研究記事

マウス副腎皮質からのゾーン強化一次培養の確立

DOI：

10.3791/70403

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2026年5月8日

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1Division of Endocrinology, Boston Children's Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 3Harvard Stem Cell Institute, 4Institute of Biomedical Science, University of São Paulo, 5Broad Institute of MIT and Harvard

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マウス副腎皮質に対して、ゾナ・グロメルローサおよびゾナ・ファシキュラータ富む細胞の2次元一次培養を確立するための堅牢かつ再現性の高いアプローチが開発されました。このシステムは各ゾーンの主要な分子および機能的特徴を保存し、シグナル伝達経路、ホルモン産生、副腎皮質細胞の行動をアウト ビブで集中的に調査することを可能にします。

要約

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マウスの副腎は間葉細胞層(カプセル)によって包覆されており、その下に専門的な内分泌機能を持つ明確な同心円状の領域に組織された皮質があります。すなわち、アルドステロンを産生する糸球体帯(zG)とコルチコステロンを産生する束帯(zF)です。腺の中心にある副腎延髄はカテコールアミンを産生します。各副腎皮質帯の細胞の機構的研究は、その領域特異的な分子、細胞、機能的特徴を保存する in vitro モデルの存在により制限されています。この制約を克服するために、成マウス副腎の顕微解剖を用いた分割法が開発されました。この方法は、雄マウスから副腎細胞を、カプセル細胞とzG細胞を含むzG富む外側画分(OF)と、zFと髄質細胞を含むzF富む内側画分(IF)に分離します。これらの分画はzGまたはzF細胞の2次元(2D)一次培養を合成するために用いられました。遺伝子発現解析により、zG豊か培養はzGマーカー(Cyp11b2、 Dab2、 Shh)が高く発現し、Wnt/βカテニン経路マーカー(Wnt4、 Lef1)も増加することが確認されました。対照的に、zF豊富な培養はzFマーカー(Cyp11b1 および Akr1b7)の発現が高く、Wnt/β-カテニン経路マーカーのレベルが低いことが示され、zF転写署名と一致しました。ステロイドゲンマーカー(Nr5a1、 スター)の発現により、両細胞分画の副腎皮質起源が検証されました。チロシンヒドロキシラーゼはzF濃縮培養中の副腎髄質細胞の存在を示します。機能的には、zGリッチ培養は基礎条件下でアルドステロンを産生し、アンジオテンシンII、カリウム、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)に反応して産生の増加を示しました。逆に、zFリッチ培養はベースラインでコルチコステロンを産生し、ACTH刺激に対して出力が増加しました。全体として、このプロトコルは副腎皮質の生物学研究において、堅牢で再現性が高く生物学的に関連性の高い in vitro モデルを示しています。このシステムは、シグナル伝達経路、分子機構、生理学的応答のゾーン特異的調査を可能にします。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マウスの副腎は薄い間葉包を包み込み、副腎は外皮質と内延髄の2つの主要な区画から成ります。成体のオスの副腎皮質はさらに、球球体帯(zG)と束帯(zF)に分けられ、それぞれ独自の形態的・機能的特徴1,2,3,4があります。副腎皮質の主な機能は、ミネラルコルチコイド(アルドステロン)やグルココルチコイド(マウスではコルチコステロン)を含むステロイドホルモンの産生です5。zGは最も外側で最もコンパクトな領域であり、ロゼット構造に組織された卵状細胞からなり、アルドステロン合成酵素(CYP11B2)を発現し、アルドステロン2,3,5,6,7の産生を可能にします。アルドステロンの分泌は主にレニン-アンジオテンシン-アルドステロン系(RAAS)、カリウム、そしてやや軽いもののACTH5,8によって調節されます。zFは橈骨索/束状に配列された大きな細胞で構成され、皮質の大部分(~85%)を占め、主にACTH 2,3,5,9によって調節されています。複数のシグナル伝達経路が、前身細胞の動態、帯状形成、ステロイドゲン活性を調節することで副腎の発達、維持、機能を調整します。その中でも、SF-1(ステロイドゲン因子-1、Nr5a1)は副腎皮質の調節、増殖、ホルモン生成に不可欠なマスターレギュレーターです。zGで活性化するソニックヘッジホッグ(Shh)シグナル伝達は、前駆細胞の増殖を促進し、zG 11,12,13における皮質の更新を支えます。

