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方法論記事

マウスの尿酸腺上皮細胞培養用の2つの小分子からなる新しい血清フリーの2D・3D培養システム

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DOI：

10.3791/70438

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2026年2月10日

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1Department of Ophthalmology Optometry Center, China-Japan Union Hospital of Jilin University, 2Eye Institute & Affiliated Xiamen Eye Center, School of Medicine, Xiamen University, 3Huaxia Eye Hospital of Quanzhou, 4Shen Zhen Research Institute of Xiamen University

この記事について

サマリー

小分子の組み合わせ2C(Y27632およびSB431542)を用いた新しい血清フリー培養システムを導入し、2Dおよび3D培養の両方で涙腺上皮細胞(LGEC)を効率的に増殖させ、その増殖と分化を正確に制御することを可能にします。

要約

涙腺(LG)機能障害は水性欠乏型ドライアイ病の主な原因であり、細胞ベースの治療や組織工学療法はこの疾患に対して大きな可能性を示しています。しかし、血清を使わない条件下で培養された十分な種子細胞の入手が限られているため、その広範な応用は妨げられています。本研究では、Y27632とSB431542(2C)という2つの小分子を用いて、LG上皮細胞(LGEC)を効率的に増幅する新しい血清フリー培養システムを開発しました。LGECsの2次一次培養では、6〜8週のマウスからLGを単離し、Dispase IIおよびコラーゲン酵素Aを用いて酵素的に消化しました。得られた細胞懸濁液は7,500細胞/cm² の密度で培養皿にシードされ、2°Cで12〜14日間培養されました。細胞コンフルエンスが80〜90%に達した時点で、サブカルチャーは1:2の比率で開始されました。3D培養では、10,000個のP1 LGECを10μLの2Cと10μLのマトリックスゲルに再懸濁し、24ウェルプレートの中心にシードしました。37°Cで30分間固化した後、2Cを600μL追加して培養を続けました。鑑別のために、3次元球体は2Cで7日間培養され、その後2Cを除去してさらに7日間培養を続けました。2Cで培養したLGECは高い増殖を示し、幹および増殖マーカーの発現(Ki67、K14、P63、K5、K15 [それぞれP = 0.0011、0.0002、0.0012、0.0003、0.0014])を示し、10回の通過後でも形態と増殖能力を維持しました。さらに、3次元条件下では、LGECは幹/前身特性を持つ球状体を形成し、2C除去後は複数のLG細胞タイプ(AQP5、K19、α-SMA陽性)を含む微小腺構造と成熟した分泌機能へとさらに分化しました。このアプローチは組織工学のための安定した種子細胞供給源を提供し、LG生理学を研究するための新たな in vitro モデルを提供します。

概要

涙液腺(LG)は涙膜の水層を作るために不可欠であり、これは眼表面恒常性1の維持に不可欠です。損傷や炎症によって引き起こされるLGの機能障害は、水性欠乏性ドライアイ症(ADDE)を引き起こします。この状態は重度の眼表面炎症、慢性角膜疾患、重症の場合は永久的な視力喪失を引き起こすことがあります。現在のADDE治療は主に症状の管理にとどまっており、根本的な腺機能障害には対処せず、長期的な効果を制限しています。LG機能障害に対する標的療法の開発には、長期的かつ単純なin vitroモデルの欠如など、いくつかの課題があります。これによりLGの病態生理の理解が制限され、効果的な治療法の開発が妨げられています。細胞移植はLG再生を促進する可能性を示しているが、in vitroでの細胞増殖能力の限界と既存の培養システムの複雑さは臨床応用に大きな障害となっている1,3。したがって、成マウスLGsのシンプルで長期的な培養システムを確立することは、LGの生理学と病理の理解を深めるとともに、LGの損傷修復および再生のための信頼できるLG幹細胞/前歯細胞の供給源を提供するために不可欠です。

LGの既存のin vitro培養システムは大きな進展を遂げていますが、依然として顕著な制約に直面しています。これらの多くの方法は血清補完培地に依存しており、バッチごとの変動性、成分の不確定、線維芽細胞や間葉系細胞の汚染リスク(4,5,5,6,7,8)など、いくつかの問題を引き起こします。さらに、血清ベースのシステムはLG疾患の病因メカニズムの研究に適しておらず、免疫拒絶のリスクがあるため細胞移植治療にも課題をもたらします。これらの制約に対応するため、マウスおよびヒトの両方からLG上皮細胞(LGEC)を培養するためのいくつかの血清フリー法が開発されています。例えば、上田らは新生マウスから血清を使わない方法でLGECを培養することに成功しました10。しかし、この方法は細胞をサブカルチャーに通すことができず、十分なLGECを得るために多数の新生腺が必要だったため、制約がありました。同様に、小林らはコレラ毒素を用いた血清フリー培養系を開発しましたが、11番通過時に細胞形態の維持に困難に直面しました。最近の進展には、ZhangらによるマウスLG幹細胞の3D培養システムや、Bannier-Hélaouëtらによるマウスとヒトの両方向けのLGオルガノイド培養システムの開発(12,13,14,15)があります。しかし、これらのシステムは複数の小分子、成長因子、添加剤を含む複雑な培地配合に依存しており、培養プロセスを複雑にし、スケーラビリティを制限します。これらの課題は、LGECの増殖や幹・前体特性を維持しつつ、その拡散性や幹・前駆細胞特性を維持して治療応用や研究に活用できる、単純化され効果的な血清フリー培養システムの必要性を強調しています。

