遺伝子送達の強化を目的とした間葉幹細胞膜包覆ナノ小胞の開発

サマリー

本プロトコルは、遺伝子治療のために間葉系幹細胞(MSC)由来の細胞外小胞バイオミメティクスを製造・精製する方法を導入することを目的としています。ナノ小胞はMSC由来の脂質二重層に閉じ込められ、目的遺伝子を保持する組換えAAVを腔内に封じ込めています。このナノベシクルは生 体内 遺伝子送達のための強化されたベクターを提供します。

要約

間葉系幹細胞(MSC)由来の細胞外小胞(EV)は、治療応用や再生医療において大きな可能性を秘めています。EVは、既知のすべての細胞型から分泌されるナノスケールの小胞であり、膜固定タンパク質、可溶性因子、複数のRNA種、そして受容細胞の生理学や行動を調節する代謝物など多様な貨物を運んでいます。MSC由来または遺伝子設計されたEVは治療タンパク質やRNAを送達できますが、DNA配列を小胞に効率的に分類する仕組みがないため、EV媒介によるDNA送達は依然として困難です。私たちのグループおよび他の研究では、アデノ関連ウイルス(AAV)を含むEVが標的核送達とin vitro および in vivoでの持続的な遺伝子発現を可能にすることが示されました。しかし、生産と分離は収量の少なく時間のかかる手法によって制限されてきました。ここでは、効率的な遺伝子送達のためのサイズ定義押出法によって生成されるMSC膜包絡ナノ胞の開発を報告します。直径約200nmのこれらの小胞は、治療用遺伝子配列を持つ組換えAAVベクターを包み込む自然なEVの特性を模倣します。従来のAAVと比較して、設計されたMSC小胞は遺伝子送達効率を向上させ、自然分泌されるEV-AAVに比べて時間とコストを抑えつつ、著しく高い収量を実現しました。まとめると、EV模倣構造の利点とAAV介在遺伝子移動の利点を組み合わせた新しいMSCベースの膜ナノ胞プラットフォームを提案します。このアプローチは、提供の効率と生産のスケーラビリティを高め、遺伝子治療を臨床翻訳へと前進させる有望な戦略を提供します。

概要

遺伝子治療は、特定の遺伝子を導入、置き換え、またはサイレンシングすることで、遺伝性および後天性疾患の治療における変革的なアプローチを挙げ、正常な細胞機能を回復させます。過去20年間で、ベクター工学と送達戦略の進歩により、遺伝子治療の分野は大きく拡大しました。開発されたさまざまなベクターシステムの中で、腺素関連ウイルス(AAV)は、その良好な安全性プロファイル、効率的な伝達、そして分裂細胞および非^{分裂細胞の両方}での長期的な遺伝子発現により、最も成功し広く採用されたプラットフォームの一つとなっています^1,2。これまでに複数のAAVベースの治療薬が臨床使用の規制承認を受けており、脊髄性筋萎縮症、網膜ジストロフィー、血友病の治療にも用いられ、トランスレーショナルメディシンにおける重要なマイルストーンとなっています^。AAVベクターの広範な嗜性性と低い免疫原性は、肝臓、筋肉、中枢神経系^、眼など多様な組織への応用も可能にしています。その結果、AAVは代謝、神経学、心血管疾患を対象とした進行中の前臨床および臨床研究を支援する生体内遺伝子送達の主要なプラットフォームとなっています。

