本プロトコルでは、公開されているゲノムワイド関連解析（GWAS）のサマリー統計量を用い、虚血性脳卒中と血管性認知症の間の潜在的な因果関係を評価するための、再現可能な2サンプル・メンデルランダム化解析ワークフローについて解説します。
方法論記事
虚血性脳卒中と血管性認知症の因果関係：メンデルランダム化解析による研究
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2026年9月11日
この記事について
サマリー
要約
虚血性脳卒中（IS）は世界的な障害および死亡の主要な原因であり、血管性認知症（VaD）は脳血管障害に関連する一般的な認知症のサブタイプです。観察研究ではISとVaDの間の関係が示唆されていますが、これらの研究は交絡因子や逆因果関係の影響を受けやすいという課題があります。本プロトコルでは、公開されているゲノムワイド関連解析（GWAS）のサマリー統計量を用いて、ISとVaDの間の潜在的な因果関係を評価するための、再現可能な2サンプルメンデルランダム化（MR）ワークフローについて記述します。ISに関連する遺伝的操作変数は公開GWASデータセットから抽出し、VaDのアウトカム関連性は公開VaD GWASデータセットから取得しました。対応するデータセットIDは「Protocol」セクションに記載されています。アウトカムのマッチングとアレル調和後、最終的なMR解析のために51個の一塩基多型（SNP）が保持されました。このワークフローには、操作変数の選択、連鎖不平衡クランピング、アレルの調和、操作変数の強度の評価、逆分散加重（IVW）解析、加重中央値解析、MR-Egger解析、不均一性検定、水平多面発現性の評価、およびleave-one-out感度分析が含まれます。代表的な解析において、IVW法では遺伝的に予測されたISとVaDリスクの間に正の関連が示され、加重中央値法でも方向性の一致した結果が得られました。MR-Egger推定値は方向性は一致していましたが、統計的有意性には達しませんでした。したがって、これらの知見は因果関係の決定的な証明ではなく、因果効果の可能性を示す示唆的な根拠として解釈されるべきです。本プロトコルは、研究者が公開GWASデータを用いて、脳血管疾患に関連するアウトカムを調査するための、透明性と再現性のあるMRワークフローを適用する際に役立つと考えられます。
概要
虚血性脳卒中（IS）は、世界における重度の障害および死亡の主要な原因となっています1。Global Burden of Disease Studyの最新データによれば、ISの世界的な発生率は低下していますが、特に東欧、東アジア、中央アジア、およびサブサハラアフリカにおいて依然として大きな負担となっています2,3。さらに、社会人口学的指数（SDI）が低い国々ではISの発生率が上昇傾向にあり、2020年から2030年にかけて増加し続けると予測されています。
多くの疫学研究により、脳血管疾患と血管性認知症（VaD）との間に潜在的な関連があることが示唆されています4,5。特に中国において、VaDは高齢者に最も多い認知症のタイプの一つであり、虚血性脳卒中（IS）の高い有病率はVaDの発症と密接に関連しています。しかし、既存の研究の多くは観察研究であり、残留交絡、逆の因果関係、および疾患定義の違いが、因果関係の解釈を制限している可能性があります。したがって、ISがVaDの発症に潜在的に関与しているかどうかを評価するためには、さらなる分析的アプローチが必要です。
ISはいくつかのメカニズムを通じてVaDの発症に影響を与える可能性があります。ISによって引き起こされる脳血管損傷は、脳灌流の不足とそれに続く神経変性変化を招く可能性があります6。さらに、VaDはIS後の慢性的な脳血管損傷、微小血管損傷、および炎症反応に関連している可能性があります7,8。したがって、ISとVaDの関係を調査することは、潜在的な疾患の関連性を理解し、将来的な予防戦略を導くために重要です。
メンデルランダム化（MR）は、遺伝的変異を操作変数として用い、曝露因子とアウトカムの間の潜在的な因果関係を評価する解析手法である9。従来の観察研究と比較して、MRは妥当な操作変数の仮定の下で、交絡や逆因果関係によるバイアスを低減できる。ランダム化比較試験や実験モデルと比較すると、MRは既存のゲノムワイド関連解析（GWAS）の要約統計量を利用できるため、直接的な介入研究が不可能、非倫理的、または実施が困難な場合に、臨床的に重要な関連性を評価することが可能である。近年、メンデルランダム化アプローチを用いた遺伝学的研究により、ISとVaDの関連性が調査されている10。しかし、再現可能な実施のためには、曝露操作変数の選択、アウトカムデータの抽出、アレルの一致化、操作変数の強度評価、異質性検定、多面発現性の評価、および感度分析に関する詳細なプロトコルレベルの記述が依然として重要である。
本プロトコールは、注目する曝露因子とアウトカムの両方について公開済みのGWASサマリー統計量が存在し、曝露因子に対して妥当な遺伝的操作変数を選択でき、かつ研究目的が直接的な生物学的メカニズムの解明ではなく、潜在的な因果関係の評価である場合に適しています。したがって、本研究では公開済みのGWASサマリー統計量を用いて、ISとVaDの間の潜在的な因果関係を評価するための2サンプルMRプロトコールを提示します。ここでの目的は、決定的な生物学的メカニズムを確立することではなく、再現可能な解析ワークフローを提供することです。本プロトコールでは、遺伝的操作変数の選択、アウトカムの照合、アレル調和、MR推定、および感度分析について記述し、ISとVaDの関連を代表的な例として用います。
プロトコル
本研究では、公開されているGWASサマリー統計量を使用した。元の研究では、施設内審査委員会（IRB）の承認を得て、参加者からインフォームドコンセントを得ている。この二次解析に際して、追加の倫理的承認は必要なかった。
1. 研究デザインおよび倫理声明
- 2サンプルMRデザインを用いて、ISとVaDの間の潜在的な因果関係を評価する。
- 公開されているGWASサマリー統計量のみを使用する。GWASデータセットに含まれるすべての原著研究において、機関審査委員会（IRB）の承認および参加者からのインフォームドコンセントが得られているため、本二次解析に際して追加の倫理的承認は不要である。
- データ抽出前に、ISを曝露因子、VaDをアウトカムとして定義する。
2. ソフトウェアの準備
- すべての解析はR統計ソフトウェアを用いて行う。