近年、小分子媒介化学的再プログラミングの急速な発展により、in vitro16の一次成人細胞の維持と増殖のための新たな戦略が導入されました。細胞内シグナル伝達経路、細胞-マトリックス相互作用、細胞接着を調節することで、小分子は細胞増殖と可塑性を大幅に高め、細胞増殖効率と運命制御を向上させます17。生成の制御可能、免疫原性の低さ、非ゲノム統合性から、小分子は成人上皮細胞の増殖システムを構築するのに理想的です16。異なる小分子の組み合わせは、皮膚幹細胞、角膜幹細胞、結膜幹細胞を含むさまざまな一次細胞タイプのin vitro増殖を効果的に維持することが示されています18,19,20。したがって、LGECを拡大するための小分子ベースの戦略を開発することは、将来の研究および治療分野での応用の可能性を示しています。

このプロトコルでは、2つの小分子Y27632とSB431542(2C)を用いてLGECの拡張をサポートするシンプルかつ効率的な血清フリー培養システムが開発されました。これら二つの分子の利点を組み合わせることで、2Dおよび3D培養の両方で血清フリー系が確立されました。2Cで培養したLGECは高い増殖能力と幹細胞・前駆細胞の特徴を示し、少なくとも10回の vitroパス経過後も典型的な上皮細胞形態を維持しました。3次元培養では、LGECは幹細胞や前駆細胞の特徴を保持しただけでなく、2C除去後に分泌構造へとさらに分化し、分泌機能を持つ微小腺構造を形成する能力も示しました。この血清フリーシステムは、LGの生理学および病理の in vitro モデルに適しており、LG組織工学や再生応用のための大量の細胞供給源も提供します。しかし、現在のプロトコルは3D文化の予備的な探求に過ぎません。長期的な3D文化は現時点ではこの研究の範囲を超えています。この方法は成マウスのLGECs向けに特別に設計されており、さらなる最適化がなければ他の種には適用できない可能性があることに注意が必要です。

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プロトコル

すべての実験は、視力・眼科学研究協会(ARVO)および吉林大学および厦門大学の実験動物倫理委員会の規則に従って実施されました。

注:すべての細胞培養手順は、細胞手術室のUV滅菌されたバイオセーフティキャビネット内で行われました。

1. LGECの一次培養

  1. LG組織の単離
    1. 麻酔を受けたC57BL/6Jマウス(生後6〜8週)は子宮頸部脱臼で安楽死させ、耳の部位(LG付近)を75%エタノールで消毒して汚染を防ぎます。
    2. 外眼角から耳下の皮膚まで切開し、LGを露出させます。無菌の滑らかな鉗子とハサミを使い、解剖顕微鏡の下でLGを周囲の組織(耳垂腺および結合組織)から慎重に分離してLGを取得します。
    3. LGを予冷えた組織採取培地(DMEMに10%ペニシリン-ストレプトマイシン-アンホテリシン)を1.5mLのマイクロ遠心分離機管に入れ、分解を最小限に抑えるために氷の上に置きます。
  2. 組織調製
    1. LGを新しい冷蔵組織採取培地に移し、3.5cmの皿に入れます。
    2. 残ったマウスの毛を除去し、LGを囲む結合組織の包膜を剥がします。滑らかな鉗子を使って小葉間の結合組織を除去し、腺組織を分離します。
      注意:LG表面のカプセルと小葉間の結合組織を十分に除去し、小葉間の管を露出させ、その後の消化過程で消化液の浸透を容易にすること。
    3. 組織を新しい採集培地に移し、汚染を防ぐために5〜10分間洗い流します。
  3. 酵素的消化
    1. LGsを消化液(血清不使用培地に2 mg/mLのディスパーゼIIおよび2 mg/mLのコラーゲナーゼAを補足)を入れた1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに入れます。(補足表1)
      注意:4個のLGには1mLの消化液が必要です。
    2. LG組織をマイクロハサミで細かく解剖し、チューブ内で約0.5〜1 mm³の小さな塊に分けます。
    3. マイクロ遠心分離チューブは37°Cで5%のCO2 を含んで2.5〜3時間培養します。30〜60分ごとに、消化液で組織を優しく混ぜて、酵素的な消化を確実にします。
  4. LGECsの分離と収穫
    1. 消化時間が終わったら、マイクロ遠心分離機チューブを数回振ってください。消化液をピペットで数回かけて組織を単一細胞または小細胞の塊に分解します。顕微鏡で観察して消化の進行を確認します。
      注意:消化液中に目に見える粒子が残っておらず、顕微鏡下で多数の単一細胞や管状の細胞集合体が観察された場合、消化プロセスを停止してください。
    2. 300 x g の温度で室温で5分間遠心分離し、その後消化培地を捨てます。
    3. 細胞ペレットを1 mLの滅菌DPBSに再懸浮させ、再び1000 x g で室温で3分間遠心分離して残留酵素を除去します。
    4. 手順1.4.3を繰り返し、上清液を除去し、細胞ペレットを500μLの血清フリー培地に再懸濁します。
  5. LGECsの播種と一次培養
    1. 血清フリー培地に1%ペニシリンストレプトマイシンと2C(10μM Y27632および10μM SB431542)を補足してLGECs培養培地を準備します。(補足表1)
    2. 細胞を7.5 x 10³ cells/cm²の密度で、血清フリーの2C培地を用いて標準的な未処理の24ウェル培養プレートにシードします。
    3. シード後は培養皿の縁を優しく叩き、細胞の分布を均一にします。プレートを5%CO2の37°Cインキュベーターに入れます。
    4. 種まきから72時間後に初めて培地を交換してください。その後は2〜3日ごとに培地を変えます。
      注意:最初の72時間は培養を乱さないでください。最初の培地交換では、細胞をDPBSで洗浄しないでください。古い培地を取り除き、新しい培地を加えるだけです。

