方法論記事

修正ハルス手法を用いた膝変形性関節症のマウスモデルを確立する外科的手法

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DOI：

10.3791/70379

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2026年5月15日

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education (Shanghai University of Traditional Chinese Medicine), 4School of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、修正されたハルスモデルの洗練された手術手順を概説し、実験的変形性関節症を誘発するための標準化され再現可能な方法を提供します。

要約

膝関節症(KOA)は、関節軟骨変性、軟骨下骨の再形成、骨の形成、そして最も一般的な変形性関節症の一種である滑膜炎を特徴とする慢性変性関節疾患です。

このプロトコルは、修正されたハルス手技を用いて膝の変形性関節症のマウスモデルを構築する外科的手法を提示します。内側半月板不安定化(DMM)や前十字靭帯切断(ACLT)などの注射誘導または従来型外科モデルと比較して、修正ハルスモデルはより早期に疾患の発症とより重度の関節炎症を誘発します。内側側副靭帯、内側半月板、前十字靭帯を切断することで、膝関節の機械的アライメントを乱し、OAの進行を促進します。このモデルは急性OA病理の研究や治療介入の可能性を評価するのに特に適しています。関節炎の重症度を評価するために、小動物超音波と関節腔の三次元(3D)再建を組み合わせて体積を定量化し、滑液の蓄積を評価しました。さらに、組織学的切片のサフラニン-O/速緑染色を骨関節症研究学会(OARSI)のスコアリングとして軟骨破壊評価を行いました。

概要

膝の変形性関節症(OA)は、臨床的に特徴づけられる、膝周辺の痛み、こわばり、可動域の制限、筋力低下を特徴とする、一般的で慢性的な変性関節疾患です。女性の方が男性よりも高いです。十分にコントロールされない場合、OAは進行性の身体能力喪失、睡眠障害、慢性疲労、そして最終的には障害を引き起こす可能性があります。世界の人口が高齢化する中、膝のOAの発生率は増加し続けており、世界中の医療システムや経済に大きな課題をもたらしています1,2。

病態生理学的には、軟骨の喪失がOAの中心的特徴であり、関節全体および関節周囲組織の構造的および機能的障害を伴います。疾患のメカニズムを解明し治療的介入を評価するために、ヒトOAの重要な側面を再現するさまざまな動物モデルが開発されています。これらの中でも、外科的誘発モデルが最も頻繁に用いられています。例えば、内側半月板(DMM)3の不安定化や前十字靭帯切断(ACLT)4は、正常な関節構造を乱し、軟骨変性やOA様変化を引き起こします。あるいは、化学モデルは細胞外マトリックスを分解する薬剤(例:コラーゲナーゼやヨード酢酸ナトリウム)を関節内注入し、軟骨細胞の急速な死や軟骨の侵食を引き起こすこともあります。注射モデルは通常数週間以内に終末病理を達成しますが、外科モデルは一般的により長い期間を要します。

利用可能な手術技術の中で、OA7の発症が加速したHulthモデルを選び、さらに改良しました。前十字靭帯および後十字靭帯の切断と内側側副靭帯切除および全内側半月板切除術を組み合わせることで、このモデルは重度で急速に進行する軟骨損傷および軟骨下骨の変異を確実に誘発します。構造的関節不全までの短い期間から修正されたハルスモデルは急性または亜急性のOA研究に特に適しており、最適化されたプロトコルが将来の前臨床研究において実用的かつ再現性の高いプラットフォームを提供することを提案します。

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プロトコル

すべての実験手順は上海中医薬大学動物倫理委員会の承認を受けています。生後6〜8週、体重約20gの雄C57BL/6マウスは商業ベンダーから購入されました( 材料表参照)(倫理承認番号:PZSHUTCM2312210005)。

1. 術前ケア

  1. 手術の少なくとも1週間はマウスが慣れるまで待ってください。
  2. 手術前にはすべての手術器具を滅菌し、手術スペースを消毒してください。
  3. ガス麻酔装置を起動し、マウスを誘導チャンバーに5分間置き、2〜3%のイソフルランを使って全身麻酔を開始します。
    注意:酸素流量を0.5 NL/minから1 NL/minの間で維持してください。
  4. 麻酔後、マウスを手術用プラットフォームに移し、麻酔マスクを装着した1-1.5%イソフルラン(1-1.5%)を用いて手術終了まで麻酔を維持します。
  5. マウスを仰向けにし、膝関節を上向きにして安定性を確保し、手術部位への適切なアクセスを確保します。
  6. 反射がないか確認して麻酔の深さを確認し、脱毛クリームを塗布して膝関節周辺の毛を完全に除去します。
  7. 残留クリームはガーゼや綿棒で慎重に取り除き、露出した皮膚を75%エタノールで消毒し、その後ヨウ素ティンクで無菌状態を確保します。

2. 手術手順(図1)