- インストゥルメントの抽出、アウトカムデータの抽出、アレルの一致化（ハーモナイゼーション）、MR推定、不均一性検定、および感度分析を行うためにTwoSampleMRパッケージをロードする。また、全般的水平多面発現および潜在的な外れ値バリアントを評価するためにMRPRESSOパッケージをロードする。
- ワークフロー内で以下のコア関数を使用する：extract_instruments、extract_outcome_data、harmonise_data、mr、generate_odds_ratios、mr_heterogeneity、mr_pleiotropy_test、mr_singlesnp、mr_leaveoneout、mr_scatter_plot、mr_forest_plot、mr_funnel_plot、およびmr_leaveoneout_plot。MR-PRESSO全般的検定を行い、該当する場合は外れ値検定および歪曲検定を行うためにMRPRESSO::mr_pressoを使用する。
3. 曝露データセットの選択と操作変数スクリーニング
- IEU OpenGWASデータセットebi-a-GCST90018864から、特発性精神病（IS）に関連する一塩基多型（SNP）を抽出します。このデータセットには、IS症例11,929例と対照群472,192例が含まれており、総サンプルサイズは484,121名です。
- 有意水準を（以下に続く数値）として、ISに関連する候補SNPを選択します。 p < 5 × 10-6.
- The p < 5 × 10-6 本代表的プロトコルでは、感度分析に十分な数の独立した操作変数（instrument）を保持するために、この閾値を使用している。この閾値は従来のゲノムワイド有意水準よりも緩やかであるため、これらの操作変数に基づく知見は、決定的なものではなく、探索的かつ示唆的なものとして解釈されるべきである。
- 独立したSNPを保持するために、連鎖不平衡クランピングを実行します。rを用いて2 閾値を0.001、クランピングウィンドウを10,000 kbに設定した。
- 候補となる楽器を抽出するには、以下のRコマンドを使用してください。
extract_instruments(outcomes = "ebi-a-GCST90018864", p1 = 5e-06, clump = TRUE) - 保持された各SNPについて、以下の式を用いてF統計量を算出する。F = (β/SE)2、ここで β SEは、それぞれSNP-曝露効果推定値および標準誤差である。
- F統計量に基づくSNPを除外する < 弱操作変数バイアスのリスクを低減させるため、10を基準とする。F統計量の分布を、最小値、最大値、中央値、および四分位範囲（IQR）を用いて要約する。
4. アウトカムデータセットの抽出
- FinnGen GWASデータセット finn-b-F5_VASCDEM から VaD のアウトカム関連データを抽出します。このデータセットには、VaD 患者 881 例と対照群 211,508 例が含まれています。
- extract_outcome_data 関数を使用して、選択したすべての IS 関連 SNP のアウトカム関連データを抽出します。
- ターゲット SNP がアウトカムデータセットに直接存在しない場合は、プロキシ SNP を検索します。有効なプロキシ情報およびアレルの一致が確認できた場合に、プロキシ一致バリアントを保持します。
- 以下に示す R コマンドを使用して、アウトカムデータセットを抽出します。
extract_outcome_data(snps = exp_dat$SNP, outcomes = "finn-b-F5_VASCDEM", access_token = NULL)
5. アレル調和およびSNP保持
- MR解析の前に、曝露データセットとアウトカムデータセットをハーモナイズします。
- エフェクトアレルとその他のアレルの方向を揃え、SNP–曝露およびSNP–アウトカムの効果推定値が同じエフェクトアレルに対応するようにします。
- ハーモナイズ中にSNPを精査し、アレルの不一致、アウトカムとの関連が得られないケース、および曖昧なアレルの整合性を特定します。ハーモナイズ後、曝露およびアウトカムの両方の効果推定値が得られたSNPを保持します。
- アレルのハーモナイズには、以下のRコマンドを使用します：harmonise_data(exposure_dat = exp_dat, outcome_dat = out_dat, action = 1)
- 曝露データセットから最初に抽出したSNP数、アウトカムとの関連が得られたSNP数、プロキシでマッチングされたバリアント数、および最終的なMR解析に保持したSNP数を記録します。
6. 主要MR解析および感度分析
- 逆分散加重（IVW）法を用いて、主要なMR解析を行う。
- 異なる仮定の下での因果推定値の一貫性を評価するため、加重中央値法およびMR-Egger法を用いて補完的なMR解析を行う。
- MR推定値からオッズ比（OR）および95%信頼区間（CI）を算出する。
- 以下のRコマンドを使用してMR解析を実行し、ORを算出する：
res <- mr(dat)
res <- generate_odds_ratios(res) - あらかじめ指定された主要な曝露-アウトカム関連性は1つであるため、主要なMR推論におけるボンフェローニ補正後の閾値を0.05/1 = 0.05と定義する。主要なIVW解析における統計的有意性の閾値として、両側 p-value < 0.05 を使用する。
- VaD症例数が限定的であることを踏まえ、主要解析の統計的精度を具体化するため、観察されたIVW推定値とその標準誤差に基づいた事後の両側Wald検定の検出力計算を行う。非中心パラメータ βIVW/SEIVW を用い、両側 α レベル 0.05 で検出力を算出する。80%の検出力に対応する最小検出可能効果を exp[(z0.975 + z0.80) × SE] として算出する。ISは二値の曝露であり、SNP-曝露の関連は対数オッズスケールで表現されるため、この解析はあらかじめ指定されたサンプルサイズ計算ではなく、効果条件付きの精度に関する記述的評価として報告する11。
7. 異質性、水平的多面発現、およびleave-one-out解析
- CochranのQ統計量を用いて、SNP間の不均一性を評価します。
- 不均一性統計量を算出するには、以下のRコマンドを使用します。