Wntシグナル伝達、特に標準的なβカテニン経路を通じて、副腎ゾーションと皮質の完全性に不可欠です。マウスでは、正常な副腎皮質の大きさと帯状は、嚢からzFにかけて広がるWNTシグナル伝達活動の勾配によって調節されています。この勾配は、主にzGのWNT4、カプセル7,14,15,16,17,18,19、20、21、22のWNT2BおよびR-スポンディンズ(RSPO1および/またはRSPO3)の局所的発現によって支持されています.副腎皮質は、サブカプセル/外側zG領域に位置する増殖前体細胞からの細胞の向心力によって維持されており、これらの細胞は分化したzG細胞を生じさせ、zFに向かって内側へ移動します。細胞がzGからzFへ移行する際に、遺伝子発現や機能に変化が生じ、これをトランス分化と呼びます。このモデルは、zG 23,24,25のアルドステロン産生細胞を標的とするASCre/+トランスジェニックマウス系統を用いた系統追跡研究によって強く支持されています。

副腎全体の解離に基づく副腎生物学の研究には、いくつかのin vitroアプローチが用いられています。例えば、電気生理学的およびパッチクランプ解析のための副腎皮質の解離を記述した研究27、また別の研究では、解離した副腎皮質細胞を用いて副腎生理学と血圧調節に関連するシグナル伝達機構を調査した26。これらの手法は重要な機能的洞察を提供してきましたが、細胞培養前の皮質帯の分離ではなく、副腎全体の調製から得られる細胞に依存しています。

副腎の複雑さと組織学的多様性を考えると、その細胞区画の異なる役割を理解することは、副腎機能のメカニズムを解明するために不可欠です。本研究では、zGまたはzF細胞を濃縮した一次マウス副腎皮質細胞培養を確立しました。この手法の主な利点は、zGリッチ細胞培養を生成できることであり、シグナル伝達経路や環境要因の実験的調節により、副腎皮質生物学におけるその特有の役割をよりよく調査できる点です。これには前駆細胞の維持、帯状可塑性とzFへのトランス分化のメカニズム、細胞外マトリックス組成のモデリングが含まれます。同時に、この方法は高濃度のzF細胞培養を生成し、領域特異的な機能解析やシグナル伝達研究のための補完的なプラットフォームを提供します。これらの特徴が組み合わさることで、副腎生物学の理解を深めるための強固で実験的に制御されたシステムが形成されています。

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プロトコル

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すべての実験は、ボストン小児病院施設動物ケア・利用委員会(IACUC)が承認したプロトコル(承認番号00002611のもとで実施されました。このプロトコルで使用されるすべての材料(試薬、消耗品、機器を含む)の完全なリストは、材料 表に記載されており、対応する製造者やカタログ番号も記載されており、再現性を確保しています。

マウス副腎帯糸球体細胞および帯束細胞の一次培養
本研究で用いられた野生型(Mus musculus, C57BL/6)アドレノ皮質細胞の一次培養方法は、スプラグ・ドーリーラット向けに開発された手法を応用したものです。帯球体症および斑斑帯細胞群の分離と同定を確認するため、Cyp11b2tm1.1(cre)Brlt/+(別名Cre)マウス1,2,3,4およびGt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP)Luo/J(別名ROSAmT/mG)マウス29を用いて系統追跡モデルを用いました。

手術前の準備
材料
浅い切開には2セットの鉗子とハサミ、腹腔の切開にはもう1セット(補足図1A)を用意しました。培地とPBS(37°C)を温めました。DMEM/F-12で2料理(P60)を用意しました。温めたPBSで3皿(P60)を準備し、腺を順番に洗浄(浴槽1、2、3)(補足図1B、1–3)、副腎を溶液中に保つための皿1皿(補足図1B、4)。表面に滅菌フィルターペーパーを敷いて2皿(P60)を準備しました(補足図1C、1–2)。500μLの消化液でP60皿を2個準備し、糸球体(zG)または束(zF)にラベルを付けました(補足図1D、zG、zF)。2本のチューブを準備し、zGとzFにラベル付けし、消化液4.5mLを加えました。