2. LGECのサブカルチャリング

注意:細胞のコンフルーレンスが80〜90%に達した時点でサブカルチャーを行い、これは通常一次培養から約14日後に起こります。

  1. 培地を取り出し、細胞を滅菌DPBSで優しく2回洗浄します。
  2. 0.25%トリプシン-EDTAを250μL加え、37°Cで5%CO2 と共に10〜15分間培養します。タイトジャンクションが解離し細胞が丸まったら、同じ量の定義されたトリプシン阻害液を加えて消化を終わらせます。
    注意:一次培養中に平坦で大きな接着細胞が観察された場合は、0.25%トリプシン-EDTAを5分間処理してこれらの異質細胞を除去してください。その後、さらに5分間0.25%トリプシン-EDTAで培養液を処理し、さらに消化してより純粋なLGEC集団を得て次の通過に備えます。
  3. 細胞懸濁液を1 mLピペットでピペットで混ぜ、その後1.5 mLの遠心分離機チューブに移し、室温で1000 x g の遠心分離機で3分間投与します。上清液は捨てる。
  4. 細胞を無菌DPBSで洗浄し、再度遠心分離機でLGECを採取します。
  5. LGECを2C培養培地に再懸浮させ、サブカルチャー用に1:2の比率で播種します。培養皿を振って細胞を優しく混ぜ、37°Cで5%のCO2で培養します。
    注:1:2比率でのサブカルチャーは、細胞コンフルーレンスが80-90%に達した時点で、LGECを1つのウェルプレートから分解し、2つの新しいウェルプレートに均等に分布させます。
  6. 播種後3日目に培地を交換し、その後は細胞の状態に応じて2〜3日ごとに培地を交換します。
  7. 逆位相差顕微鏡で毎日細胞形態を観察し、写真で記録します。