驚くべき臨床的成功にもかかわらず、AAVベースの遺伝子治療は、その広範な応用を制限し続けるいくつかの本質的な課題に直面しています。主な制約の一つは、AAVカプシドのゲノムパッケージ容量(~4.7 kb)に限られており、これが大きな治療遺伝子や複数の治療用遺伝子の伝達に制限を与えています^5,6。さらに、AAVベクターの生物分布や細胞の親向性は主に血清型によって決定され、それぞれが特定の組織に対して異なる親和性を示します。組織の標的化やトランスダクション効率を高めるために広範なカプシド工学やペプチド表示戦略が用いられていますが、多様な生物学的文脈で正確かつ予測可能なトロピズムを達成することは依然として大きな課題^{となっています7。}もう一つの重要な制約は、ヒト集団における自然なAAV血清型に対する既存の中和抗体(NAb)の有病率です。NAbの低滴価でもベクター伝達効率を大幅に低下させ、患者の適格性を制限し、繰り返し投与を複雑にすることがあります^8,9。合理的カプシド再設計、免疫抑制レジメン、一時的な血漿交換などの様々な戦略が抗体介在の中和を緩和するために検討^{されていますが、}これらのアプローチは部分的または一時的な緩和にとどまっています。これらの制限は総合的に臨床現場におけるAAV介在遺伝子送達の全体的な治療効果と再現性を低下させます。

近年、細胞外小胞包覆型AAV(EV-AAV)が、従来のAAV12,13,14,15のいくつかの重要な制限を克服する可能性を持つ代替ベクターとして探求されています。ベクターパッケージング中、AAV粒子の一部が小胞輸送経路を通じて分泌され、細胞外小胞内に閉じ込められます。この過程はAAVコード膜関連副タンパク質(MAAP)を関与させると考えられており、ウイルスの排出を促進し膜結合を促進する^16,17。得られるEV-AAV粒子は、主に細胞取り込みを促進し抗体認識から部分的に遮蔽する小胞膜により、従来のAAVに比べてトランスダクション効率が向上し、中和抗体に対する耐性が強化されました¹⁸。しかし、これらの利点にもかかわらず、EV-AAVの生産は依然として非効率的です。通常、ベクターゲノムのうち約0.5%〜12%のみがEV関連AAVとして培養培地に分泌され、大部分は細胞内に残るか遊離AAVとして存在します^12,13。したがって、十分なベクター収量を得るためには大規模な生産が必要です。さらに、EV-AAV生成は主にHEK293T生産細胞を用いて実証されており、そのEVは肝臓の急速なクリアランス、短い循環半減期、そして潜在的なバイオ安全上の懸念を示す可能性があります。これらの制限は、より効率的でカスタマイズ可能な膜包覆戦略の必要性を強調し、本研究で提示された細胞膜包絡型AAV(CME-AAV)プラットフォームの開発を促しました。

間葉幹細胞(MSC)とそのEVは、その再生能力と免疫回避特性について広く研究されています。細胞や自然分泌されるEVに基づく治療法を超えて、最近の研究ではMSC膜^19,20,21で覆われたナノ粒子を用いた薬物送達強化の代替アプローチが示されています。MSC膜コーティングは能動的な標的化能力を付与し、免疫クリアランスを低下させ、循環時間を延ばします。これらの効果はMSC由来膜の内在分子組成に起因すると考えられています^22,23。この概念を基に、MSC由来の膜材料を用いて細胞膜包膜を持つAAV(CME-AAV)ナノ胞を遺伝子送達に用として構築しました。これを実現するために、精製されたMSC膜断片を組換えAAV粒子と混合し、リポソーム製造のために確立された制御された押出プロセスにかけ^ました。サイズ定義された押出により、膜の成分は自発的にナノスケールの小胞として組み立てられ、AAV粒子を封じ込めます。得られたCME-AAVは、密度勾配に基づく遠心分離を用いて、自由で非封閉AAVからさらに精製されました。この戦略により、膜包絡を持つAAVベクターの効率的かつ再現性のある製剤が可能となり、従来のAAVと比べて著しくトランスダクション効率が向上し、EV-AAVと同等の中和抗体耐性を維持します。異なるトランス遺伝子を置換することで、CME-AAVプラットフォームはさまざまな遺伝性疾患および後天性疾患の治療に広範な可能性を秘めています。

プロトコル

すべての動物処置は、中国・珠海の北京師範大学の動物管理・利用委員会によって承認されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 孔径決定押出 による CME-AAVの調製および形成