解決策
消化液を作るために、コラーゲナーゼI型(最終濃度4 mg/mL)およびDNase I(最終濃度0.04 mg/mL)を5 mLの純粋なDMEM/F-12培地に溶解しました。 シリンジと0.22μMフィルターを使って溶液を50mLのチューブにろ過しました。消化液は毎回新鮮に準備してください。

動物
マウス副腎帯糸球体細胞および帯束細胞の一次培養を得るために、生後約6〜7週の若年成体オスマウス10〜15匹を使用します。女性は男性よりやや大きな副腎を持ち、このプロトコルではどちらの性別でも使用可能です。しかし、本研究では若いメスに存在するXゾーンからの干渉を避けるため、オスのみを使用し、正確なゾーン分離を確保しました。マウスは施設の動物管理ガイドラインに従いCO₂吸入で安楽死されました。呼吸の欠如と反射反応の欠如により死亡が確認されました。副腎は死亡確認後3〜5分以内に即座に剥離され、組織の生存能力を保った。

腹部の位置と露出
マウスは無菌の平らな表面に背側デキュービトゥス姿勢で置かれました(図1A)。動物の毛は70%アルコールで消毒されました。皮膚切開には鉗子とハサミが使用され、腹腔切開には2セット目が使われました。腹部の鼠径部に最初の切開が行われ、両側から胸部に向かって外側に伸びて腹膜を露出させました(図1B)。皮膚は慎重に引き戻され、その後腹部筋が引き戻され、腹腔が露出しました(図1C)。最初の切開は内臓への損傷を避けるために浅いものにすべきです。慎重に切開して筋肉層に進み、その後腹部を露出させます。出血は副腎の位置を捉えにくくし、血管の収集を遅らせる可能性があるため、血管破裂を避けることが重要です。微生物汚染を最小限に抑えるために手術器具を交換しましょう。

左副腎の同定と採取
左副腎は左腎臓の内側、上方、腹膜後部に位置し、楕円形でピンク色をしており、白い脂肪組織に囲まれています(図1D–G)。視覚化を助けるために鈍い鉗子で隣接する臓器を慎重に置き、ハサミを使って短く制御された切断でほとんどの脂肪組織を取り出し、副腎を隔離します。副腎を直接掴むのは避けて、カプセルの損傷を防ぎましょう。分離直後、腺はP60培養皿に37°Cで10 mLの予熱済みDMEM/F-12を投与しました(図1F)。

右副腎の同定と採取
右副腎は後腹膜の右腎の外側、上方に位置し、楕円形でピンク色をしています(図1E–H)。この副腎は肝臓や上行結腸、さらには近接する血管に近接しているため、識別がより困難になることがあります。視覚化を良くするために鈍い鉗子で隣接する臓器を慎重に取り除きつつ、ハサミを使って短く制御された切断でほとんどの脂肪組織を取り除き、副腎を隔離しつつ、カプセルを損傷しないように注意してください。分離直後、腺はP60培養皿に10mLの予温DMEM/F-12を37°Cで投与しました。 副腎は同じ皿にまとめられています(図1F)。処置中は、誤って切開し出血や採集を複雑にする可能性のある誤って切開を避けるため、その部位の主要な血管を慎重に扱うことが不可欠です。注意すべき主な血管は腎静脈と腎動脈です。副腎と付着脂肪組織を採取しました。これにより腺の取り扱いが容易になり、カプセルの損傷や汚染から守られます(図1I)。

無菌層流フードでの作業
腺をラミナーフローフードに移す前に、皿は70%アルコールで拭き取られました。副腎は室温(25°C)でPBSで3回洗浄されました(皿1、2、3、皿4で採取)(補足図1B)。フィルターペーパーは脂肪の付着を助け、より良い結果をもたらします。複数の腺を準備する際は、分離された組織を事前に加熱したDMEM内に保持し、生存能力を保つ必要があります。副腎は付着する脂肪組織に掴まれ(図1I–J)、脂肪はフィルターペーパー上で慎重に解剖されました(補足図1C、皿1)。細かい鉗子と制御された動きを用いてカプセルを損傷させないようにしました。期待される結果は、図1Kに示されるように、過剰な脂肪や結合組織のない滑らかで完全な腺体です。副腎は慎重に新しいフィルターペーパーに移され(補足図1C、皿2)、精密な微細解剖が可能になりました。カプセルは細かい鉗子で優しくつまみ、メスの刃を使って組織を完全に切断せずに腺に橈骨切開を行いました。