mr_heterogeneity(dat) - MR-Egger切片テストを用いて、方向性水平多面発現性を評価します。
- MR-Egger切片を算出するには、以下のRコマンドを使用します。
mr_pleiotropy_test(dat) - 10,000回のシミュレーション、有意水準0.05、および外れ値テストと歪曲テストの両方を有効にしたMR-PRESSOを用いて、全般的水平多面発現性と潜在的な外れ値バリアントを評価します12。
- MR-PRESSO解析には、以下のRコマンドを使用します。
set.seed(20260729)
mr_presso(
BetaOutcome = "beta.outcome",
BetaExposure = "beta.exposure",
SdOutcome = "se.outcome",
SdExposure = "se.exposure",
OUTLIERtest = TRUE,
DISTORTIONtest = TRUE,
data = dat,
NbDistribution = 10000,
SignifThreshold = 0.05
) - 単一SNP解析を行い、各SNPの効果を個別に推定します。
- 単一SNP解析には、以下のRコマンドを使用します。
res_single <- mr_singlesnp(dat) - SNPを1つずつ順次除外してIVW解析を繰り返す、leave-one-out解析を実施します。
- leave-one-out解析には、以下のRコマンドを使用します。
res_loo <- mr_leaveoneout(dat)
8. 可視化と出力
- 異なる手法におけるMR推定値を示す散布図を作成します。
- 単一SNPの推定値および全体のMR推定値を示すフォレストプロットを作成します。
- SNP特異的推定値の対称性を視覚的に評価するために、ファンネルプロットを作成します。
- 全体の推定値が単一のSNPによって支配されていないか評価するために、リーブワンアウトプロットを作成します。
- 以下のRコマンドを使用してプロットを作成します：
mr_scatter_plot(res, dat)
mr_forest_plot(res_single)
mr_funnel_plot(res_single)
mr_leaveoneout_plot(res_loo) - 報告および再現性のために、MRの結果、操作変数テーブル、アウトカム関連テーブル、および感度分析の出力をエクスポートします。
結果
図1 データセットの選択および操作変数のスクリーニングから、感度分析、結果の可視化に至るまで、2サンプルメンデリアンランダム化プロトコルの全体的なワークフローをまとめます。各段階における代表的な出力結果を以下に示します。
遺伝学的操作変数およびハーモナイゼーションの品質管理
曝露GWASデータセットから、有意水準 p < 5 × 10-6 を用いて、計52個のIS関連SNPを最初に抽出しました。次に、VaD GWASデータセットからアウトカムの関連性を抽出しました。アウトカムのマッチング、プロキシ検索、およびアレル調和（ハーモナイゼーション）を経て、最終的なMR解析のために51個のSNPを保持しました。2つのバリアントはプロキシSNPを用いてマッチングされました。保持された遺伝的操作変数は表1に記載しています。保持した51個の操作変数のF統計量は20.91から46.06の範囲であり、中央値は25.08、四分位範囲（IQR）は22.95–30.71でした。保持されたSNPの中でF統計量が10未満のものはなく、弱操作変数バイアスの可能性は低いことが示されました。
ISおよびVaDにおけるMR推定値
散布図は、異なるMR法におけるSNP特異的なMR推定値の方向性と大きさを的に示した（図 2）。IVW法および加重中央値法では正の相関が認められたが、MR-Egger法の推定値は方向性は一致していたものの、統計的有意性に達しなかった。
個々のSNP推定値のフォレストプロットにより、VaDリスクとのSNP特異的な関連性が示された（図3）。全体のMR推定値は図4にまとめられている。IVW法では、遺伝的に予測されたISとVaDリスクとの間に統計的に有意な正の相関が認められた（OR = 1.63, 95% CI: 1.21–2.21, p = 0.0013）。加重中央値法（weighted median method）でも、これと一致する有意な推定値が得られた（OR = 1.60, 95% CI: 1.06–2.42, p = 0.0240）。MR-Egger推定値は方向性は一致していたが、統計的有意性には至らなかった（OR = 2.21, 95% CI: 0.97–5.01, p = 0.0645）。
FinnGen VaDアウトカムGWASには、881例の症例と211,508例の対照群が含まれていた。観察されたIVW推定値に基づく事後二側Wald検定の計算において、主要なIVW解析の推定検出力はα = 0.05で89.5%であった。80%の検出力における対応する最小検出可能効果は、OR = 1.54であった。対照的に、MR-Egger解析の最小検出可能効果はOR = 3.23であり、これは観察された方向的に一貫したMR-Egger推定値（OR = 2.21）を上回っていた。したがって、MR-Egger解析で有意ではなかった結果は、それ自体が主要なIVW推定値の方向に反する証拠であるということではなく、効率性の低い感度分析推定法であるための精度不足を反映していると解釈されるべきである。
事前に規定された主要な曝露・アウトカムの関連性が1つのみ評価されたため、主要なMR推論に対するボンフェローニ補正後のしきい値は0.05/1 = 0.05となりました。したがって、IVWの結果は補正後の有意水準を満たしました。総合すると、これらの知見は、主にIVW推定値に基づき、また加重中央値感度分析によって支持される形で、遺伝的に予測されたISがVaDリスクに正の影響を及ぼす可能性を示唆する根拠となります。しかしながら、MR-Egger推定値は方向性こそ一致していたものの、統計的有意性に達しませんでした。したがって、本結果を因果関係の決定的な証拠として解釈すべきではありません。
不均一性および水平的多面的作用の解析
