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研究記事

ガストロディンはアルツハイマー病細胞モデルにおけるAKT/GSK-3βシグナル伝達変化に関連するタウ過剰リン酸化を緩和します

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DOI:

10.3791/70432

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2026年3月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences and Medicine, Zhejiang Sci-Tech University, 2Zhejiang Sci-Tech University Shaoxing Academy of Biomedicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、SH-SY5Y細胞における岡田酸誘発性アルツハイマー病細胞モデルの確立と、酸化ストレスおよびAKT/GSK-3β経路解析を通じてガストロディンの神経保護効果を評価するためのプロトコルを提示します。

要約

アルツハイマー病(AD)は一般的な神経変性疾患であり、現在有効な治療薬は限られています。ガス トロディア・エラタ由来の主要なバイオアクティブ成分として、ガストロディン(GAS)はAD治療において明確な治療可能性を示しています。しかし、その作用の分子メカニズムはまだ解明されていません。本研究では、GASがADモデル細胞に与える効果のメカニズムを調査することを目指します。ネットワーク薬理学は、ADにおけるGASの影響を受ける標的およびシグナル伝達経路の解析に用いられています。AD細胞モデルは、ヒト神経芽腫のSH-SY5Y細胞を岡田酸(OA)で誘導することで構築されます。細胞生存率はCCK-8アッセイを用いて評価され、SOD、MDA、T-AOCのレベルが測定されました。アポトーシス速度はAnnexin V-FITC/PI二重染色によって決定され、アポトーシス関連因子の発現およびAKT、GSK-3β、p-Tau(Ser396)、p-Tau(Thr181)はRT-qPCRおよびウェスタンブロッティング技術を用いて解析されました。ネットワーク薬理学的解析により、GASは細胞アポトーシスおよび関連するシグナル伝達経路(PI3K/AKTを含む)を調節する可能性が示唆されています。私たちの実験は、GASがMDAレベルを阻害し、ADモデル細胞のT-AOCおよびSODを増加させ、細胞のアポトーシスを減少させることを示しています。ウェスタンブロットの結果、GASはOAがp-AKT(Ser473)およびp-GSK-3β(Ser9)発現に対する抑制作用を緩和することを示しています。さらに、p-Tau(Ser396)およびp-Tau(Thr181)の過剰発現を減弱し、Bax発現を抑制し、Bcl-2発現を促進します。GASはOAによる酸化ストレス損傷を緩和し、アポトーシスを緩和する能力を示しています。GASはTauの高リン酸化を抑制し、これはAKT/GSK-3βシグナル伝達経路の変化に関連し、神経保護効果を発揮する可能性があります。

概要

アルツハイマー病(AD)は進行性の神経変性疾患で、主に記憶障害と認知障害を特徴とし、世界的に最も多い認知症の形態であり、症例の約60%から80%を占めています。ADの基礎的な病因は依然として複雑で、まだ完全には解明されていません。臨床的なAD症例で観察される主な病理的特徴には、脳内での老年斑(SP)および神経線維絡まり(NFT)の蓄積が含まれます。ADにおける二つの主要な病理的事象は、細胞外のβアミロイドタンパク質(Aβ)沈着による認知斑の形成と、細胞内で高リン酸化されたTauタンパク質の集合による神経線維絡まり5,6,7であることはよく知られています。さらに、酸化ストレスや神経炎症もAD 8,9,10,11の悪化に寄与する補助的な要因です。

世界的な人口高齢化傾向が激化する中、認知症患者数は12,13人で大幅に増加しています。しかし、ADの治療法は依然として限られており、主にメマンチン、ドネペジル、ガランタミン14などの単一標的薬剤にとどまっています。しかし、治療効果は主に緩和効果であり、疾患修飾にはあまり効果がありません。消化器系の障害、めまい、徐脈などの副作用も報告されています。したがって、より安全で効果的な治療戦略の開発は依然として重要な研究優先事項です。 最近発売されたモノクローナル薬剤、例えばレカネマブは、軽度のアルジム病患者に新たな希望をもたらしました。しかし、その高コストと制約は、その大きな治療需要に応えられていません。アルツ病の予防と治療は依然として大きな課題となっています 17,18。さまざまな研究の結果、薬用植物、特に伝統中国医学は、ADなどの神経変性疾患に関与する複数の経路を標的とした多成分効果を示すことが示されています。研究では、Ganoderma lucidumの有効成分がADマウスの脳組織における酸化損傷を緩和し、アポトーシスを抑制し、海馬神経細胞壊死を減少させ、認知障害を改善することが示されています19.AD研究では、Baoらがネットワーク薬理学を用いてAD関連炎症におけるアストラガロサイドIVの主要標的を特定しました。彼らの発見により、表皮成長因子受容体(EGFR)およびインターロイキン-1β(IL-1β)が重要な標的であり、神経変性疾患の臨床治療における潜在的な治療候補および疾患標的を提供することが明らかになりました。Dartiguesら21はイチョウ葉抽出物を分析し、高齢者の認知症および死亡率のリスクを低減する有益な効果があることを示しました。イチョウ葉抽出物を投与された患者は死亡率が低い22。