1. 組換えAAVベクターの生成
   注:AAVの生産プロトコルは、既に公開され広く使われている手順に従っています。詳細な最適化ステップやバリエーションは、過去の研究^12,26で記述されています。
   1. 細胞を完全な培地で培養HEK293Tし、トランスフェクション当日に70%〜80%のコンフルージョンを維持します。
   2. (i) 目的のトランスジーンを運ぶAAVトランスファーベクター、(ii) 目的の血清型に対応するAAVレプト/キャップ遺伝子、(iii) アデノウイルス補助機能を含む3つのプラスミドを準備します。
   3. 標準的な実験室の手順に従い、確立されたトランスフェクション法(例:リン酸カルシウムまたはポリマーベースのトランスフェクション)を用いて、3つのプラスミドとHEK293T細胞を共トランスフェクトします。
   4. トランスフェクト細胞を48〜72時間インキュベートし、AAVの組み立てと蓄積を許可します。
   5. 細胞と培地を収集し、繰り返しの凍結・解凍サイクルまたは同等の細胞溶解法でAAV粒子を放出します。
   6. 低速で溶除液を遠心分離して細胞残骸を除去し、AAV粒子を含む上清液を回収します。
   7. AAV粒子は密度勾配超遠心分離法または他の確立された精製法を用いて精製します。
   8. 精製したAAVベクターを無菌リン酸塩緩衝生食塩水(PBS)に交換し、使用まで−80°Cで保存します。
2. MSC膜分数の調製
   注:ヒト間葉幹細胞(MSC)は機関ガイドラインに従い単離されました。細胞は、確立された条件または実験室で修正されたプロトコルのもとで培養・増殖されました。MSCの同一性は、CD73、CD90、CD105などの表現型マーカーの発現をフローサイトメトリーを用いて評価することで確認できます。MSCの多能性は、 in vitroで骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞に分化する能力によって検証されています。細胞は70%〜90%のコンバーシティに達すると採取準備が整います。以下の処置は必ずしも無菌環境で行う必要はありません。
   1. 培養培地を取り出し、細胞スクレーパーを使って培養皿からMSCを剥離します。
   2. 剥離した細胞をPBS入りの円錐形チューブに集め、遠心分離機で300×g、 4°Cで5分間細胞を掴みます。
   3. 細胞をPBSで2回洗浄し、それぞれ300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
   4. 最終細胞ペレットをPBSに再懸濁し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを補給します。
   5. 細胞懸濁液を3回凍結融解させて細胞膜を破壊し、粗い細胞溶解液を生成する。
   6. 溶解液をピペットで十分に均質化し、その後1,000 × g で4°Cで20分間遠心分離して細胞の残渣を除去します。
   7. 上清液を新しいチューブに移し、18,000 × g で4°Cで1時間遠心分離して膜分率をペレット化します。
   8. 上澄液を廃棄し、得られた膜ペレットをPBS中に再懸浮させます。この懸液は粗いMSC膜分画を表し、AAVの封膜に使用されます。
   9. 膜懸濁液を20Gから27Gの針を装備した注射器を順次通すことで均質化します。
   10. BCAアッセイを用いて均質膜懸濁液のタンパク質濃度を測定します。懸濁液を−80°Cで分割して保管するか、直接次の手順に進んでください。各解凍サイクル後に27Gの注射器で膜懸濁液を再均質化します。
3. 押出 による CME-AAVの形成
   1. 準備された膜懸濁液をAAVsと混合し、AAVの10×10ゲノムコピー(g.c.)あたり150μgの膜タンパク質を混ぜます。混合物を37°Cで30分間、優しく振って孵化させます。
   2. 膜とAAVの混合物を400nmのポリカーボネート(PC)膜を備えたミニエクストルーダーに積み込みます。サンプルを押出機に20回通して膜AAVカプションを促進します。
   3. 400 nmのPC膜を200 nmの膜に置き換え、押出プロセスを20回繰り返して小胞の大きさの不均一性をさらに低減します。
   4. 処理済みの混合物を集めます。より多く必要な場合は、複数の押出バッチをプールしてください。その結果得られる懸濁液にはCME-AAVsに加え、未被覆のAAVや空膜小胞が含まれています。直ちにCME-AAV浄化へ進め。