SNP間の不均一性はCochranのQ統計量を用いて評価した。IVW不均一性検定の結果は、自由度50でQ = 57.46（p = 0.218）となり、MR-Egger不均一性検定の結果は、自由度49でQ = 56.77（p = 0.208）であった。これらの結果は、SNP個別の推定値間に実質的な不均一性がないことを示していた。方向性のある水平多面的影響は、MR-Egger切片検定を用いて評価した。MR-Egger切片は-0.0195（SE = 0.0253, p = 0.444）であり、方向性のある水平多面的影響の統計的根拠は認められなかった。MR-PRESSO解析は、維持された51個のハーモナイズ済みSNPを用い、10,000回のシミュレーションで実施した。MR-PRESSOグローバル検定では、グローバルな水平多面的影響の根拠は示されなかった（RSSobs = 59.61; empirical p = 0.2388）。グローバル検定が統計的に有意ではなかったため、個別の外れ値および歪み検定は適用せず、外れ値補正後の推定値は生成しなかった。ファンネルプロットにより、SNP個別の推定値の対称性を視覚的に評価した（図5）。MR-PRESSOの詳細な設定および結果は、付録表1に記載している。
Leave-one-out感度分析およびプロトコル出力の検証
全体のMR推定値が特定の単一SNPによって左右されていないかを評価するために、leave-one-out解析を実施した。leave-one-outプロットにより、個々のSNPを順次除外しても全体の推定値に実質的な変化がないことが示された（図6）、これにより、単一の遺伝的計器がその関連性を支配していたわけではないことが示唆された。以上の代表的な結果は、本プロトコルで記述した2サンプルMRワークフローの実用的なアウトプットを実証するものである。 表 1 SNP選択およびハーモナイゼーション後に保持された遺伝的操作量（instrument）を示しています。 図2 各手法におけるMR推定値の方向性を例示している。 図 3 SNP特異的な推定値を提示し、 図4 全体のMR推定値を要約します。 図 5 多面発現性または非対称性の視覚的評価を可能にし、 図6 個々のSNPの影響を評価します。 付随表 2 各主要プロトコルステップを、それに対応する検証アウトプットに紐付けます。
本研究で解析したすべてのGWAS未加工要約統計量は、公開されています。虚血性脳卒中の曝露データセットは、IEU OpenGWASデータベースからデータセットID ebi-a-GCST90018864として取得しました。血管性認知症のアウトカムデータセットは、FinnGen GWASデータセットからデータセットID finn-b-F5_VASCDEMとして取得しました。抽出した操作変数表、ハーモナイズされた解析データセット、MR結果表、および関連する出力ファイルは、補足資料として提供しています。
図12サンプルメンデルランダム化（MR）プロトコルのワークフロー。 この図は、曝露データセットの選択、操作変数のスクリーニング、アウトカムデータの抽出、アレルの一致化、MR推定、不均一性検定、水平多面発現性の評価、leave-one-out分析、および可視化を含む、プロトコルの主な手順をまとめたものである。 この図の拡大表示をご覧になるには、こちらをクリックしてください。
図2MRの散布図 ISとVaDの関連性に関する推定値。 各点はSNP特異的な推定値を表しています。適合線は、異なるMR法を用いて得られた推定関連性を表しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3単一SNP MR推定値のフォレストプロット。 この図は、IS関連遺伝子変異とVaDリスクとの関連における、SNP個別の推定値を示しています。水平線は95%信頼区間を表しています。 こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 4. 異なる手法における全般的MR 推定値のフォレストプロット。 この図は、IVW法、加重中央値法、およびMR-Egger法を用いて得られた全般的なMR推定値をまとめたものである。水平線は95%信頼区間を示す。MR：メンデルランダム化、IVW：逆分散加重法。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 5. SNP特異的MR 推定値のファンネルプロット。 この図はSNP特異的なMR推定値の分布を示しており、遺伝的操作変数間における対称性の視覚的評価を可能にする。MR：メンデルランダム化、IVW：逆分散加重。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
図61つ抜き感度分析。 この図は、各SNPを順次除外した後のMR推定値を示しています。このプロットは、全体の推定値が単一の遺伝的操作変数によって主導されていないかを確認するために使用されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| いいえ。 | 一塩基多型 | 遺伝子 | 染色体 | 電気穿孔法 | 変形性関節症 | EAF.IS | EAF.VD | IS β (標準誤差) | VD β (標準誤差) | F統計量 | R² |
| 1 | rs10886430 | GRK5 | 10 | G | A | 0.118244 | 0.09536 | 0.1147 (0.0220) | -0.0172 (0.0852) | 27.18 | 5.61E-05 |
| 2 | rs10936572 | LOC107986051 | 3 | T | C | 0.179643 | 0.1235 | -0.0512 (0.0104) | 0.1444 (0.0743) | 24.24 | 5.01E-05 |
| 3 | rs11045239 | PDE3A | 12 | A | G | 0.492943 | 0.4629 | 0.0604 (0.0089) | 0.0303 (0.0494) | 46.06 | 9.51E-05 |
| 4 | rs11047532 | LOC105369698 | 12 | G | C | 0.305214 | 0.1513 | 0.0499 (0.0105) | 0.0159 (0.0689) | 22.59 | 4.66E-05 |
| 5 | rs11065836 | CUX2 | 12 | A | G | 0.159123 | 0.07442 | -0.0608 (0.0103) | 0.0245 (0.0929) | 34.84 | 7.20E-05 |
| 6 | rs11105378 | ATP2B1 | 12 | T | C | 0.203466 | 0.07522 | -0.0540 (0.0098) | -0.1174 (0.0916) | 30.36 | 6.27E-05 |