ガストロディア・エラタは蘭科に属する伝統的な中国のハーブで、食用かつ薬用です。ガストロディア・エラタの根茎はガストロディン(GAS)、ガストロディア多糖類、アルカロイドに豊富に含まれています。最近の薬理学的研究では、これらの有効成分が記憶力や認知機能の向上、神経保護特性、不眠症やめまいの治療に有効であることが示されています。ガストロディア・エラタの主な生物活性成分はGASで、塊茎から抽出され薬効を持っています。GASは4-ヒドロキシベンジルアルコール4-O-β-d-グルコシドとも呼ばれ、フェノールグリコシド24のクラスに属します。GASの化学構造は図1に示されており、分子量は286.278です。グリコシドおよびモノグリコシドの比較的低い分子量は、血液脳関門を効率的に通過させることを可能にし、GASの神経保護役割の基本的な基盤となっています25。さらに、高い吸収性はその効果をさらに高めています。近年、多くの研究で、AD 27、28、29、30、パーキンソン病(PD)31、脳虚血32など、さまざまな脳疾患の治療におけるGASの可能性が示されています。GASは抗酸化作用、低脂血作用、抗炎症作用、抗老化効果など幅広い薬理学的特性を示します33,34。その作用機序はNrf2、NF-κB、AMPK35など複数のシグナル伝達経路を含みます。GASは、Pb誘発神経障害のマウスモデルにおいてWnt/Nrf2経路36を調節することで神経保護効果を発揮し、またNrf2シグナル伝達経路37の調節を通じて神経変性疾患の治療において抗アポトーシス効果を示します。GASはまた、タンパク質キナーゼ/真核生物開始因子-2α(PKR/eIF2α)シグナル伝達経路38を通じて海馬BACE1発現を抑制することで、ADにも有益な効果をもたらしました。さらに、GASはTCDD誘発性のNF-κBシグナル活性化に対する抑制効果を示し、PC12ニューロンのアポトーシスおよびアストロサイト活性化を抑制しました。

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図1:GASの化学構造式。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

OAはハリコンドリア属の黒い海綿から由来し、長鎖脂肪酸のクラスに属し、下痢性貝類中毒(DSP)の主成分として機能しています。この薬は、特にPP1AおよびPP2Aを含むタンパク質ホスファターゼの活性を効果的に阻害し、細胞の過剰リン酸化や細胞恒常性の破壊を引き起こします(40,41)。この特性により、タンパク質リン酸化に関連する疾患の調査において貴重なツールとなっています。したがって、OAの利用により、Tauタンパク質のリン酸化変化を特徴とするAD細胞モデルの構築が可能になります。本研究は、Gastrodia elataの主要な活性成分であるGASがOAによって誘導されるAD細胞モデルへの影響とメカニズムを調査し、AKT/GSK-3βシグナル伝達経路を標的とすることでADモデル細胞に対する神経保護効果を明らかにすることを目的としています。

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プロトコル

すべてのネットワーク薬理学運用は、ネットワーク薬理学評価方法ガイドラインに従って実施されました。すべての実験手順は浙江理工大学の実験室管理規則に準拠して実施されました。

ネットワーク薬理学
GASの潜在的標的の予測:GASの標準的なSMILES(PubChem CID: 1150)はPubChemデータベース42から取得されました。SMILES構造はSwissTargetPredictionデータベース(http://www.swisstargetprediction.ch/)43にアップロードされました。種パラメータはホモ・サピエンスに設定されていました。確率値が0.1>予測対象を保持し、偽陽性予測を減らしました。すべての予測されたタンパク質標的はUniProtデータベース43 (ホモ・サピエンスに限定された種)を用いて公式の遺伝子記号に標準化され、重複したエントリーは削除されました。