3. LGECの三次元(3D)培養

注:この3D培養実験はP1 LGECを使用しています。P1 LGECが2Cとの培養7日後に80〜90%の合流に達すると、3D培養に使用されます。

  1. 準備の手順
    1. マトリックスゲル(補足表1)を-20°Cの冷凍庫から4°Cの冷蔵庫に移し、一晩解凍します。
    2. 適切な予冷を確実にするために、必要なピペットチップを-20°Cの冷凍庫に入れてください。
    3. 24ウェル培養プレートを37°C、5%CO2 インキュベーターに2時間預熱してから3D培養を開始します。
    4. 冷蔵庫を用意し、1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブをいくつか入れて予冷します。使用前にバイオセーフティキャビネット内のアイスボックスを滅菌してください。
  2. LGECの3D培養
    1. ステップ2.1から2.4で説明されているP1 LGECを取得します。
    2. 細胞ペレットを2C培養培地に再懸浮させ、細胞密度を10μLあたり1×10⁴細胞に調整します。
    3. 4°Cの冷蔵庫から解凍したマトリックスジェルと、-20°Cの冷凍庫から冷やしたピペットの先端を取り出し、バイオセーフティキャビネット内のアイスボックスに入れます。
    4. インキュベーターから予熱した24ウェル培養プレートを取り出し、バイオセーフティキャビネットに入れます。
    5. 適切な量の細胞懸濁液を、マトリックスゲルと1:1の比率で混合し、予冷のピペットチップを使用します。均一に混ぜて均一に混ぜます。
    6. ステップ3.2.5の混合物20μLを、予熱された24ウェルプレートの各ウェルの中心に慎重にピペットで注ぎます。
    7. プレートを逆さにして37°C、5%CO2 インキュベーターで30分間培養し、マトリックスゲルが固まるのを待ちます。
    8. マトリックスゲルが固まったら、各ウェルに600μLの2C培養培地を加えます。
    9. 培養プレートを37°C、5%CO2 の培養盤で14日間培養します。種まき後3日目から、細胞の状態に応じて2〜3日ごとに培地を交換してください。
    10. 逆位相差顕微鏡で毎日3D球状体の形成を観察し、画像を撮影して記録します。
  3. 3次元LGEC球体の微分
    1. ステップ3.2で説明された3D LGEC球体を培養します。
    2. 7日間培養した後、2C培養培地を取り出し、残留2Cを除去するためにDPBSで優しく2回洗います。マトリックスジェルを乱さないように注意してください。
    3. 血清フリー培地を2C(Null)なしに追加し、さらに7日間培養を続けて分化を誘導します。
    4. 培養期間中は培地を2〜3日ごとに交換してください。
    5. 逆位相差顕微鏡の下で誘導された3D球体の形態変化を毎日観察し、画像を撮影して記録します。

4. 分化した3次元LGEC球体の埋め込みおよび凍結断面

注:3D球体の分化は3.3節で説明されているように誘導されます。7日間の分化後、以下の手順に従って最適な切断温度(OCT)埋め込みと分化した3D球体の凍結断片を行います。

  1. 培養培地を井戸の縁に沿って吸引します。分化した球体を滅菌DPBSで優しく3回洗います。
  2. バイオセーフティキャビネットまたはフルームフード内の井戸に4%パラホルマルデヒド(PFA)1mLを加え、球体を室温で10分間固定します。
  3. 球状体を無菌DPBSで3回優しく洗い、各洗浄は10分間続けて固定剤を除去します。
  4. ヘラで3D球状マトリックスのゲルドーム状構造を慎重にこすり取り、20%ショ糖溶液を含む5mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。
  5. ドーム構造がチューブの底に沈むまで、4°Cで一晩培養します。
  6. ショ糖溶液からドーム構造を取り除き、残留するショ糖を慎重に除去し、OCT化合物に埋め込みます。液体窒素で凍結し、-80°Cで保存します。
  7. 染色前に、凍結マイクロトームを使って厚さ10μmの断片を準備します。

