方法論記事

蛍光融合タンパク質ベースのレポーターを用いたジェノトキシン誘発性PARP1/PARP2活性化の可視化および定量解析

DOI：

10.3791/70497

⸱

2026年4月17日

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Warren Alpert Medical School & Legorreta Cancer Center, Brown University, 2Department of Pharmacology & Mitchell Cancer Institute, University of South Alabama

この記事について

サマリー

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ここでは、固定哺乳類細胞におけるポリ(ADP-リボース)(PAR)濃縮焦点の細胞ベースの可視化、細胞内局在化、定量解析の方法を説明します。このアッセイにより、ジェノトキシン曝露細胞の核におけるDNA損傷によるPARP活性化部位の定量化が可能となり、塩基切除修復や単鎖断裂修復に関連する部位も含まれます。

要約

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ポリ(ADP-リボース)(PAR)は、ADP-リボースポリメラーゼファミリーの4つの酵素群—PARP1、PARP2、PARP5a、PARP5b—によって合成されるADP-リボースのポリマーです。しかし、DNA断裂に反応してPARを合成するのはPARP1とPARP2のみです。PARはタンパク質の翻訳後修飾として定義されますが、DNAやRNA修飾としても存在することが示されています。PARのレベルはさらにPARGによって調節されます。PARGはPARグリコヒドラーゼであり、PARP1およびPARP2とともにDNA損傷誘発性PARの細胞レベルを調節します。PARの動的な合成と分解は、DNA修復およびDNA損傷応答における調節的役割に不可欠であり、これがクロマチンの再編成、複製、転写、細胞死に影響を与えます。PARP1/PARP2の活性化およびPARの蓄積は、塩基切除修復またはDNA単一鎖切断修復の部位とみなすことができます。しかし、多数のPARP1/PARP2活性化因子は複製ストレスやその他のDNA代謝過程とも関連しています。PAR鎖が形成されると、PAR鎖はPAR結合ドメイン(PBD)を通じてDNA損傷部位やゲノム損傷部位へのDNA修復およびDNA損傷応答(DDR)因子のリクルートを促進します。10種類の異なるPBDは、PAR結合モチーフ、PAR結合亜鉛指、WWEドメイン、マクロドメインなど、PAR分子のさまざまな領域を認識しています。PARダイナミクスの細胞解析を促進するために、PBDを強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)に融合させて、細胞ベースのPAR焦点の定量最適化を行いました。PBD/WWEドメインをコードするRNF146の断片を用いてEGFPに結合し、ゲノム損傷部位および進行中のBERまたはSSBR部位におけるPAR蓄積を可視化・定量化するアッセイを記述します。レンチウイルス粒子の産生、標的細胞株のトランスダクション、哺乳類細胞のゲノム損傷誘導処理、共焦点蛍光顕微鏡の取得、データの半自動化定量化などの実験ステップを説明します。

概要

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このプロトコルはLivePARアッセイを説明しており、哺乳類細胞におけるゲノム損傷部位、主に塩基切除修復(BER)または単鎖切断修復(SSBR)に関連する部位におけるポリ(ADP-リボース)(PAR)の可視化と定量解析を可能にします。BERはDNAから損傷または修飾された塩基を除去する重要なDNA修復経路です(BERおよびPARylationのレビューは4,5,6,7参照)。BERは、修飾塩基4を認識・切断し、アピリン系/アピリミジン系(AP)部位を残すDNAグリコシラーゼから始まります。例えば、メチルプリングリコシラーゼ(MPG)はメチル化された塩基8,9を切断し、8-オキソグアニングリコシラーゼ(OGG1)は8-オキ

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プロトコル

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1. レンチウイルスの産生

注:このプロトコルは、遺伝的にコードされたPARレポーターを発現する細胞を生成するために、第3世代レンチウイルスパッケージングシステム42,43を使用しています。レンチウイルス粒子は、エンベロープ、調節、パッケージングからなる4つのプラスミドシステムと、RNF146のEGFPタグ付きWWEドメインをコードするpLV-EF1A-LivePAR-Hygro構成体を用いて293FT細胞で作製され、これはポリ(ADP-リボース)鎖に結合します。得られたウイルスは、PAR蓄積の可視化と定量化のための安定した細胞株を生成するために使用されます。

  1. DMEM中の低通過率293FT細胞を、10%のFBSおよび1%のペン/連鎖球菌を含むものを、37°Cの加湿環境と5%のCO2で培養します。293FTの細胞が培養期間が3週間を超えていないことを確認してください。
    注:私たちは通常、293FTの細胞を使用し、パスセージ番号は3から10の範囲です。293FT細胞がSV40大型T抗原によって形質転換され、不死化されました。これらの細胞は高いトランスフェクション効率を持ち、組換えタンパク質の産生や遺伝子発現研究....

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結果

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LivePARプローブを発現する細胞は、RNF146(100-182)-EGFP融合タンパク質をコードするレンチウイルスを産生することで生成されます(図1A)。細胞は、トランスダクション後最大2週間の一時的な発現後、またはヒグロマイシンで選択後の安定した細胞株として評価することができます(図1B)1。ジェノトキシン処理後、DNA損傷誘発性PAR焦点を核内で可視化し、固定後は共焦点蛍光顕微鏡で画像化されます(図1C)。画像は車両制御セルにおける汎細胞間のEGFP染色を明らかにしています(図2、上部)。しかし、ジェノトキシン処理細胞は核焦点の蓄積を示し、これはPARに結合したRNF146(100-182)-EGFPの局在を示しています(

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ディスカッション

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LivePARアッセイは、PARP1/PARP2がPAR鎖を積極的に合成している核ゲノムDNA損傷部位を検出するために開発されました。これを達成するために、WWEドメイン(アミノ酸100–182)をコードするRNF146の断片をEGFP 1,2,3,37に融合させました。私たちが記述した追加のPARプローブは、DTX4のアミノ酸残基1から166、PARP11のアミノ酸残基22から112、DTX2のアミノ酸1から178に融合したEGFPをコードし、それぞれ拡張されたWWEドメイン37をコードし、PARのiso-ADP-リボース部分を認識しています。さらに、最近では、EGFPがAf152137の遺伝子操作マクロドメインに融合し.......