AD関連遺伝子はGeneCardsデータベース(https://www.genecards.org/)44,45およびOMIMデータベース(https://www.omim.org/)46から「アルツハイマー病」を検索語として収集しました。GeneCardsでは、関連スコアが10>遺伝子が選ばれました。GeneCardsとOMIMから得られた標的は統合され、重複は除去され、UniProtで遺伝子名が標準化されました。

予測されたGASターゲットとAD関連遺伝子は、Venny 2.1オンラインプラットフォームにインポートされ、重複するターゲットを取得しました。合計52の交差遺伝子(補 足表1参照)が、ADにおけるGASの潜在的な治療標的として同定されました。

52の交差標的はPPI解析のためにSTRINGデータベース(https://string-db.org/)47にアップロードされました。種はホモ・サピエンスに設定され、必要な最小相互作用スコアは0.4(中程度の信頼度)に設定されました。切断されたノードは隠されていました。得られた相互作用データはエクスポートされ、Cytoscapeソフトウェア(バージョン3.9.1)で可視化されました。

GOおよびKEGG濃縮解析:52の交差標的はMetascapeデータベース(https://metascape.org/)48にアップロードされ、Gene Ontology(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)の濃縮解析が行われました。その種はホモ・サピエンスに分類されました。濃縮基準はp値<0.01、最小重複≥3、濃縮係数>1.5と定義されました。KEGG経路はp値に基づいてランク付けされ、上位20の有意に濃縮された経路を可視化のために選定しました。エンリッチメントの結果はオンラインバイオインフォマティクスプラットフォームを用いて可視化されました。

GSK-3βのタンパク質構造ファイルはRCSB PDBデータベースから取得されました。SDF形式のGASの構造ファイルはPubChemデータベースからダウンロードされ、その後Open Babel GUIソフトウェアを使ってMol2形式に変換されました。上記のファイルはAutoDockソフトウェアで処理され、水素原子の追加、水分子の除去、電荷の割り当てが行われました。処理済みファイルはその後PDBQT形式で保存されました。配位子分子中のトーション結合を検出・処理した後、ファイルはPDBQT形式で保存されました。2分子間の結合エネルギーが最も低いのは、AutoDock Vinaソフトウェアを用いた分子ドッキングによって得られました。その後、ドッキング結果をPyMOLを用いて可視化・解析しました。

ストック溶液調製
OA粉末(25μg)は、10%ジメチルスルホキシド(DMSO)1200μLに完全に溶解し、無菌リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で調製し、25μMのストック溶液を生成しました。ストック溶液はアリクォートされ、-80°Cで保存されました。 各実験前に、OAは完全なDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)(材料 表参照)で新たに希釈され、所望の作動濃度に調整されました。GAS粉末(20 mg)は1.4 mLの滅菌PBSに溶け、0.22 μmの膜でろ過して滅菌し、50 mMのストック溶液として調製し、-20°Cで保存しました。 使用前に、ストック溶液は完全なDMEMで希釈され、指示された作業濃度に調整されました。

ADセルモデルの構築
ヒト神経芽細胞腫のSH-SY5Y細胞を入手し、本研究で使用しました( 材料表参照)。SH-SY5Y細胞は、OA濃度の勾配(0、10、20、40、80、160 nM)でそれぞれ12時間、24時間、36時間の間誘導され、AD細胞モデルを確立しました。

細胞生存率アッセイ
AD細胞モデル確立のための最適なOA濃度と誘導期間を決定するために、SH-SY5Y細胞に対して異なる期間(12時間、24時間、36時間)でOAの勾配濃度(0、10、20、40、80、160 nM)を処理し、CCK-8アッセイ49を用いて細胞生存可能性を評価しました。SH-SY5Y細胞は、100μLの完全なDMEM中に、1ウェルあたり密度7.5 × 103 セルの96ウェルプレートにシードされました。プレートは37°Cで加湿インキュベーターで24時間、5%のCO₂を含んで細胞の付着を可能にしました。24時間の取り付け後、各ウェルに100μLのOA作業液を加え、最終濃度は0、10、20、40、80、160 nMとなり、1ウェルあたり200 μLの総体積を達成しました。対照群(CON)はOAなしの完全なDMEMを同等量で受け、OA群は指定された濃度でOAを受けました。細胞は標準培養条件下で12時間、24時間、または36時間のインキュベートが行われました。各濃度と時間点には6つの複製井戸が設定されました。背景補正のために3つのブランクウェル(中程度のみ)が含まれていました。