| 7 | rs117140252 | - | 14 | A | G | 0.041216 | 0.06988 | 0.1568 (0.0311) | 0.1498 (0.0967) | 25.42 | 5.25E-05 |
| 8 | rs117343276 | - | 10 | G | A | 0.030533 | 0.0431 | -0.0905 (0.0196) | -0.1449 (0.1233) | 21.32 | 4.40E-05 |
| 9 | rs11831940 | HDAC7 | 12 | A | G | 0.251914 | 0.3526 | 0.0631 (0.0130) | 0.1226 (0.0513) | 23.56 | 4.87E-05 |
| 10 | rs11880613 | DNM2 | 19 | A | G | 0.184857 | 0.1804 | -0.0613 (0.0110) | 0.1499 (0.0640) | 31.06 | 6.41E-05 |
| 11 | rs12445022 | LOC124903748 | 16 | A | G | 0.271667 | 0.3193 | 0.0605 (0.0112) | 0.0218 (0.0527) | 29.18 | 6.03E-05 |
| 12 | rs12509595 | - | 4 | C | T | 0.297929 | 0.3124 | 0.0577 (0.0091) | 0.1462 (0.0533) | 40.2 | 8.30E-05 |
| 13 | rs12633109 | - | 3 | T | G | 0.360897 | 0.3263 | 0.0436 (0.0089) | 0.0395 (0.0526) | 24 | 4.96E-05 |
| 14 | rs1275980 | KCNK3 | 2 | T | C | 0.498545 | 0.5481 | -0.0582 (0.0094) | -0.0128 (0.0495) | 38.33 | 7.92E-05 |
| 15 | rs13123551 | - | 4 | A | T | 0.616442 | 0.5065 | 0.0552 (0.0097) | 0.0818 (0.0493) | 32.38 | 6.69E-05 |
| 16 | rs147871383 | MIR99AHG | 21 | A | G | 0.02368 | 0.01925 | 0.2259 (0.0494) | 0.2534 (0.1903) | 20.91 | 4.32E-05 |
| 17 | rs16918175 | - | 10 | C | T | 0.104037 | 0.0811 | -0.0649 (0.0131) | 0.0332 (0.0895) | 24.54 | 5.07E-05 |
| 18 | rs17182166 | ACVR1 | 2 | T | G | 0.12494 | 0.137 | 0.0751 (0.0156) | -0.0046 (0.0703) | 23.18 | 4.79E-05 |
| 19 | rs1906779 | - | 15 | A | G | 0.211386 | 0.1239 | 0.0438 (0.0095) | -0.0342 (0.0758) | 21.26 | 4.39E-05 |
| 20 | rs1948696 | ITGB5 | 3 | C | T | 0.650138 | 0.6041 | -0.0459 (0.0091) | 0.0219 (0.0501) | 25.44 | 5.25E-05 |
| 21 | rs1973765 | LSP1 | 11 | C | T | 0.486717 | 0.4124 | 0.0441 (0.0092) | -0.0229 (0.0505) | 22.98 | 4.75E-05 |
| 22 | rs2429123 | CACNA1C, DCP1B | 12 | C | T | 0.729926 | 0.725 | 0.0473 (0.0098) | 0.0190 (0.0549) | 23.3 | 4.81E-05 |
| 23 | rs2447561 | - | 8 | T | A | 0.873442 | 0.8382 | -0.0589 (0.0116) | -0.0570 (0.0674) | 25.78 | 5.33E-05 |
| 24 | rs245015 | MSH3 | 5 | A | G | 0.685061 | 0.6562 | -0.0456 (0.0089) | 0.0065 (0.0519) | 26.25 | 5.42E-05 |
| 25 | rs2501968 | CENPQ | 6 | G | A | 0.465302 | 0.4229 | -0.0490 (0.0086) | -0.0879 (0.0498) | 32.46 | 6.71E-05 |
| 26 | rs2526620 | - | 7 | G | A | 0.252144 | 0.2459 | 0.0500 (0.0092) | 0.0505 (0.0576) | 29.54 | 6.10E-05 |
| 27 | rs284160 | TGFBR3 | 1 | A | G | 0.192644 | 0.1186 | 0.0572 (0.0096) | 0.1573 (0.0768) | 35.5 | 7.33E-05 |
| 28 | rs2842870 | PMF1, PMF1-BGLAP | 1 | C | T | 0.360398 | 0.3434 | -0.0446 (0.0087) | -0.0727 (0.0518) | 26.28 | 5.43E-05 |
| 29 | rs2880492 | NCOR2 | 12 | C | T | 0.035841 | 0.01984 | -0.1293 (0.0266) | -0.1917 (0.1781) | 23.63 | 4.88E-05 |
| 30 | rs35790371 | RBFOX1 | 16 | A | G | 0.005125 | 0.001903 | 0.5587 (0.1176) | 0.1447 (0.5420) | 22.57 | 4.66E-05 |