皮質の内部内容物は、鉗子でわずかな機械的圧力を加えて切開部から外側に排出することで優しく露出させました。カプセルとzGは鉗子の先端に繋がったままで、内側から排出された腺物質はzFと延髄に対応していました。酵素的消化は、外側と内側の領域が機械的に分離するため、すべての腺が処理された後にのみ開始されるべきです(図1L)。

消化
2本のチューブはOF(外側画幅:カプセルおよびzG)またはIF(内側画幅:zFおよび延髄)とラベル付けされていました(図1M)。予備加温消化液4.5mL(37°C)を加え、適切なチューブにOFとIFを移管しました。サンプルは37°Cで5%のCO₂を含んだ加湿インキュベーターで30分間培養され、チューブは10分ごとに優しく渦巻き、手動で2〜3回反転させて酵素溶液に均一に曝露させました。消化に必要な時間は、コラーゲン酵素の質、活性、保存条件によって異なります。 30分後、5mLの血清学ピペットを用いて、ゆっくりと制御されたストロークで40回上下にピペットを動かし、単一細胞スラリーを生成して組織を解離させました。組織の解離後、理想的には目に見える断片は残らず、培地は濁って見えるべきです。もし残留物が残っている場合は、さらに15分間の消化が検討されることがあります。

洗浄とメッキ
消化後、残留酵素を除去するために45 mLのDMEM/F-12を加えて細胞を洗浄しました(図1 M)。サンプルは150× g で室温(25°C)で12分間遠心分離されました。遠心分離後、小さくてコンパクトなペレットがややピンクから淡い黄色の外観をしていることが期待されますが、上澄液は透明で目に見える粒子が残らない状態が求められます。上澄液は慎重に取り除かれ、ペレットを乱さないように注意しながら捨てられた。ペレットは、メッティングに必要な最終体積に応じて、予備加熱(37°C)の培養培地に再懸浮させられました(後述)。培養の活性性と活力を確保するために、最適なプレート密度は約70%に維持されました。細胞数はプレート化前にノイバウアー計数室で推定され、培養皿の面積に応じてシードされた細胞数を調整して望ましい合流度を得ました。zG濃縮外側分画(OF)セルは、1ウェルあたり約1匹の動物密度で(通常は10個の4 セルを産出~1.5–2.5個×)、zF濃縮内側分画(IF)セルを1ウェルあたり約0.63個の動物で培育します(通常は10個の4 セルを産出する~2.5〜4.0個×)。

細胞培養維持
細胞は上記の培養培地で培養され、標準条件下で加湿インキュベーターの37°C、5% CO₂で維持されました。培養24時間後、遺物や残留血球を除去するために培地を交換しました。このステップは最適な成長を促進します。プレートは慎重に吸気され、新鮮な予温(37°C)培地が追加されました。機能実験で細胞を評価する前に少なくとも48時間待つべきです。培養がしっかり定着していることを確認するため、機能実験を行う前に3日間待つことが推奨されます。この期間を過ぎた長期培養はトリプシン化やパッセージングを必要とし、細胞選択や一次培養特性の喪失につながることがあります。

データ分析および支援手順
一次副腎細胞培養の調製
全副腎の一次培養は、組織採取、消化、洗浄、プレート剥製の同じ手順で確立され、分子および機能的アッセイの標準的な対照群として用いられました。

遺伝子発現解析
OFおよびIF細胞から全RNAを精製するため、製造元のプロトコルに従い、培養細胞はRNAキットを用いてTRIReagentで均質化されました。RNAの完全性と濃度は分光測定法を用いて評価されました。全RNAのさらなる処理では、高容量cDNA逆転写キットを用いて逆転写をcDNAに変換しました。遺伝子発現解析はサーモサイクラーを用いたリアルタイム定量PCR(qPCR)によって行われました。変動を制御するために技術的複製が使用されました。TaqManユニバーサルPCRマスターミックスとマウスTaqManプライマーが使用されました(表1)。各サンプルを重複実行する際、線形増幅範囲内でサイクル閾値(CT)値を選択しました。これは内因性コントロール遺伝子 βアクチン およびリボソームタンパク質18S(Rps18)によって正規化されました。相対発現レベルは2–ΔΔCt 法30を用いて算出されました。3つの異なる実験のデータは平均±標準偏差(SD)として提示されます。私たちは3つの独立した実験を行いました。