2. CME-AAVの密度勾配遠心分離による精製

注:このステップでは、イオジキサノール系密度勾配超遠心分離を用いて、純粋なCME-AAVを未封閉AAVから分離するタンパク質集合体、残留核酸を説明しています。この工程で得られる精製CME-AAVは、 in vitro および in vivo の両方の研究に適しています。すべての処置は無菌組織培養フードの下で行うことが推奨されます。

1. ヨジキサノール勾配の調製
   1. 40%および25%ヨオジキサノール溶液を10×PBSと滅菌脱イオン水で希釈して最終濃度1×PBSに仕上げます。
   2. 13.2 mLの開放型薄壁超透明チューブで、下部から40%ヨオジキサノール1 mLと25%ヨオジキサノール3 mLを下に敷き、不連続な密度勾配を慎重に確立します。
   3. ステップ1.14で得たCME-AAV含有懸濁液7mLを勾配の上部に優しく重ねます。チューブのバランスを取ってスイングバケットの超遠心機ローターに積み込みます。
2. 超遠心分離およびCME-AAV分画の収集
   1. 150,000 g× g で4°Cの温度で3時間、速い加速と緩やかな減速(それぞれレベル9とレベル1)を用いて遠心分離します。
   2. ローターからチューブを慎重に取り除き、勾配を乱さないようにしてください。チューブの上から下へ1 mLの分画を、ラベル付けされた1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブ(F1-F11)に集めます。すべての分数は冷やしておきましょう。
   3. 精製されたCME-AAVを含むF7およびF8の分株を特定し、新しいオープントップ超遠心分離機管にまとめます。PBSを総体積11 mLに加え、1 mLピペットで優しく混ぜます。
3. CME-AAVの洗浄と回復
   1. 150,000 gで4°Cで3時間、速い加速と速減速(両設定でレベル9)を用いて、再び150,×000 g で遠心分離します。
   2. 上清液を慎重に捨て、CME-AAVペレットを希望濃度に応じて50〜200μLの滅菌PBSに再懸濁します。
   3. 必要に応じて分割し、−80°Cで保存し、さらに使用します。

3. 透過電子顕微鏡(TEM)を用いたCME-AAVの特性評価

注:透過電子顕微鏡(TEM)は、CME-AAV粒子の形態、サイズ、膜構造を可視化するために用いられます。この手順は、細胞外小胞に用いられる標準的なネガ染色プロトコルに従っています。特に記載がない限り、すべての工程は室温で行われます。

1. 試料の準備と固定
   1. ステップ2で得られた精製済みCME-AAV懸濁液を、PBS中に約1 ×^{10 9-1} ×^{10 10} mLの濃度に希釈します。
   2. 試料を定着するには、同じ量の新たに調製された4%パラホルマルデヒド(最終濃度2%)を加え、室温で30分間培養します。
   3. Formvar/カーボンコーティングされた銅グリッド(200メッシュ)をパラフィンフィルムのシートの上に、カーボン面を上に置きます。
   4. 固定式CME-AAVサスペンションの10μLをグリッドにピペットで移し、室温で30分間吸着します。吸着中の乾燥は避けてください。
   5. フィルターペーパーでグリッドエッジの余分な液体を中心に触れずに優しく取り除きます。
2. 洗浄と固定後処理
   1. グリッドをサンプル面を下にして、50μLのPBS滴に2分間漂わせて洗浄します。これを2回繰り返します。
   2. グリッドを50μLの1%グルターアルデヒド滴に5分間移し、膜構造を安定させます。
   3. グリッドを脱イオン水の滴(各30秒)連続して5回洗い、バッファーソルトを除去します。最終洗浄の後、優しく吸い取ってください。
3. ネガティブステイン
   1. グリッドを50μLの2%水性ウラニル酢酸塩滴に1分間置き、ネガティブな染色を実現します。
   2. 余分なシミはフィルターペーパーでグリッドエッジに優しく触れて、室温で完全に自然乾燥させます。
4. イメージング
   1. 200 kVで動作する透過電子顕微鏡で染色グリッドを調べます。
   2. CME-AAVの形態と膜の完全性を評価するために××30,000から120,000倍率で代表的な画像を撮影します。
   3. オプションとして、TEM画像解析ソフトウェアを使って粒子径を測定し、小胞サイズの整合性をNTA結果と一致させます。
      注:サンプル濃度 - CME-AAV濃度を調整して中程度の粒子密度を得ること;過剰に濃縮されたサンプルは粒子の重なりを引き起こし、過度に希釈されたサンプルは検出可能な小胞がほとんどありません。アーティファクトの回避 - 洗濯が不完全な場合、塩の結晶が残り、粒子の視認を妨げることがあります。染色中はグリッドが水分を保ち、膜の崩壊を防ぎましょう。代替染色剤として、放射性取り扱い制限がある場合、リン酸(PTA、1%-2%、pH 7.0)が酢酸ウラニルの代替として使用されることがあります。保管 - 準備済みグリッドは、画像撮影前に数日間室温のほこりのない容器に保管できますが、最良のコントラストを得るためには直ちに観察することが推奨されます。