5. 分化した3次元LGEC球体の分泌関数検出

  1. サンプル採取
    1. 3.3節で説明されている3次元球体の分化を誘導します。
    2. 7日間の分化後、培養培地を取り出し、3次元球状体をDPBSで3回洗浄します。
    3. 2°Cなしの血清フリー培地500μLを加え、37°Cで5%CO2 を含んで2時間培養します。
    4. 培養培地を採取し、1.5mLのマイクロ遠心分離管に移して、ピロカルピン刺激前にラクトフェリン(LTF)濃度を測定します。
    5. 3D球体は滅菌DPBSで優しく3回洗ってください。
    6. 血清フリー培地500μL(ピロカルピン1 μg/mLを含む)を加え、37°Cで5%のCO2 を含んで24時間培養します。
    7. 培養後、培養培地を1.5 mLのマイクロ遠心分離管(ピロカルピン刺激後のLTF濃度測定用)に採取します。
    8. 収集した培地を4°C、1000 × g で20分間遠心分離します。上清液を採取し、後で使うために-80°Cで保存してください。
  2. サンプル希釈
    1. -80°Cの冷凍庫からサンプルを取り出し、室温で完全に解凍させます。
    2. サンプル5μLを取り、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キットのサンプル希釈バッファー495μLで希釈し、100倍の希釈液を準備します。
  3. 試薬調製
    1. 使用の20分前にELISAキットのすべての試薬を室温に移してください。
    2. 洗浄バッファーの準備:サンプル数に基づいて必要な量を計算し、濃縮洗浄バッファーを蒸留水(1:24)で希釈します。
    3. 標準的な作業用ソリューションを準備してください:
      1. 凍熟した標準液を10,000 × g で1分間遠心分離します。リファレンススタンダードとサンプル希釈剤1mLを加え、10分間置いてから数回優しく逆さまにします。
      2. 完全に溶けたら、ピペットでよく混ぜます。この再構成により、2000 pg/mLの作動溶液が得られます。
    4. キットの説明に従って連続希釈を行い、以下の標準濃度勾配を準備します:2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0 pg/mL。
    5. ビオチニル検出抗体の作動液を準備します:
      1. アッセイに必要な体積(50 μL/well)を計算します。濃縮ビオチニル検出抗体を800× g で1分間遠心分離し、その後、50×濃縮ビオチニル検出抗体をビオチニル化検出抗体希釈剤を使って1×の作動溶液に希釈します。
      2. 使用直前に溶液を準備し、計算量よりやや多く、通常必要より100〜200μL多く加えます。
    6. ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)共役液を準備します:
      1. 実験に必要な体積(50 μL/well)を計算します。濃縮されたHRPコンジュゲートを800× g で1分間遠心分離し、その後HRPコンジュゲート希釈剤で1倍の作動濃度に希釈します。
      2. 使用直前に溶液を準備し、計算量よりやや多く、通常必要より100〜200μL多く加えます。
  4. ELISAアッセイ手順
    1. 希釈した標準、ブランク、サンプルのウェルをそれぞれ3回のレプリケートで決定します。対応するウェルに標準作業液、空白液、希釈サンプル溶液を25μL加えます。キットに付属のシーラーをプレートにかぶせ、37°Cで90分間培養します。
      注意:溶液はマイクロELISAプレートの底部に加えるべきです。内壁に触れて泡を立てないようにしましょう。
    2. 洗浄せずに井戸から液体をデカントします。各ウェルにすぐに50μLのビオチン化検出抗体作動液を加えます。プレートに新しいシーラーを塗り、37°Cで60分間培養します。
    3. 井戸から液体をデカントし、各井戸に350μLの準備済み洗浄バッファーを加えます。1分間浸けてから、各井戸から液体を吸引またはデカントし、きれいな吸水性の紙で軽く拭き乾かします。この洗浄工程を3回繰り返します。
      注意:洗浄中に井戸を乾燥させないでください。
    4. 各井戸に準備済みHRP共役作業液を50μL加えます。新しいシーラーでプレートを覆い、37°Cで30分間孵化します。
    5. 井戸から液体をデカントし、ステップ5.4.3で説明された洗浄バッファーで洗浄プロセスを5回繰り返します。
    6. 各ウェルに基質試薬50μLを加えます。プレートに新しいシーラーを塗り、暗闇で37°Cで15分間孵化します。
    7. 各ウェルに25μLの停止液を加えて反応を終えます。ストップ溶液は基板溶液と同じ順序で加えられるようにしてください。
    8. マイクロプレートリーダーを使って、450 nmで各ウェルの光学密度(外径値)を即座に測定します。

