng | JP-2880 | |
| LEfSeソフトウェア | （オープンソース） | オンライン版 | |
| NanoDrop分光光度計 | Hangzhou Haipe | Aurora-900 | |
| PCRマシン | Hangzhou Langji | A200 | |
| ピリベジル | Servier | 6094078 | |
| プライマー：341Fと806R（合成） | （カスタム合成） | 該当なし | |
| QIIMEソフトウェア | （オープンソース） | http://qiime.org | バージョン1.8.0 |
| Quantusフローロメーター | Promega | E6150 | |
| Qubit 4.0フローロメーター | Invitrogen | Q33226 | |
| SDS（ドデシル硫酸ナトリウム） | （一般） | 該当なし | |
| UPARSEソフトウェア | （オープンソース） | http://drive5.com/uparse | バージョン7.0.1090 |
| VAHTS Universal Plus DNA Library Prepキットfor MGI V2 | Vazyme | NDM627-01 |