4. qPCRを用いたCME-AAVの定量化

注:このステップでは、qPCRを用いたCME-AAVゲノムコピー(g.c./μL)を定量する方法について説明します。プロトコルはCME-AAV特有のサンプル準備とデータ報告を重視しています。qPCRのセットアップおよびサイクルの他のすべての側面は、標準的な検査室手順および選定されたqPCRキットに対する製造元の指示に従うべきです。

1. 試料および標準調製
   1. 精製済みCME-AAVのアリコートを氷で解凍し、ピペッティングで優しく混ぜます。渦巻きは避けてください。
   2. AAV標準希釈液を、ヌクレアーゼフリー脱イオン水またはTEバッファーを用いて連続的に10倍の希釈で1×10³ g.c./μLに1× 10³ g.c./μLへと希釈します。新鮮またはアリコット製の標準を準備し、短期使用のために−20°Cで保存してください。
   3. 以下の対照を準備します:テンプレートなしコントロール(NTC;水)、陰性コントロール(PBSまたはブランクマトリックス)、および利用可能な場合の陽性コントロール(既知濃度のAAVサンプル)。
   4. qPCRマスターミックスは、メーカーの指示に従って氷で準備します(色素ベースまたはプローブベース)。
2. qPCRサイクリングとデータ解析
   1. qPCRマスターミックスメーカーが推奨するサイクリングパラメータに従ってqPCRを実行してください。
   2. 標準曲線をC(y軸)と_log10(g.c./μLの標準濃度)(x軸)でプロットして生成します。線形回帰を適合させて傾き(m)とy切片(b)を得る。
   3. 回帰方程式を用いて各サンプル複製のCME-AAVゲノム濃度を計算します。
      または
      
      ここでCはμLあたりのゲノムコピー数です。
   4. 平均的な技術的再現と最終的なCME-AAV濃度はg.c./μLで報告されています。
      注:qPCR製備中の熱変性は包膜とAAVカプシドの両方を破壊するため、別途DNA抽出は必要ありません。熱解前に試料に対してDNase処理を行わないでください。DNaseは、カプシドや膜が破壊された後、サンプルがDNaseを不活性化する温度に達する前にAAVゲノムにアクセスし分解することができます。可能な限り標準は一致させる必要があります。よく特徴付けられたAAV標準から標準曲線を作成しましょう。サンプルや標準値がゲノム構成(単鎖AAVと自己相補性/二本鎖AAV)が異なる場合は、報告値を適切に調整してください。プライマー/プローブ設計:プライマーは保存されたAAV配列を標的にすることができます。例として、トランスジェンの上流にあるCMVプロモーターを標的としたプライマーが一般的に用いられます。

5. CME-AAV粒子プロファイルの定量化

1. ナノ粒子追跡解析(NTA)、可変抵抗パルスセンシング(TRPS)、または同等の粒子解析技術を用いて、CME-AAV製剤のサイズ分布や粒子濃度を測定します。
2. 氷上で精製したCME-AAVサンプルを解凍し、分析前にピペッティングで穏やかに均質化します。標準的な検査手順および選定機器の製造指示に従って測定を行い、既に発表されたプロトコル^{12、27、28、29}に記載されています。