| 31 | rs5752720 | TTC28 | 22 | T | C | 0.28441 | 0.1844 | 0.0422 (0.0091) | -0.0311 (0.0635) | 21.51 | 4.44E-05 |
| 32 | rs57694670 | SH3PXD2A | 10 | G | A | 0.433638 | 0.3834 | -0.0507 (0.0086) | 0.0080 (0.0507) | 34.76 | 7.18E-05 |
| 33 | rs6462001 | - | 7 | T | G | 0.881494 | 0.8329 | -0.0765 (0.0151) | -0.0567 (0.0662) | 25.67 | 5.30E-05 |
| 34 | rs6843082 | - | 4 | A | G | 0.65294 | 0.6907 | -0.0438 (0.0092) | -0.0568 (0.0534) | 22.67 | 4.68E-05 |
| 35 | rs7091346 | SH3PXD2A | 10 | T | C | 0.45273 | 0.2664 | -0.0582 (0.0098) | -0.0143 (0.0552) | 35.27 | 7.28E-05 |
| 36 | rs7194129 | CFDP1 | 16 | T | C | 0.573691 | 0.5538 | 0.0399 (0.0084) | 0.0293 (0.0495) | 22.56 | 4.66E-05 |
| 37 | rs7341574 | ZFPM2 | 8 | T | C | 0.313243 | 0.3895 | 0.0463 (0.0094) | -0.0774 (0.0505) | 24.26 | 5.01E-05 |
| 38 | rs7451833 | - | 6 | G | A | 0.103042 | 0.1166 | 0.1280 (0.0220) | 0.1253 (0.0777) | 33.85 | 6.99E-05 |
| 39 | rs74617384 | リゾホスファチジン酸 | 6 | T | A | 0.070999 | 0.04573 | 0.1415 (0.0281) | -0.0532 (0.1162) | 25.36 | 5.24E-05 |
| 40 | rs74849463 | PIK3C2B | 1 | T | C | 0.240949 | 0.2043 | 0.0445 (0.0092) | -0.0319 (0.0616) | 23.4 | 4.83E-05 |
| 41 | rs757241 | AFAP1-AS1 | 4 | C | G | 0.673377 | 0.6704 | -0.0681 (0.0145) | -0.0274 (0.0523) | 22.06 | 4.56E-05 |
| 42 | rs76099321 | CNNM2 | 10 | A | G | 0.052085 | 0.02979 | -0.0691 (0.0150) | -0.2215 (0.1464) | 21.22 | 4.38E-05 |
| 43 | rs7670136 | - | 4 | C | T | 0.571088 | 0.6269 | -0.0473 (0.0101) | 0.0391 (0.0509) | 21.93 | 4.53E-05 |
| 44 | rs77455924 | 非結核性分枝菌 | 11 | T | C | 0.056457 | 0.02996 | 0.1632 (0.0331) | 0.0444 (0.1477) | 24.31 | 5.02E-05 |
| 45 | rs7820334 | - | 8 | T | C | 0.246549 | 0.2949 | -0.0643 (0.0127) | -0.1327 (0.0648) | 25.63 | 5.29E-05 |
| 46 | rs7859727 | CDKN2B-AS1 | 9 | T | C | 0.518845 | 0.4151 | 0.0569 (0.0087) | 0.0281 (0.0498) | 42.77 | 8.83E-05 |
| 47 | rs7989823 | COL4A1, COL4A2 | 13 | C | A | 0.591615 | 0.6188 | 0.0527 (0.0089) | 0.0693 (0.0518) | 35.06 | 7.24E-05 |
| 48 | rs79960344 | - | 17 | G | T | 0.102808 | 0.1031 | 0.0651 (0.0130) | -0.1596 (0.0805) | 25.08 | 5.18E-05 |
| 49 | rs880315 | CASZ1 | 1 | C | T | 0.445525 | 0.4139 | 0.0416 (0.0089) | 0.0444 (0.0501) | 21.85 | 4.51E-05 |
| 50 | rs9112 | LOC100505841 | 5 | A | G | 0.436595 | 0.3573 | 0.0407 (0.0085) | -0.0274 (0.0523) | 22.93 | 4.74E-05 |
| 51 | rs979380 | - | 17 | A | G | 0.531844 | 0.6197 | -0.0417 (0.0084) | -0.0196 (0.0506) | 24.64 | 5.09E-05 |
| EAF.ISおよびEAF.VDは、それぞれ虚血性脳卒中の曝露データセットおよび血管性認知症のアウトカムデータセットにおけるエフェクトアレル頻度を示す。F統計量 = (β/SE)²。SNPあたりのR² = F/(F + N − 2)であり、ここでN = 484,121である。SNPはp値を用いて選択された。 < 5 × 10-6 およびr²を用いた連鎖不平衡クランピング < 10,000 kbのウィンドウ内で0.001。 | |||||||||||
表1：虚血性脳卒中の遺伝的インストルメントおよび血管性認知症（VaD）に対する対応するSNP–アウトカム関連。 本表は、SNP ID、マッピングされた遺伝子、染色体、アレル、EAF、SNP–形質推定値、F統計量、およびSNPごとのR2を含む、最終的に選択された51個のSNPをリストしている。SNPは p < 5 × 10-6で選択され、10,000 kb以内でr2 < 0.001でクランプされた。EAF.ISおよびEAF.VDは、それぞれISおよびVDデータセットにおける効果アレルの頻度を示す。Chr.：染色体、EA：効果アレル、OA：他方のアレル、EAF：効果アレル頻度、IS：虚血性脳卒中、VD：血管性認知症。こちらをクリックして本表をダウンロードしてください。