6. RNA単離

  1. サンプル採取
    1. LG組織について
      1. 1.1.2-1.1.2節に記載されているように、成体マウスから眼窩外LG組織を分離します。
      2. 新たに分離したLG組織をPBSに浸して血を洗い流します。
      3. LGの表面水分をフィルターペーパーで拭き取り、組織を1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに入れ、1mLのRNA抽出試薬(補足表1)を入ったままチューブを氷の上に置きます。
        注意:RNA抽出前に組織の完全な溶解を確保するためにグラインドステップを行ってください。
      4. マイクロ遠心機チューブにきれいなスチール粉砕ビーズを2つ追加し、そのチューブを予冷の高速低温グラインダーに入れます。
      5. グラインダーのパラメータを設定してください:周波数70Hz、粉砕時間45秒、一時停止15秒、これを10サイクル繰り返します。グラインダーのキャップハンドルを締めて挽き始めます。
      6. チューブを氷の上に置くか、粉砕工程が終わった後にRNA抽出のために-80°Cで保存してください。
    2. LGECについて
      1. 培養培地を取り出し、LGECが80〜90%の合流に達したら無菌DPBSで細胞を3回洗浄します。
      2. 各ウェルに600μLのRNA抽出試薬を加え(24ウェルプレート用)、室温で5〜10分間培養します。
      3. 1 mLピペットを使い、各ウェルのRNA抽出試薬溶液を繰り返しピペット化し、完全な細胞溶解を保証します。
      4. 溶液を1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。
      5. チューブを氷の上に置くか、-80°Cで保存して、その後のRNA抽出を行ってください。
    3. 3D LGEC球体の場合
      1. ステップ3.2-3.3に記載された通り、14日間培養した未分化および分化した3DLGEC球体を採取します。各ウェルに1mLの消化液(1 mg/mL Dispase IIを含む血清フリー培地)を加え、3D球状マトリックスのゲルドーム状構造を完全に覆います。37°Cで5%のCO2 を含んで30分間培養します。
      2. 3D球体を含む消化液を1mLピペットを使って1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。1000 g× g で遠心分離機を3分間かけて球状体ペレットを回収します。
      3. ペレットを1mLのDPBSで洗浄し、1000× g で遠心分離機で3分間再度ペレットを採取します。
      4. 20μLのマトリックスゲルあたり600μLのRNA抽出試薬を加え、室温で5〜10分間培養します。
      5. 1 mLピペットで十分に混合し、3D球体の完全な溶解を確保します。
      6. チューブを氷の上に置くか、-80°Cで保存して、その後のRNA抽出を行ってください。
  2. RNA抽出
    注意:適切な個人用防護具(白衣、手袋、マスク)を着用し、クロロホルムおよびイソプロパノールを含むすべての処置を排気フード内で行ってください。化学廃棄物の流れは、機関の廃棄物処理プロトコルに従い、有害廃棄物発生用ラベルの指定された有害廃棄物容器に処分してください。
    1. RNAサンプルを収めた遠心管にクロロホルム(RNA抽出試薬の1/5体積)をRNA抽出試薬(ステップ6.1以降)に加えます。
      注意:この処置はフムフード内で行ってください。
    2. ボルテックスを使って十分に混ぜ、室温で10分間培養して相分離します。
    3. 遠心分離機で14,000 x g で10分間、4°Cで加熱します。
      注:遠心分離後、液体は3層に分離し、RNAは最上部の透明な水相に存在します。
    4. 新しい1.5 mLのRNaseフリー遠心分離チューブを準備し、イソプロパノール(RNA抽出試薬の半分の体積)をフュームフードに追加します。
    5. 最上部の透明な水相(RNA抽出試薬の体積の半分)を慎重に新しいRNaseフリーチューブにピペット移入します。
      注意:ピペッティング時には中間層を汚染しないよう注意してください。
    6. チューブを何度か逆さにして混ぜ、室温で10分間培養します。その後、再び14,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
    7. 上清液を捨て、チューブを逆さまにしてペレットを洗浄するために75%エタノール500μLを加えます。再び14,000 x g で4°Cで5分間遠心分離機にかけます。
    8. ステップ6.2.7を繰り返します。上清液を捨て、残留液体を除去するために素早く遠心分離を行います。
    9. チューブを冷たいフードの中に置き、蓋を開けて10〜20分間自然乾燥させ、白いペレットが半透明になるまで待ちます。
    10. ペレットを溶かすためにRNaseフリー水20μLを加えます。分光光度計を使ってRNA濃度と純度を測定します。
      注意:RNA濃度が高すぎる場合は、適切な量のRNaseフリー水で希釈してください。
    11. RNA溶液を氷に置くか、-80°Cで保存して次の逆転写プロセスに備えます。

7. 定量的RT-PCR(qRT-PCR)

  1. 逆転写
    1. 製造元の指示に従って、以下の成分を順番にPCR反応管に加えます:総RNA800 ng(濃度に基づく体積計算)、q-PCR用の5倍オールインワンスーパーミックス4 μL、gDNAリムーバー1 μL、RNaseフリー水を1 μLで合計20 μLにします。
    2. 材料を優しく混ぜます。PCRマシンを以下の条件に設定します:55°Cで6分間、80°Cで1分間、そして12°Cを無期限に維持します。
    3. 逆転写反応が完了した後、cDNAは-20°Cで保存するか、qRT-PCRプロセスのために氷に保管します。
  2. qRT-PCR
    1. 異なる遺伝子を標的とするqRT-PCRプレミックス溶液を次の通りに準備します:5μLの2x Green qPCRスーパーミックス、0.2μLのフォワードプライマー(10μM)、0.2μLのリバースプライマー(10μM)、3.6μLのヌクレアーゼフリー水。優しく混ぜて氷の上に置きます。
    2. qRT-PCRプレミックス9μL(ステップ7.2.1で調製)とcDNA1μL(ステップ7.1で準備)をqRT-PCRチューブに加えます。
    3. チューブを室温で1000 × gで2分間遠心分離します。
    4. 検査のためにチューブを蛍光定量PCR装置に入れます。
      注意:試薬メーカーの指示に従い、以下のプログラムで3段階の方法を用いてください:94°Cで30秒、94°Cで5秒、60°Cで15秒、72°Cで10秒。ステップ2から40〜45サイクルサイクルを繰り返し始めます。
    5. 比較CT法(2-ΔΔCt)を用いて定量解析を行います。
      注:各データセットは、結果の信頼性を確保するために少なくとも3回独立して繰り返し行う必要があります。