  1. ネズミの後肢を伸ばし、皮膚を締めるためにトラクションをかけます。無菌手術用ブレードを使って、右膝関節の内側に0.5〜1cmの縦切開を入れます。
    注:以下に述べるすべての手術手技は、外科顕微鏡下で行われました。
  2. 皮膚を引き戻し、下部筋膜の鈍い剥離を行い、関節包を完全に露出させ、膝蓋靭帯を視覚化します。
  3. 細い注射針を用いて内側側副靭帯(MCL)の上に覆われている筋膜を探り切開します。
  4. 拡大鏡で顕微シザーを使ってMCLを横断します。
  5. 針を使って膝蓋靭帯を移して関節内空間を露出させ、内側半月板を特定します。
  6. 切断後、マイクロハサミで内側半月板靭帯(MMTL)を切断し、針で組織を優しく探査して半月板の完全な剥離と可動性を確認します。
  7. 前十字靭帯(ACL)を特定し、切断し、後十字靭帯(PCL)や外側半月板の損傷を避けるよう注意してください。これにより、通常、術後に前方引き出しの兆候が陽性となり、関節の不安定性が確認されます。
    注:引き出し検査:創傷閉鎖前に、片手で大腿骨を安定させ、もう一方の手で足首を握り、脛骨と大腿骨を垂直に保ちました。脛骨と大腿骨の間の相対的な前後位移位は手動で適用されました。観察可能な平行移動は引き出しの陽性を示し、前十字靭帯の断絶を確認しました。
  8. より重度の変形性関節症を誘発するために、前十字靭帯(ACL)と後十字靭帯(PCL)の両方を同時に切断し、内側半月板切除術(MMT)(クラシックなハルスモデルと同様)を組み合わせて行う方法があります。
    注意:このステップは任意であり、必要に応じて実行可能です。選択すれば、これは古典的なハルスモデルのモデリング手法となります。

3. 術後ケア

  1. 切開部を4-0ナイロン縫合糸で閉じ、手術部位をヨウ素ティンクで消毒します。
  2. 意識を取り戻し、正常な呼吸や運動活動が見られるまで、温度管理された温熱パッドの上に置いてください。完全に回復し、苦痛の兆候が見られなかったら、元のケージに戻してください。
  3. 手術後3〜5日間、縫合糸の強度を継続的に監視してください。縫合糸の破損が確認された場合は、マウスを再麻酔し、再縫合を行います
  4. 術後感染を防ぐため、術後最大3日間筋肉内抗生物質を投与してください。
    注:抗生物質投与は術後感染の予防のために用いられます。術後の鎮痛は実験目的によって決定されます。変形性関節症の研究では、急性期には治療効果評価の混乱を避けるために鎮痛薬の使用を控えることが多いです。
  5. 手術部位の腫れ、分泌物、局所炎症の兆候がないか毎日観察してください。
  6. 試験エンドポイントで承認されたプロトコルに従い安楽死させ、組織学的または画像診断のために膝関節を解剖します。
    注:この段階で、実験動物の過剰投与麻酔による安楽死のプロトコルを採用しました。これはマウスにペントバルビタールナトリウム溶液を腹膜内注射>100 mg/kgで投与することで達成されました。

4. OA開発の評価

  1. 安楽死前に関節の腫れを評価し、超音波検査を行い膝関節の構造変化を確認します。マウスの運動性能をロータロッドテストで評価します。
    注:マウスの超音波検査にはイソフルラン麻酔が必要です。
  2. 安楽死後は膝関節を切開し、脛骨、腓骨、大腿骨を保存しながら周囲の筋肉と筋膜を慎重に除去します。
    関節を固定し、10%エチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)溶液で少なくとも30日間脱鈣し、完全な脱炭素を確保するために週に2回溶液を交換してください。
  3. 脱硫化した膝関節をパラフィンに埋め込み、4μm8の厚さで矢状切片を準備します。
  4. 半月板がはっきり見えたら切片採取を始めてください。サフラニンOとファストグリーンで断片を染色し、軟骨や軟骨下の骨形態を観察します。OARSI9 スコアリングシステムを用いて軟骨劣化を評価します。
  5. サフラニン O-Fast グリーン染色法(市販キット使用、 材料表参照)
    1. 脱パラフィン化と再水和
      1. 切片をキシレンで3分間脱脂し、これを3回繰り返します。
      2. 残留キシレンを除去するために、段階化されたエタノール系列(100%、90%、80%)で2分ずつ再水和します。
        注意:エタノールシリーズは濃度の降順で使用する必要があります。
      3. 蒸留水で1分ほどすすいでから、短く水を抜きます。
    2. ワイガートの鉄ヘマトキシリン染色
      1. Weigertの作業用溶液をセクションに塗り、5分間ステインします。
      2. 蒸留水で1分ほどすすいでから、短く水を抜きます。
    3. 酸の分化
      1. 酸分圧液を15秒間切片に塗布します。
      2. 水で10分洗い、余分な水を抜きます。
        注:分化時間は非常に重要です。分化が長引くと緑色染色が速くなりますが、分化が不十分だとサフラニンの取り込みが弱い深い速緑染色になります
    4. 速い緑色染色
      1. 区画に速い緑色溶液を5分間塗り、軽く水切りします。
      2. 弱い酸性溶液を塗って、残った速い緑色の染みを15秒ほど落とし、軽く水を抜きます。
    5. サフラニン・O染色
      1. サフラニンO溶液をセクションに4.5分間塗布します。
      2. 過剰なサフラニンOを除去するために、90%エタノールに素早く移す。
        注意:この段階はサフラニン染色の強さに応じて適切に延長される場合があります。
    6. 脱水とクリアリング
      1. 100%エタノールで1分間脱水します。
      2. 完全に脱水するためにキシレンで切片をクリアにし、2分間、これを3回繰り返します。
        注意:この工程で使用されるキシレンは、セクション4.5.1で使用されているものと混ぜてはなりません。交差汚染はセクションの品質を損なう可能性があります。
    7. ニュートラルバルサムでの取り付け
      1. 余分なキシレンが蒸発するのを待つために、セクションをフルームフードに入れます。
      2. 断片を除去し、適量の中性バルサムを塗布し、カバースリップで慎重に覆います。
      3. 光学顕微鏡で気泡がないか解剖し、気泡を慎重に除去してください。
      4. 断片はスライドボックスに保存し、60°Cのオーブンで24時間加熱して中性バルサムの完全な硬化を確実にします。