補足表1. 虚血性脳卒中と血管性認知症の解析における水平多面性のMR-PRESSO評価。この表は、最終的に調和させた51個のSNPデータセットを用いて、全般的水平多面性と潜在的な外れ値バリアントを評価するために実施したMR-PRESSO解析の結果をまとめたものである。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。
付随表2. プロトコルの手順とそれに対応する検証済み出力。 この表は、プロトコルの各主要ステップを、対応する代表的な出力結果および原稿内での記載箇所に関連付けており、分析ワークフローの実装と妥当性の検証を示しています。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。
ディスカッション
本研究では、公開されているGWASサマリー統計量を用いて、ISとVaDの間の潜在的な因果関係を評価するための2サンプルMRプロトコルを提示します。代表的な解析において、IVW法および加重中央値法は、遺伝的に予測されたISとVaDリスクとの正の相関を支持しましたが、MR-Egger推定値は方向性は一致していたものの、統計的有意性に達しませんでした。したがって、これらの知見は因果関係の決定的な証明ではなく、因果効果の可能性を示唆する根拠となるものです。
観察された関連性は、脳血管障害の文脈において生物学的に妥当である。ISは、局所的な神経損傷、脳血流の低下、およびそれに続く神経変性変化を引き起こす可能性がある。先行研究では、VaDは脳血流の減少または脳血管損傷がある状況で頻繁に発生することが示されている13,14。IS後の慢性的脳血管変化は、認知機能の低下およびVaDのリスクをさらに高める可能性がある15。加えて、脳卒中後の微小血管損傷、炎症反応、および慢性的神経血管機能不全が、ISとVaDの間の潜在的な生物学的関連性を提供している可能性がある。しかしながら、本MRプロトコルではこれらのメカニズムを直接的に立証することはできず、本知見は今後のメカニズム解析および臨床的検証研究と併せて解釈されるべきである。
MR-Egger推定値は統計的有意性に達しませんでした。この結果は、IVWおよび加重中央値の結果と直接的に矛盾するものとしてではなく、慎重に解釈されるべきです。MR-Eggerは、特定の形式の方向性多面発現に対してより頑健な推定値を提供できますが、通常、特に操作変数の効果が緩やかな場合には統計的検出力が低くなります。本解析において、MR-Eggerの切片は統計的に有意な方向性水平多面発現を示さず、不均一性テストでもSNP間の実質的な不均一性は認められませんでした。加えて、MR-PRESSOのグローバルテストでは、グローバル水平多面発現の根拠は示されませんでした。これらの感度分析により、測定可能な方向性またはグローバルな水平多面発現に関する懸念は軽減されますが、あらゆるバイアスの要因を排除したり、因果関係を確定させたりするものではありません。
とはいえ、これらの知見を解釈する際には、VaDの症例数が少ないことを考慮する必要があります。主要なIVW解析における事後的な推定パワーは、観察された効果量を条件として89.5%でしたが、この結果は記述的なものであり、あらかじめ規定されたサンプルサイズの正当化として解釈されるべきではありません。症例数が限られていたことで、特に効率の低い感度分析推定量の精度が低下しました。MR-Eggerにおける最小検出可能効果（80%）はOR 3.23であり、これは観察された推定値よりも大きい値でした。したがって、MR-Eggerの結果が有意でなかったことは、関連性の大きさに関する不確実性を排除するものではありません。また、これらのパワー計算は、操作変数の妥当性、サンプルの重複、表現型の不均一性、または残留水平多面発現に関連する潜在的なバイアスを解決するものではありません。
このMRワークフローの信頼性を確保するためには、いくつかの分析ステップが極めて重要です。第一に、曝露およびアウトカムのGWASデータセットを、データセットIDまたはアクセッション情報を用いて明確に特定する必要があります。第二に、独立した遺伝的操作変数を得るために、あらかじめ定義した閾値を用いてSNPの選択および連鎖不平衡（LD）クランピングを行う必要があります。第三に、弱操作変数バイアスのリスクを軽減するため、F統計量を用いて操作変数の強度を評価する必要があります。第四に、SNP-曝露およびSNP-アウトカムの推定値が同一のエフェクトアレルに対応していることを確認するため、アレルのハーモナイゼーションが不可欠です。最後に、主要な推定値が不一致なSNPエフェクト、方向性のある多面発現、または単一の支配的な遺伝的操作変数の影響を受けていないかを評価するために、異質性、水平多面発現、およびleave-one-out分析を用いる必要があります。
このワークフローにおける失敗やバイアスの一般的な原因としては、曝露に関連するSNPの不足、弱いインストゥルメント、アウトカムSNPの利用不可、曖昧なアレルアライメント、回文構造のバリアント、プロキシSNPの不一致、SNP個別の推定値間の不均一性、水平多面的作用、集団の不一致、表現型の不均一性、およびサンプル重複の可能性が挙げられます。これらの問題は、GWASデータセット識別子の確認、一貫したSNP選択およびクランピングしきい値の適用、プロキシSNP使用の記録、ハーモナイゼーション出力の検査、F統計量の要約、およびMR推定値を不均一性、多面的作用、leave-one-out解析の結果と合わせて解釈することで対処できます。相当な不均一性や多面的作用が検出された場合、主要なIVW推定値は慎重に解釈し、追加の感度分析や代替データセットの検討を行う必要があります。
サンプルの重複の可能性についても考慮する必要があります。曝露のGWASとFinnGenの結果のGWASは、どちらもヨーロッパ系祖先のリソースから得られており、利用可能な要約統計量からは、参加者の重複の程度を定量化することができませんでした。このような重複は、特にインストルメントと曝露の関連が強くない場合に、2サンプルMR推定値を観察研究における関連性に近づけるバイアスをもたらす可能性があります。代表的な結果を解釈する際には、この制限を考慮する必要があります。