8. 免疫蛍光染色

注:免疫蛍光染色は、24ウェルプレートで70-80%の合流率を持つLGECsや、分化したLGECsの3D構造の凍結切片で行われます。

  1. LGECについて
    1. ウェルから培地を取り出し、細胞をPBSで3回洗浄します。
    2. バイオセーフティキャビネットまたはフルームフード内の各ウェルに4%PFAを500μL加え、室温で15分間培養して細胞を固定します。
    3. 細胞をPBSで3回洗い、それぞれ5分間洗います。
    4. 細胞を覆うために0.2%トリトンX-100を500μL加え、室温で20分間培養して細胞膜を透過させます。
    5. 細胞をPBSで3回洗い、それぞれ10分間洗います。
    6. PBSを除去し、免疫組織化学マーカーで24ウェルプレートの各ウェルの周りに円を描きます。各ウェルに2%のBSAを50μL加えてセルを覆います。ブロッキングのために室温で1時間培養します。
    7. BSAを取り出し、希釈した一次抗体50μLを加えてLGECを覆います(補足表1)。4°Cで16〜18時間培養します。
    8. 一次抗体を除去し、手順8.1.5を繰り返します。
    9. 各ウェルに50μLの蛍光二次抗体を加え、LGECを覆います。室温の暗闇で1時間孵化させます。
    10. 8.1.5の手順を繰り返し、光への曝露を避けます。
    11. LGECを覆うために4',6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)溶液50μLを加え、蛍光顕微鏡で染色を観察します。
  2. 3D LGEC球体の場合
    1. ステップ4で説明した3DLGEC球状凍結断片を準備します。ステップ8.1.2-8.1.11に従って免疫蛍光染色を行います。

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結果

2Cを用いた血清フリーのLGECs培養システムを確立します
このプロトコルでは、一次マウスのLGECを拡大するためのよりシンプルで効率的な培養システムを確立することが目的でした。広範なスクリーニングの結果、Y27632とSB431542のみで構成される血清フリーの2Cの組み合わせが成功裏に開発され、LGECsの長期 的なin vitro 増殖が可能となりました。混合酵素消化後、一次LGECは2Cを用いた3日間の培養後に付着し、複数の細胞クローンを形成しました(データは示されていません)。最初の3日間はLGEC文化にとって重要な時期です。この期間中の攪乱は避けるべきであり、クローン形成に大きな影響を与え、LGECの拡張失敗を引き起こすためです。2Cを用いた12日間の培養後、クローンは徐々に融合し、細胞は細胞間結合が緊密な上皮形態でよく組織化されました。対照群(Null)は2Cを除き、形態が不規則な接着細胞はごくわずかしか見られませんでした(...

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ディスカッション

序論で述べたように、近年LG細胞用の血清フリー培養システムがいくつか開発されています。しかし、これらの方法の多くには限界があり、細胞増殖が遅いことや、in vitroでの大規模増殖が困難であることなどがあります。さらに、LG幹細胞やオルガノイドの血清不使用培養システムは、多数の添加物を含む複雑な製剤に依存しており、培養条件を不必要に複雑化させています。12,13,14,15です。