一次ZGおよびZF培養におけるアルドステロンおよびコルチコステロン分泌の刺激
ゾナグロメローサ(ZG)およびゾナ・ファシキュラータ(ZF)細胞の一次培養を37°Cで、5%のCO₂を含む加湿大気で維持しました。48ウェルの培地を用いて、1ウェルあたり約5×10個の4 細胞をプレートにプレートしました。4日間の連続培養後、基礎分泌測定はこの期間の累積ホルモン産生を反映しました。刺激アッセイでは培地を吸引し、残留因子を除去するためにリン酸緩衝生食塩水(PBS)で細胞を一度洗浄しました。その後、各ウェルに200μLの新鮮培地が追加され、以下のアッセイは定められた時間域内の急性刺激分泌を示しています。アルドステロン刺激アッセイでは、培養培地にアンジオテンシンII(Ang II、10 nM)、カリウム(K+)、塩化カリウム(KCl、10 mM)、およびACTH(10 nM)を補足しました。車両制御には塩化ナトリウム(NaCl、10 mM)が使用されました。コルチコステロン刺激アッセイでは同じ手順が適用されましたが、媒介剤にはACTH(10 nM)、フォルスコリン(10 μM)、またはNaCl(10 mM)が補完され、37°C、5% CO₂で6時間の培養後、培養上清液は−80°Cで収集・保存され、前述のホルモン定量のために保管されました。残った付着細胞はタンパク質抽出のために溶解され、ホルモンレベルは対応する溶解液の総タンパク質量に正規化されました。

アルドステロンおよびコルチコステロン測定値のタンパク質抽出と正規化
タンパク質抽出はRIPA溶解および抽出バッファーを使用し、1倍の停止プロテアーゼ阻害剤カクテルを補足しました。細胞はP200ピペットチップでピペットで15回上下に再懸浮させ、その後プローブソニケーターで超音波測定を行いました。タンパク質濃度は製造元の指示に従ってBCAタンパク質アッセイキットで測定されました。

放射線免疫測定法(RIA)によるアルドステロン測定
細胞培養上清液中のアルドステロン濃度は製造元のプロトコルに従って測定されました。簡単に言えば、PBS中の上澄液50μLと1%BSA150μL、さらにアルドステロン放射性トレーサー500μLをアルドステロン抗体被覆チューブに加えました。混合後、チューブは室温(25°C)で18時間培養されました。その後、培養混合物をデカントし、コブラIIのオートガンマカウンター31で管内の放射能を計数しました。アルドステロンレベルは前述の通り総タンパク質に正規化されました。

コルチコステロン測定
細胞培養上清液中のコルチコステロン濃度は、製造元のプロトコルに従い、マウスおよびラットコルチコステロン専用の競合酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キットを用いて測定されました。コルチコステロンのレベルは、前述の通り総タンパク質に正規化されました。

免疫染色
免疫蛍光は、パラフィン埋め込み副腎切片およびポリL-リジンでコーティングされた事前処理ガラスカバースリップ上で培養された細胞の両方に対して実施されました。すべてのサンプルに対して、PBS中の5%正常ヤギ血清(NGS)でブロッキングを行い、核はDAPI(4′、6-ジアミジノ-2-フェニリンドール、1:1000)で染色されました。スライドとカバースリップは、培養間にPBSで0.1%のTween-20を含み、それぞれ5分間3回洗浄しました。染色後、サンプルはアンチフェードマウントでマウントされ、暗闇で保管され、イメージングが行われるまで保管されました。組織切片:副腎パラフィン切片はキシレンで脱脂され、その後段階化されたエタノール系列(100%、95%、70%)で洗浄され、最後にPBSで洗浄されました。抗原回収はTris-EDTAバッファー(10 mM Tris塩基、1 mM EDTA、0.05% Tween-20、pH 9.0)で95°Cで20分間加熱して行われました。室温まで冷却した後、区画をPBSで洗浄し、5%NGSで1時間ブロッキングしました。切片は4°Cで1:100希釈され、5%NGSで1:100希釈された一次抗体をPBSで培養しました:マウス抗Dab2、鶏抗GFP、ウサギ抗RFP。使用された二次抗体は1:300:Alexa Fluor 594 ヤギ抗マウスIgG、Alexa Fluor 594 ヤギ抗鶏IgY、Alexa Fluor 647 ヤギ抗ウサギIgG。