6. CME-AAV介在遺伝子移転の in vitro 解析

注:このステップは、培養細胞におけるCME-AAV介在遺伝子送達およびトランスジーン発現の評価手順を説明します。このアッセイはHEK293T細胞とCME-AAV9を用いて実証されています。EGFPですが、他の細胞タイプやレポーター構造に適応させることもあります。従来型(膜外膜のない)AAV9。EGFPは陽性対照群として機能し、PBSや空のAAV粒子は陰性対照群として使用されます。

1. 細胞調製
   1. 標準的な条件下(DMEMで10% FBS、1% ペニシリン-ストレプトマイシンを含む)で細胞を37°C、5% CO₂で培養HEK293T。
   2. 細胞を48ウェルまたは96ウェルのプレートにシードし、トランスダクション時(通常はシーディング後24時間)に約70%のコンフルエンスを達成します。ウェルサイズに応じてシーディング密度を調整します(例:48ウェルプレートなら10⁴×セル~5、96ウェルプレートなら10⁴セル×~1)。
   3. ベクターを追加する前に、細胞が付着して平衡状態を24時間維持してください。
2. ベクター応用
   1. CME-AAV9の準備をしてください。EGFPとAAV9です。無菌PBSにおけるEGFPの動作溶液。典型的なウイルス用量:48ウェルあたり5 × 10⁸ g.C.(プロモーター濃度、標的遺伝子、実験目的に応じて調整)。
   2. 各井戸ごとに、CME-AAV9のゲノムコピー(g.c.)を等しく加えます。EGFPかAAV9か。EGFPは直接培養培地に送られます。
   3. PBSまたは空のAAV粒子が同等体積のネガネガティブコントロール井戸を含めます。
   4. プレートを優しく回して均一な分布を確認し、インキュベーターに戻します。
   5. プロモーター活性および遺伝子移植発現動態に応じて24〜72時間のインキュベーションを継続します。HEK293T細胞におけるCMV駆動のEGFPでは、通常48時間以内に強い蛍光が観察されます。
3. 画像診断および生細胞解析
   1. 画像診断の準備が整ったら、培養培地を優しく吸引し、PBSで細胞を2回洗浄して結合していない粒子を除去します。細胞を動かさないようにしましょう。
   2. 製造元の指示に従い、Hoechst 33342(生細胞互換)を用いた染色細胞核。生細胞にはDAPIは使わないでください。
   3. 適切なフィルターを備えた逆型蛍光顕微鏡を用いてライブセル蛍光イメージングを行います(例:EGFPの場合は励起488 nm/放出513 nm、Hoechstでは励起350 nm/放出460 nm)。
   4. トランスダクション効率の定量化には10×または20×の対物レンズを使用し、必要に応じて高分解能の細胞内局在化には63×の対物レンズを用いてください。
   5. 同一のイメージングパラメータ(露光時間、ゲイン、絞りなど)を用いて、1ウェルあたり少なくとも5つの視野角(例:4つの角と1つの中心)を取得します。
   6. 定量分析のためにすべての画像をRAWおよびグレースケール形式で保存してください。
4. 定量的画像解析
   1. 画像はImageJ(FIJI)または同等のソフトウェアで開いてください。
   2. 各フィールドのEGFPチャネルとホエストチャネルの両方の平均蛍光強度を測定します。
   3. 蛍光信号のない領域を選択し、ピクセル値を平均して背景強度を測定します。
   4. 各チャンネルの補正強度を計算します:
      _{訂正しました}=_つまり-_背景です
   5. 各場の正規化強度を次のように計算します:
      