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結果

膝関節の縦方向スキャンは、4mmのスキャンステップ、0.04mmの軸方向分解能を持つマイクロ超音波8システムを用いて実施されました。術後7日目に3D再建により、モデル群で偽グループと比べて関節腔体積が著しく増加していることが確認されました(図2A,B)。Rotarod疲労試験10,11はこの結果を裏付け、同時点でモデル群のランニング持久力の有意な低下を示しました(図2C)。

術後28日目に膝関節を採取し、矢状にパラフィンに埋め込み、4μm8で切片しました。切片はサフラニンO-Fastグリーンで染色され、OARSI組織病...

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ディスカッション

内側半月板(DMM)モデルや前十字靭帯切断(ACLT)モデルの不安定化など他の手術モデルと比較すると、修正ハルスモデルは靭帯損傷と半月板損傷の複合により変形性関節症を誘発します。特定の構造的破壊は、異なる平面にわたる関節の生体力学の変化を決定します。ACLT4 は回転安定性(内外回転)を損ない、前後安定性を低下させ、引き出しの陽性信号を引き起こします。DMM3 は内側半月板靭帯(MMTL)を破壊し、内側半月板を不安定化させ、脛大腿骨運動時の衝撃力に抵抗する能力を低下させます。さらに内側側副靭帯切除術と組み合わせて内側内回力に対する抵抗を排除します。修正されたハルスモデルは両方のアプローチからの生体力学的変化を取り入れ、より急速かつ重度の関節軟骨破壊をもたらします。内側半月板切除術(MMT)12 モデルは、古典的なハルス手術の重要な構成要素であり、内側半月板を完全に除去し、内側区画全体に不均一な応力分布を生み出し、関節表面の摩擦に...

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開示事項

著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。

謝辞

本研究は上海の科学技術イノベーション行動計画(23YF1447900からCJM)、上海教育発展基金の成光プログラムおよび上海市教育委員会の資金提供を受けました(23CGA53からCJM)、および中国国家自然科学基金(U24A6013からXHへの資金提供)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1mL注射注射器//仕様:30Gおよび時間;0.13 mm
3D超音波Vevo 3100イメージングシステム光学ヴェヴォ2100データ解析用のVevo LABソフトウェアと統合された高周波超音波イメージングシステムです。
4-0ナイロン縫合糸//
75%エタノール上海タイタン科学有限公司G73537O
C57BL/6Jオスマウス(生後6〜8週間)上海解世街実験動物有限公司/
除毛クリームヴェートロット:C021123001
ヨウ素滴剤//
イソフルランRWD R650-IE
マイクロ鉗子RWD F12013-10
マイクロシザーズRWD S11035-08
改良型サフラニンOおよびファストグリーンステインキットソーラービオG1371
ニードルホルダーRWD F21001-12
サージカルブレード(10#)RWD S31010-01
外科用顕微鏡オリンポスSZ61

参考文献

  1. Sharma, L. Osteoarthritis of the Knee. N Engl J Med. 384 (1), 51-59 (2021).
  2. Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Res. 5, 16044(2017).
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  4. Zhou, X., et al. Antioxidant taurine inhibits chondrocyte ferroptosis through upregulation of OGT/Gpx4 signaling in osteoarthritis induced by anterior cruciate ligament transection. J Adv Res. 77, 551-567 (2025).
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