培養細胞:プレート付けから4日後にカバースリップの免疫蛍光検査を実施しました。細胞は事前に温めた4%パラホルムアルデヒド(PFA)で37°Cで15分間固定され、PBSで3回洗浄されました。ブロッキングは、室温で1時間PBS中に5%NGSを用いて実施されました。カバースリップは4°Cでマウス抗Dab2(1:100、5% NGS/PBS)と一晩培養し、その後Alexa Fluor 488ヤギ抗マウス(1:500)を投与しました。

画像取得:培養細胞の明視野および蛍光画像(mGFPおよびmTomato)を顕微鏡システムを用いて取得しました。mGFP蛍光は緑色蛍光用フィルターセット(励起度:470 nM、放出度:525 nM)で捕捉し、mTomato蛍光は赤色蛍光用フィルターセット(励起度:585 nM、放出:624 nM)で捕捉しました。

ソフトウェアおよび統計分析
視覚的な要約、概略図、図はAdobe Illustrator 2023(Adobe Inc., https://www.adobe.com/products/illustrator.html)およびBioRender(https://www.biorender.com)を使用して作成され、2025年5月にアクセスされました。データはGraphPad Prismバージョン10.0を用いて解析されました。入手可能:https://www.graphpad.com。すべての実験は少なくとも三重に行われ、結果の再現性を確保するために独立して繰り返し行われました。2つのグループ間の比較には、学生のt検定(ペアまたは非ペア、適宜)が用いられました。3つ以上のグループを比較する場合、分散分析(ANOVA)と適切な事後検査を実施し、グループ間の有意な差異を特定しました。結果は平均標準差±表示されます。p値が0.05未満であれば統計的に有意とされました。

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結果

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ゾーン濃縮一次副腎細胞培養の確立と特徴づけ
一次副腎細胞培養は、zG細胞に濃縮されたOFとzF細胞に濃縮されたIFから成功裏に確立されました。培養細胞の代表的な画像は図2A(OF–zG)および図2B(IF–zF)に示されています。これらの培養におけるzG細胞および非zG細胞の濃縮を評価するために、ASCre/+:: ROSAmTmG/+マウスモデルが用いられました(図2C)。これらのマウスでは、Cyp11b2プロモーターによって駆動されるCreリコンビナーゼが、生後5〜6週間の動物のzG細胞で特異的にmGFP発現を誘導します(図2C、S2A–C)。生細胞蛍光イメージングでは、mGFP発現は主にzGリッチ培養で見られました(図2D–I

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ディスカッション

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本研究では、zG(OF)およびzF(IF)細胞を濃縮した一次マウス副腎細胞培養を生成する洗練されたプロトコルが提示され、各ゾーンのゾーン同定とステロイドゲン機能を忠実に再現しました。このプロトコルは、副腎皮質の細胞および分子生物学をゾーン特異的な文脈で詳細に調査し、タンパク質、シグナル伝達経路、副腎皮質の発達、分化、機能、更新に関与するメカニズムの研究を支援し、特に外側部分における他の組織区画からの干渉を軽減することを目的としています。2次元(2D)マウスの一次副腎細胞培養は、zG細胞に濃縮されたOFおよびzF細胞に濃縮されたIFから抽出されました。分子的特徴解析により、これらの培養物の異なる細胞組成が確認され、機能的アッセイではゾーン特異的なホルモン産生と生理刺激への応答が示されました。