細胞酸化ストレス指数の測定
対数成長相のSH-SY5Y細胞は6ウェルプレートにシードされました。細胞処理後、前の培地はウェルから廃棄されました。その後、井戸は4°Cで事前に冷却されたPBSで3回洗浄されました。 その後、細胞溶解バッファーを追加し、キットの指示に従って適切な方法で細胞を氷で溶解しました。サンプルのタンパク質含有量はBCAタンパク質アッセイキット( 材料表参照)を用いて定量化されました。T-AOC、SOD、MDAの活動は、それぞれのアッセイキットに付属する指示に従って決定されました(材料 表参照)。

細胞アポトーシス検出
細胞アポトーシスは、製造元の指示に従い、Annexin V-FITC/PI二重染色キット(材料 表参照)を用いて評価されました。短期間、浮遊細胞と付着細胞の両方が採取されました。接着細胞は人工的な膜損傷を避けるためにEDTAを使わず、トリプシンで消化され、浮遊細胞と組み合わせて処理されました。細胞は冷たいPBSで2回洗浄し、1×結合バッファー500μLに0.5–1×10個6 細胞の密度で再懸浮させました。

その後、各サンプルに5μLのAnnexin V-FITCと5μLのプロピジウムヨード(PI)を加え、優しく混合し、室温の暗い環境で10〜20分間培養しました。サンプルは氷に置かれ、フローサイトメーターで1時間以内に分析されました。

フローサイトメトリー解析では、補正パラメータと象限ゲートを設定するために、染色されていない対照群および単一染色対照群(Annexin V-FITCのみおよびPIのみ)を用いました。最初に、破片や細胞集合体を排除するために前方および側散乱(FSC/SSC)ゲートが適用されました。1サンプルあたり最低10,000件のイベントが取得されました。データはFlowJoソフトウェアを用いて分析されました。

リアルタイム定量PCR解析(RT-qPCR)
AG逆転写キットの指示に従い、抽出されたRNAは逆転写を受けて補完DNA(cDNA)を生成し、その後滅菌水で10倍に希釈してテンプレートとして使われました。RT-qPCR反応システムは、グリーンマスターミックス(No Rox)キットのプロトコルに従って準備され、蛍光定量PCR装置( 材料表参照)を用いて分析が行われました。得られたCt値は処理・解析され、ターゲット遺伝子の発現レベルは2-ΔΔCt法を用いて算出されました。ここでΔCtは治療群とGAPDHのCt値の差、ΔΔCtは治療群と対照群のΔCt値の差を表します。入門書の一覧は 補足表2に記載されています。

ウェスタンブロッティング解析
細胞溶解バッファーはプロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤とともに100:1:1の比率で組み合わされました。細胞は細胞タンパク質を抽出するために溶解されました。タンパク質濃度はBCAアッセイキットを用いて測定されました。タンパク質(1レーンあたり20〜30μg)は、スタッキングゲル用80V、分離ゲル用120Vの10% SDS-PAGゲル上で分離されました。タンパク質は湿式移送を用いて300 mAでPVDF膜(0.45 μm)に90分間移送しました。膜は室温で5%脱脂乳で2時間ブロックし、その後4°Cで一次抗体( 材料表参照)で一晩培養しました。 室温で二次抗体と共に1時間培養した後、膜をTBSTで4回、それぞれ5分間洗浄しました。バンドは増強化学発光(ECL)検出試薬( 材料表参照)を用いて可視化され、検出はゲルイメージングシステムで行われました。グレースケール値はImageJソフトウェアを用いてデータインサイトを解析しました。

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結果

AD治療のためのGAS関連標的スクリーニング
GASのAD治療対象の特定には、データベース検索とソフトウェア解析が行われました。スイスのターゲット予測データベースでは100の潜在的ターゲットが検出され、OMIMおよびGeneCards(関連スコア10)はAD関連ターゲットの照会>、合計2376の潜在ターゲットが検出されました。その後、Venny 2.1オンラインプラットフォームの活用により、ADにおけるGASの52の潜在的な治療標的を特定することができました(図2A)。

STRINGデータベースから得られたタンパク質間相互作用(PPI)情報は、Degree値>10のフィルターを適用したCytoscapeソフトウェアでさらに精緻化され、PPIネットワークの構築が実現しました。介気ガスのアドマントにおける潜在作用は、 図2Bに示されているように11の主要標的に関...