従来の観察的コホート研究やケースコントロール研究と比較して、MRは妥当な操作変数法の仮定の下で、交絡および逆因果関係によるバイアスを軽減することができます。しかし、疾患の発症率、時間的パターン、および臨床的予後を推定する上では、依然として観察研究が有用です。ランダム化比較試験や実験モデルと比較して、MRは直接的な介入研究が不可能または非倫理的である場合に、既存の遺伝データを用いて潜在的な因果関係を評価できます。それでも、MRは細胞レベルのメカニズムを直接的に明らかにすることはできず、メカニズムの検証に代わるものではありません。したがって、本プロトコルは、コホート研究、横断的分析、動物モデル、および細胞実験の代替手段ではなく、それらを補完するものとして捉えるべきです。
これまでの研究では、疫学的アプローチおよび遺伝学的アプローチを用いて、血管リスク因子と認知症に関連するアウトカムが探索されてきました。例えば、過去の臨床研究や人口ベースの研究において、糖尿病および高血圧が認知症のリスクに関連していることが示されています16。既存のメンデルランダム化（MR）に基づく研究でも、虚血性脳卒中（IS）、血管性認知症（VaD）、およびそれらに関連する併存疾患のメカニズムが調査されています。本稿は、主要な目的においてこれらの研究とは異なります。本記事では、新たな分子標的の同定や疾患メカニズムの実験的な検証を目指すのではなく、公開されているGWASサマリー統計量を用いて2サンプルMR解析を行うための、再現可能なプロトコルを提示することに焦点を当てています。
本プロトコルにはいくつかの限界があります。第一に、解析は公開されているGWASサマリー統計量に基づいているため、結果が非ヨーロッパ系集団や、異なるケース定義を持つデータセットに完全に一般化できるとは限りません。第二に、SNP選択の閾値を緩和したことで（p < 5 × 10-6）を用いて、感度分析に十分な数の独立した操作変数（instrument）を保持した。保持されたすべての操作変数のF統計量は >10というこの閾値は、従来のゲノムワイドな有意水準よりも緩やかであり、曝露との関連性が弱い、あるいは堅牢性に欠けるバリアントが含まれている可能性があります。したがって、代表的な知見は因果関係の決定的な証拠ではなく、探索的かつ示唆的なものとして解釈されるべきです。第三に、メンデルランダム化（MR）は交絡や逆因果バイアスを低減させることができますが、水平多面発現、表現型の誤分類、サンプルの重複、または不適切な操作変数によって導入されるバイアスを完全に排除することはできません。第四に、MR-Egger推定値が有意でないことは、因果関係の解釈に慎重であるべきであることを示しています。第五に、本プロトコルには細胞実験、動物モデル、または独立したコホートによる検証が含まれていません。生物学的メカニズムの解明および臨床的適用性を明らかにするには、これらのアプローチが有用であると考えられます。
さらに、ISは全体の表現型としてモデル化されました。この代表的なプロトコルは、いかなる関連性が大動脈 atherosclerosis 脳卒中、小血管閉塞、心原性塞栓性脳卒中、またはその他のサブタイプに起因するかを特定するように設計されたものではありません。したがって、結果をサブタイプ特異的な効果の証拠として解釈すべきではありません。今後の研究では、事前に規定され整合性の取れた解析計画を用いて、十分な検出力を持つサブタイプ特異的なGWASデータセットに同様のワークフローを適用すべきです。
本プロトコルの今後の応用は、ISおよびVaD以外にも広がる可能性があります。適切なGWASサマリー統計量が得られれば、同一のワークフローを適応させ、他の脳血管系、神経変性、代謝、炎症、または心血管系の曝露・アウトカム関係を評価することが可能です。また、今後の研究では、独立したGWASによる検証、双方向MR、多変数MR、媒介MR、あるいはコホートベースの根拠や実験的根拠との統合を取り入れることで、このワークフローを拡張できる可能性があります。
要約すると、本プロトコルは、公開されているGWASサマリー統計量を用いて2サンプルMR解析を行うための再現可能なワークフローを提供するものである。代表的な結果は、遺伝的に予測されたISとVaDリスクとの間に正の関連がある可能性を示唆しており、主にIVW法および加重中央値法によって支持されたが、MR-Egger推定値は統計的有意性に達しなかった。しかし、これらの知見を決定的な機序の証明として解釈すべきではない。この関連性の生物学的機序および臨床的意義をさらに明らかにするには、独立した集団ベースの検証研究および実験的な調査が必要である。
開示事項
著者らは、競合する金銭的利益がないことを宣言します。本稿の執筆、編集、および準備において、人工知能（AI）または大規模言語モデル（LLM）ツールは使用されていません。
謝辞
著者は本研究に関して特定の資金提供を受けていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| FinnGen GWASデータセット | FinnGen | finn-b-F5_VASCDEM | 血管性認知症のアウトカムソースとして使用された公開GWASデータセット |
| IEU OpenGWASデータベース | ブリストル大学 MRC 統合疫学ユニット | ebi-a-GCST90018864 | 虚血性脳卒中の曝露ソースとして使用された公開GWASデータセット |
| Rソフトウェア | R Foundation for Statistical Computing | 該当なし | MR解析に使用される統計ソフトウェア |
| RStudio | Posit Software, PBC | 該当なし | Rスクリプトの実行に使用される統合開発環境 |
| TwoSampleMRパッケージ | ブリストル大学 MRC 統合疫学ユニット | 該当なし | 器具の抽出、ハーモナイゼーション、メンデルランダム化（MR）分析、および感度分析に使用されるRパッケージ |
| MRPRESSOパッケージ | CRAN | バージョン 1.0 | 全般的水平多面発現および潜在的な外れ値インストゥルメントを評価するために使用されるRパッケージ |
| writexlパッケージ | CRAN | 該当なし | 結果テーブルをxlsxファイルとして書き出すために使用したRパッケージ |
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