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開示事項

著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。

謝辞

この研究は中国国家自然科学基金(82471048、82271045年)の支援を受けました。深圳科学技術プログラム(JCYJ20240813145510014)、吉林省健康研究人材特別プロジェクト(2023SCZ63、2024SCZ53、2025SCZ65)、および吉林省科学技術開発計画プロジェクト(YDZJ202601ZYTS389年)です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
 -20°C型超低温冷蔵庫ハイアール
 -80°C型超低温冷蔵庫ハイアール
0.25% トリプシン-EDTAギブコ25200056
1.5 mL マイクロ遠心分離管およびnbsp;キルゲンKG2211RNASEフリー
35mm細胞培養皿ラボセレクト12111
4 & deg;C冷蔵庫ハイアール
4%パラホルムアルデヒド(PFA)サービスバイオG1101
4'6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)イェーセン708939ES03-20度で保存してください。C、1 mg/mLのストック、500倍、1倍に薄めて1倍に、1倍のPBSを混ぜて
5 mL遠心分離機チューブ ACMECAC17457
50mL遠心分離機チューブ ラボセレクトCT-002-50-SS
抗アルファ平滑筋アクチンウサギ抗体アブカムAB5694抗体希釈バッファーで1:100 で希釈します。
抗AQP5ウサギ抗体 アクローナルA9927抗体希釈バッファーで1:100 で希釈します。
抗サイトケラチン14ウサギ抗体アブカムAB181595抗体希釈バッファーで1:200 で希釈;
抗サイトケラチン19 ウサギ抗体アブカムAB52625抗体希釈バッファーで1:400 で希釈します。
抗Ki67ウサギ抗体アブカムAB16667抗体希釈バッファーで1:200 で希釈;
バイオセーフティキャビネットステリルガード
牛血清アルブミン(BSA) イェーセン36101ES604°で販売;C
C57BL/6Jマウス厦門大学実験動物センター
細胞培養プレートラボセレクト1131224井戸
セルインキュベーターエッペンドルフ
遠心分離機エッペンドルフ
クロロホルムフシ10006818注意、フムフード内での作業
CO2 定温インキュベーターエッペンドルフ
コラーゲン酵素A型ロッシュ10103586001-20度で保存してください。C、200 mg/mLのストック、100倍
定義されたトリプシン阻害剤溶液(DTI)ギブコR007100
DermaLife K ケラチノサイト ミディアム コンプリートキット(セラムフリー ミディアム) ライフラインLL-00074°でお店にお寄せください。C
D-ハンクスバイオシャープBL559A Dispase IIの希釈に使用
ジメチルスルホキシド(DMSO)シグマD4540Y27632およびSB431542の希釈に使用されます
ディスパースIIシグマD4693-20度で保存してください。C、200 mg/mLのストック、100倍
DMEMベーシック(1X)ギブコC11995500BT
ロバ抗ウサギIgG(H+L)高交差吸着二次抗体、Alexa fluor 488インビトロジェンA-21206抗体希釈バッファーで1:300で希釈します
ダルベッコのリン酸塩緩衝塩水(DPBS)サービスバイオG4200
エタノール絶対フシ10009218注意:他のエタノール希釈物の調製に使用してください。
凍結ミクロトームライカ
高速低温グラインダーサービスバイオ
逆転蛍光顕微鏡ライカ
逆立顕微鏡オリンポス
イソプロパノール フシ80109270
レーザー走査型コンフォーカル顕微鏡 FV3000オリンポス
低温高速遠心分離機エッペンドルフ
LTF酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キット エラブサイエンスE-MSEL-M0047-20度で保存してください。C
マトリックスゲル(マトリゲル)82703モーゲンゲル分割して-20 & degで保存します。C
マイクロピペッターエッペンドルフ
マイクロプレートリーダーサーモフィッシャー・サイエンティフィック
ヌクレアーゼフリー水バイオシャープBL510B
OCTコンパウンドサイゲン4586
PBS、1×(pH7.4)サービスバイオG4202
PCR増幅器バイオ・ラッド
ペニシリン・ストレプトマイシンバイオシャープBL505A
ペニシリン-ストレプトマイシン-アンフォテリシンバイオシャープBL142A
PerfectStart Green qPCR スーパーミックスキットトランスジェン・バイオテックAQ601-01-V2-20度で保存してください。C
パーフェクトスタート大学RT&qPCRキットトランスジェン・バイオテックAUQ-01-20度で保存してください。C
ピロカルピン アラジンP424663-20度で保存してください。C、2500倍
プライマーAQP5 順序:
前方:CATGAACCCACCCCCGATC
TT
裏面:CTTCTGCTCCCATCCCAT
CC		サンゴン・バイオテック
プライマーK14 シーケンス:
前方:CCCACCTTTCATCTTCC
CAATT
裏面:AAGCCTGAGCAGCATGTAGCAG		サンゴン・バイオテック
プライマーK15 順序:
前方:GAGGTGGCGTCTAACACA
GA
裏面:TCTGAGCCCCTCCATCAC
AG		サンゴン・バイオテック
プライマーK19 シーケンス:
前方:ATTACTGCCCTGAGGAGC
CA
逆行:TTCAGCTCTCAATCCGA
GC		サンゴン・バイオテック
プライマーK5 シーケンス:
前方:CTCAGAGCTGAGGACAT
GC
裏面:AGCTCCGCATCAAAGAAC
AT		サンゴン・バイオテック
プライマーKi67 順番:
前方:ACCATCATTGACCGCTCC
TT
リバース:TTGACCTTCCCCATCAGG
GT		サンゴン・バイオテック
プライマーLTF シーケンス:
前方:CAGGAGCCAACAAATGTG
CC
リバース:TTGTACTGGTCCCTTTCG
GC		サンゴン・バイオテック
プライマーP63 シーケンス:
前方:ATGTCACCGAGGTTG
AAA
リバース:GAATTCAGTGCCAACCTGTGTG		サンゴン・バイオテック
プライマー SOX10 シーケンス:
前方:ATCAGCCACGAGGTAATG
TCCAAC
裏面:ACTGCCCAGCCCCGTAGCC		サンゴン・バイオテック
プライマー&α;-SMA 順序:
前方:CTCCCTGGAGAAGAGCTA
CG
裏面:CGCTGACTCCATCCCAAT
GA		サンゴン・バイオテック
リアルタイム蛍光定量PCR装置ロッシュ
RNAアイソレート Total RNA抽出試薬ヴァイジームR401-01注意、フムフード内での作業
SB431542 ApexbioA8249-20度で保存してください。C、20 mMのストック、2000倍
分光光度計ナノドロップ1000サーモフィッシャー・サイエンティフィックRNA濃度の測定
ショ糖マックリンS818046蒸留水で溶かしてください
トライトン X-100ソーラービオT8200
超純水浄化システムミリポール
ユニバーサル抗体希釈バッファーエピジムPS1194°でお店にお寄せください。C
Y27632 ApexbioB1293-20度で保存してください。C、20 mMのストック、2000倍

参考文献

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