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ディスカッション

近年、世界的なADの有病率が増加しています。この疾患は慢性的な経過、不可逆的な性質、障害、高い死亡率を特徴としており、高齢化する世界人口の文脈において大きな課題となっています。その重要性にもかかわらず、ADの病因は複雑であり、その発症機序は完全には解明されていません。

伝統中国医学は病気の予防と治療において顕著な効果と比較的高い安全性を示しており、52,53。現代の薬理学的研究により、ガストロディア・エラタに含まれる活性成分が記憶力の向上、認知障害の緩和、神経保護に効果があることが明らかになりました。Suiらの54件の研究は、Sirt3レベルのアップレギュレーションを通じて神経毒性を抑制し、アストロサイトの炎症反応を緩和することでGASの神経保護効果を明らかにしました。さらに、GASはト...

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開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

この研究は浙江理工大学の公開基金である紹興生物医学院(SXAB202007)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
7500リアルタイムPCRシステムAPExBIO S0080アポトーシス細胞の検出に使用
A450酵素標識装置プロテインテック 50599-2-IgWB、希釈1:1000
アネクシンV-FITCアポトーシス検出キットプロテインテック 60178-1-IgWB、希釈1:1000
アンチバックス抗体プロテインテック 10494-1-APWB、希釈1:1000
抗Bcl-2抗体アブカム AB32057WB、希釈1:1000
抗GAPDH抗体プロテインテック 28866-1-APWB、希釈1:1000
抗p-タウ抗体(Ser396)Biofroxx 1172WBのブロッキングバッファ
抗p-タウ(Thr181)抗体ヴァジム・バイオテクノロジー 
A311-01/02		細胞生存能力測定に使用
Biofroxx 脱脂粉ミルクソーラービオ科学&技術 D8371化合物用溶媒
CCK-8キットワイセント・バイオテクノロジー319-105-CL細胞培養用
ジメチルスルホキシド(DMSO)APExBIO(アメリカ)K1231WB検出試薬
DMEM高グルコース培地アラジン生化学技術 G111309アクティブ化合物
ECL化学発光試薬プロメガ  A6101qPCR増幅のために
フローサイトメーターソーラービオ科学&技術 BC6410脂質過酸化アッセイ
ガストロディン(GAS)粉末、純度およびジ;98%メドケムエクスプレスHY-N6785タウ過剰リン酸化の誘導因子
ゲルイメージングシステムビヨタイム・バイオテクノロジーC0221A細胞を洗え
GoTaq qPCRマスターミックスプロテインテック SA00001-1WB、希釈1:5000
MDAアッセイキット(マロンジアルデヒド)プロテインテック SA00001-2WB、希釈1:5000
岡田酸(OA)ATCCCRL-2266セル
PBSビヨタイム・バイオテクノロジーS0101M酸化ストレスアッセイ用
二次抗体(ヤギ抗マウスIgG、HRP結合抗体)ソーラービオ科学&技術 紀元前1315年抗酸化能力検出
二次抗体(ヤギ抗ウサギIgG、HRP共役抗体)ビヨタイム・バイオテクノロジー R0016RNA抽出
SH-SY5Yシグマ・オルドリッチ 
9002-07-7		細胞消化
SODアッセイキット(全超酸化物ディスミューターゼ)サーモフィッシャー・サイエンティフィックA45072吸収検出用の多機能マイクロプレートリーダー
総抗酸化能力(T-AOC)キットベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー661310マルチパラメータ単一セル解析およびセルソート用。
トリゾール試薬サーモフィッシャー・サイエンティフィック4351104遺伝子発現解析
トリプシンバイオ・ラッド1708195DNA/RNA/タンパク質ゲルイメージング

参考文献

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