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開示事項

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R.W.S.はCanal House Biosciences, LLCの共同設立者であり、科学諮問委員会のメンバーであり、株式も持っていますが、この会社は本研究に関与せず、コンサルティング業務も関係ありません。著者たちは利益相反はないと述べています。

謝辞

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NRHの供給に関して長年にわたり絶え間なく支援し、専門的な助言をしてくださったマリー・ミゴー(サウスアラバマ大学)に特別な感謝を申し上げます。Sobol研究室でのDNA修復、DNA損傷の解析、遺伝子毒性曝露および複製ストレスの影響に関する研究は、NIHの助成金(ES029518、ES028949、CA238061、CA236911、AG069740、ES032522)およびNSF(NSF-1841811)からの助成金によって資金提供されました。また、レゴレッタがんセンター基金(R.W.S.への支援)からも支援が提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<ストロング>試薬、化学物質、ペプチド
0.45 & micro;m Durapore steriflipフィルターシグマ・オルドリッチキャット# SE1M003M00
20×20mmの顕微鏡カバースリップサーモフィッシャー・サイエンティフィック猫#22-170-371
アセトンサーモフィッシャー・サイエンティフィックカタログ# A18-1
細胞培養皿、100mmVWRカタログ#25382-166
細胞培養皿、60mmフィッシャー・サイエンティフィックキャット# 430166
細胞培養プレート、6ウェルVWRカタログ#62406-161
クライオバイアル、2 mLVWRカタログ# 89499-722
ジエチルエーテルサーモフィッシャー・サイエンティフィック猫 # 60-29-7
ジメチルスルホキシドサーモフィッシャー・サイエンティフィックCat# BP231-1
使い捨て滅菌フィルター、0.45およびマイクロ;mシグマ・オルドリッチキャット# SE1M003M00
DMEMコーニングカタログ# 15-017-CV
エタノール、200プルーフデコン・ラボカテゴリー#2701
ガラス顕微鏡スライドサーモフィッシャー・サイエンティフィックカタログ# 12-544-4
熱不活化胎児用牛血清アトランタ・バイオロジックス猫 #S11150
塩酸サーモフィッシャー・サイエンティフィック猫 # A144-212
ヒグロマイシンサーモフィッシャー・サイエンティフィック猫#10687010
ラージキムワイプキンバリー・クラークカタログ#34256
Lenti-X GoStix Plusキット宝猫#631280
メタノールサーモフィッシャー・サイエンティフィックカタログ#A452SK-4
MNNGモルポートキャット# N493990
NRH(1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル]-4H-ピリジン-3-カルボキシアミド)マリー・ミゴー またはニューケムサイエンシズ株式会社
PARG阻害剤(PDD00017273)シグマ・オルドリッチ猫#SML1781
PARPi阻害剤(ヴェリパリブ、ABT-888)MedChemExpressなど;カテゴリー# HY-10129
ペニシリン/ストレプトマイシンギブコカタログ#15140-122
ポリブレンシグマ・オルドリッチCat# TR-1003-G
tBuooohサーモフィッシャー・サイエンティフィックキャット# 180345000
TransIT-x2(トランスフェクション試薬)ミルスカテゴリ# MIR-6006
トリトン-X100VWR猫#0694
トリプシン-EDTAサーモフィッシャー・サイエンティフィック猫番号#25200-056
Vectashield(H-1000)フェード防止マウントメディウムサーモフィッシャー・サイエンティフィック猫#NC1695563
<強力>細胞株  
293-FT サーモフィッシャー・サイエンティフィックCat# R70007
(SV40 大T抗原で形質転換されたヒト胚性腎細胞から得られます)サーモフィッシャー・サイエンティフィックCat# R70007
LN428 寛大な贈り物該当なし
(ヒト膠芽腫腫瘍細胞株)イアン・ポラック博士(ピッツバーグ大学)該当なし
RPE-1 ATCCCat# CRL-4000
(ヒトhTERTで不死化網膜色素上皮細胞)ATCCCat# CRL-4000
U2OS ATCCカテゴリー# HTB-96
(ヒト骨肉腫細胞株)ATCCカテゴリー# HTB-96
組換えDNA
pMDLg/pRREラボストック#253Addgene、カタログ#12251
pRSV-Revラボストック#254アドジーン、カタログ#12253
pMD2.Gラボストック#252Addgene、Cat#12259
pLV-EF1A-LivePAR-Hygro
(LivePARはRNF146のWWEドメインで、アミノ酸残基100-182がEGFPと融合;ヒグロマイシン耐性カセットを含む)		ラボストック#1727Addgene、Cat# 176063 
Software and Algorithms 
Adobe Illustrator(図の準備用)アドビシステムズバージョン2024
GraphPad プリズムグラフパッドバージョン 10.5.0 (Mac OS X)
イメージJNIHhttps://imagej.net/ij/download.html

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