   6. 1井戸あたり少なくとも5つの圃場から平均正規化された強度を測定し、3つの独立した生物学的複製の平均SD±報告します。
      注:CME-AAVは、ゲノムコピーが等しい場合、従来のAAVに比べて蛍光強度が増加し、細胞の取り込みや中和抗体からの保護が改善されたことを反映しています。最適なトランスダクション効率はCME-AAV製剤の品質、細胞タイプ、プロモーター強度、ウイルス価に依存します。弱い信号が観察された場合は、ゲノムコピーの入力を増やし、qPCRでベクターの完全性を確認し、顕微鏡の校正を検証します。実験的ニーズに応じて、他の蛍光レポーター(例:mCherry、mNeonGreen、tdTomato)やルシフェラーゼ構成要素が使用されることがあります。一次細胞や非接着細胞を扱う際は、シーディングやイメージング条件(例:ポリL-リシンでコーティングしたりチャンバースライドを使ったり)を調整してください。

7. マウスモデルにおけるCME-AAV-介接遺伝子送達の評価

注:このステップでは、マウスモデルを用いたCME-AAV介有遺伝子送達のin vivo 評価を説明します。

1. 動物の調理
   1. 野生型マウス(C57BL/6)を使いましょう。すべての動物処置が施設動物ケア・使用委員会の承認を受け、関連規則に従って実施されていることを確認してください。
   2. 実験間の最適な一貫性を確保するために、4〜6週間のマウスを選定しました。
   3. 動物は標準的な飼育環境で飼育し、注射前に自由に餌や水を得られるようにしましょう。
2. ベクターの調製と投与
   1. 研究目的と対象組織に基づいてAAV血清型を選択します。本研究ではAAV9およびCME-AAV9が使用されます。
   2. ルシフェラーゼレポーター遺伝子(例:CME-AAV9.ルシフェラーゼ)をコードするウイルスベクターを非侵襲的画像診断のために準備します。
   3. ウイルスベクターを無菌生理食塩水で希釈し、1匹のマウスごとに1×10¹°ゲノムコピー(g.c.)の最終濃度にします。
   4. 注射前に、温熱パッドやぬるま湯で尾を優しく温めて静脈を拡張させます。
   5. ウイルス懸濁液50μLを31Gインスリンシリンに注入し、外側尾静脈にゆっくりと注入して漏れと静脈破裂を最小限に抑えます。
   6. 注射後はマウスをケージに戻し、完全に回復するまで観察してください。
3. 生体内 生物発光イメージング
   1. 投与から2週間後、マウスにイソフルラン(機関承認プロトコルに従い)麻酔を行い、D-ルシフェリン(体重150 μg/g;PBSの腹腔内シグマ。
   2. 麻酔をかけたマウスを生物発光イメージングシステムに入れます。
   3. 信号が停滞するまで、注入後2分ごとに発光画像を取得してください。
   4. 適切なソフトウェアを使って生物発光を定量化しましょう。発光領域周辺の関心領域(ROI)を定義し、各動物の総光子フラックス(光子/秒)を計算します。
   5. 比較のために、AAV9.luc処理群とPBS注入群をそれぞれ陽性対照群と陰性対照群として含めます。
4. エクスビブイメージング
   注意:このステップは任意です。
   1. 生 体内 画像検査直後、マウスを安楽死させ、肝臓、心臓、脾臓、腎臓、脳などの主要臓器を採取します。
   2. 同じIVISシステムを用いて、同一画像パラメータの下で分離された臓器を画像化し、組織特異的なルシフェラーゼ発現を決定します。
      注:実験目的に応じて、筋肉内注射、脳内注射、腹膜内注射などの代替投与方法が採用される場合があります。生物発光強度は遺伝子送達効率と組織の生体分布の両方を反映します。CME-AAV媒介のルシフェラーゼ発現は、膜媒介による細胞の吸収によるエンドサイトーシスにより、通常、遊離AAVに比べて早期に発現しピーク発現が増加します。サンプル間でルシフェリンの用量、タイミング、画像設定を一貫させて正確な比較を図ること。記載されたウイルス用量(マウス1匹あたり1×10¹° g.c.)は通常、注射後2〜4週間で検出可能な信号を提供しますが、異なるベクターや動物モデルに応じて最適化が必要になる場合があります。