本研究で用いられた一次培養の確立およびOFとIF33の分離および一次培養の手法は、スプラグ・ドーリーラット28のMus mu...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、この研究に関して競合する財政的利益は一切ないと述べています。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、FAPESP(サンパウロ研究財団、ブラジル)、プロジェクト番号2024/14165–6(BEPE – JLK)、FAPESP: 2020/02988–7(C.F.P.L)、および2R01DK123694(DTB)およびボストン小児病院内分泌部門(DTB)からの資金提供を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
コニカルチューブ（50 mL ）Corning (Corning, NY, USA)352070滅菌済み
0.22 µm シリンジフィルターMilliporeSigma (Burlington, MA, USA)SLGV033RS消化液濾過
10 mL 使い捨てシリンジBD Plastipak (Franklin Lakes, NJ, USA)300912滅菌済み
5 mL 血清学的ピペットCorning (Corning, NY, USA)4487滅菌済み
10 mL 血清学的ピペットCorning (Corning, NY, USA)4488滅菌済み
フィルター付きピペットチップ（P200）Axygen (Union City, CA, USA)TF-200-R-S滅菌済み
フィルター付きピペットチップ（P1000）Axygen (Union City, CA, USA)TF-1000-R-S滅菌済み
P60 培養皿Corning (Corning, NY, USA)430166組織培養処理済み
48ウェルプレートCorning (Corning, NY, USA)3527組織培養処理済み
滅菌済みフィルターペーパーN/AN/A脂肪除去と解剖支援
DMEM/F-12 培養液Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)113200331:1 配合
胎児ウシ血清（FBS）Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)10082147熱不活化
ITS サプリメントGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)41400045100X
GlutaMAX サプリメントGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)35050061100X
ペニシリン-ストレプトマイシン（100X）Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)15140122抗生物質
PBS 1XGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)10010023pH 7.4
コラーゲナーゼ Type IGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)17100-017組織消化
DNase ISigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)DN25-1組織消化
アンジオテンシン II（Ang II）Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)A9525ホルモン刺激
副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)A0298ホルモン刺激
フォルスコリンSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)F6886cAMP刺激
塩化カリウム（KCl）Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)P9541アルドステロン刺激
塩化ナトリウム（NaCl）Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)S7653車両制御
小型手術用ハサミFine Science Tools (Foster City, CA, USA)14060-09解剖
使い捨てブレード付きスカルペルFine Science Tools (Foster City, CA, USA)10003-12マイクロ解剖
細い鉗子Fine Science Tools (Foster City, CA, USA)11252-00解剖
湾曲鉗子Fine Science Tools (Foster City, CA, USA)11251-10解剖
層流フードThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/A滅菌済みの組織処理
インキュベーターThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/A細胞培養
遠心分離機Eppendorf (Hamburg, Germany)N/A細胞ペレティング
ノイバウアー計数チャンバーHausser Scientific (Horsham, PA, USA)1490細胞計数
RIPA 溶解・抽出バッファーThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)89901タンパク質抽出
Halt プロテアーゼ阻害剤コクテルThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)87786タンパク質抽出
Fisherbrand Model 120 ソニック解体器Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)FB120ソニケーション
RIA システムTecan (Männedorf, Switzerland)MG13051ホルモン定量
Cobra II オートガンマカウンターBerthold Technologies (Bad Wildbad, Germany)N/A放射性測定
コルチコステロン ELISA キット（96ウェル）Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)55-CORMS-E01ホルモン測定
ProLong Gold Antifade マウント液Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)P36930マウンティング媒体
Mouse anti-Dab2BD Biosciences (San Jose, CA, USA)610464一次抗体
Chicken anti-GFPAves Labs (Tigard, OR, USA)GFP-1020一次抗体
Rabbit anti-RFPRockland Immunochemicals (Limerick, PA, USA)600-401-379一次抗体
Alexa Fluor 594 ウマ anti-MouseInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-11005二次抗体
Alexa Fluor 594 ウマ anti-ChickenInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-11042二次抗体
Alexa Fluor 647 ウマ anti-RabbitInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-21244二次抗体
Alexa Fluor 488 ウマ anti-MouseThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)A-11001二次抗体
EVOS 顕微鏡システムThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/Aイメージング
TRI 試薬Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)T9424RNA 抽出
Direct-zol RNA キットZymo Research (Irvine, CA, USA)R2050RNA 精製
NanoDrop ND-1000Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)

参考文献

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