結果

本研究で使用されたMSCは、関連する倫理ガイドラインに従い、ヒトの臍帯組織から分離されました。MSC膜画分は記載されたプロトコルに従って調製されました。AAV9。EGFPは、以前に報告された^12,26の12,26の1 HEK293T ^2,26細胞で、一時的なデュアルプラスミドトランスフェクションシステムを用いて社内で製造されました。CME-AAVの製造、膜製剤、AAV9のためです。EGFPはプロトコルで規定された10¹°ウイルスゲノムあたり膜タンパク質150μg×共インキュベートされました。混合物の1ミリリットルは400 nmのポリカーボネート多孔質膜を備えたミニエクストルーダーに積み込み、20回押出した後、さらに200 nmの膜を20回通過しました。この過程でMSC膜包絡状のAAV9が得られました。EGFP(CME-AAV9。EGFP)。

精製後、CME-AAVの形態をTEMを用いて調査しました(...

ディスカッション

CME-AAVプロトコルの重要なステップ

このプロトコルはMSC膜包絡を持つAAVを生成する方法を説明しており、CME-AAVの成功に不可欠ないくつかのステップが重要です。まず、細胞膜の慎重な前処理が不可欠です。このステップの目的は、核DNA、細胞質タンパク質、細胞内小器官からの汚染を最小限に抑えつつ、押出に適した膜断片を得ることです。さらに、膜断片のサイズは押出効率の重要な決定要因です。大きすぎる断片はポリカーボネート押出膜を詰まらせる可能性があり、一方で過度に破壊された膜材料は押出による変形の下で安定したナノ小胞への再構成に効率が悪くなることがあります。このプロトコルでは、遠心力を増す逐次遠心分離を用いて非膜成分を除去し、その後注射器を用いた均質化を行って、適切かつ再現性のあるサイズ分布を持つ膜断片を生成します。

ナノ小胞形成の後、膜包絡を持つAAVと包絡されていないAAVの効率的な分離は、もう一つの重要なステップとなりま...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
生物発光イメージングシステム	パーキンエルマー	IVIS Spectrum光学イメージングシステム（Lumina III）
D-ルシフェリンカリウム塩	Yeasenバイオテクノロジー	40902ES03
ウシ胎児血清	Yeasenバイオテクノロジー	40130ES76
蛍光顕微鏡	ツァイス	Axio Observer 7
Formvar/カーボンコーティング銅グリッド200メッシュ	ミリポアシグマ	TEM-FCF400CU
グルタルアルデヒド	ミリポアシグマ	354400
HBSS	ジブコ	C14175500BT
Hieff Unicon qPCR TaqMan プローブマスターミックス	Yeasenバイオテクノロジー	11205ES08
高グルコースDulbeccoの改良Eagle培地	ハイクローン	SH30243
高速遠心分離機	ベックマン・コールター	Avanti J-E
ホイスト33342	ベヨタイム	C1022
NTA機器	マルバーンパナリティカル	NanoSight NS300
超遠心用オープントップ薄壁超透明チューブ	ベックマン・コールター	344059
オプティプレップ ヨードキサノール	ミリポアシグマ	D1556
パラホルムアルデヒド4%	ベヨタイム	P0099
PBS	バイオシャープ	BL302A
ペニシリン-ストレプトマイシン	ミリポアシグマ	V900929
qPCR機器	アップリッドバイオシステムズ	QS6リアルタイムPCRシステム
高速遠心分離機ローター	ベックマン・コールター	JA-25.50
超遠心用SW 41 Tiスイングバケットローター	ベックマン・コールター	331362
透過型電子顕微鏡	JEOL	JEM-2100F
超遠心分離機	ベックマン・コールター	Optima XE-100
ウラニル酢酸塩	エレクトロンスマイクロスコピーサイエンシズ	NC1375332
ワットマンNucleporeポリカーボネートメンブレンフィルター（200 nm）	サイティバ	10417004
ワットマンNucleporeポリカーボネートメンブレンフィルター（400 nm）	サイティバ	10417104