蛍光融合タンパク質ベースのレポーターを用いたジェノトキシン誘発性PARP1/PARP2活性化の可視化および定量解析

Summary

ここでは、固定哺乳類細胞におけるポリ(ADP-リボース)(PAR)濃縮焦点の細胞ベースの可視化、細胞内局在化、定量解析の方法を説明します。このアッセイにより、ジェノトキシン曝露細胞の核におけるDNA損傷によるPARP活性化部位の定量化が可能となり、塩基切除修復や単鎖断裂修復に関連する部位も含まれます。

Abstract

ポリ(ADP-リボース)(PAR)は、ADP-リボースポリメラーゼファミリーの4つの酵素群—PARP1、PARP2、PARP5a、PARP5b—によって合成されるADP-リボースのポリマーです。しかし、DNA断裂に反応してPARを合成するのはPARP1とPARP2のみです。PARはタンパク質の翻訳後修飾として定義されますが、DNAやRNA修飾としても存在することが示されています。PARのレベルはさらにPARGによって調節されます。PARGはPARグリコヒドラーゼであり、PARP1およびPARP2とともにDNA損傷誘発性PARの細胞レベルを調節します。PARの動的な合成と分解は、DNA修復およびDNA損傷応答における調節的役割に不可欠であり、これがクロマチンの再編成、複製、転写、細胞死に影響を与えます。PARP1/PARP2の活性化およびPARの蓄積は、塩基切除修復またはDNA単一鎖切断修復の部位とみなすことができます。しかし、多数のPARP1/PARP2活性化因子は複製ストレスやその他のDNA代謝過程とも関連しています。PAR鎖が形成されると、PAR鎖はPAR結合ドメイン(PBD)を通じてDNA損傷部位やゲノム損傷部位へのDNA修復およびDNA損傷応答(DDR)因子のリクルートを促進します。10種類の異なるPBDは、PAR結合モチーフ、PAR結合亜鉛指、WWEドメイン、マクロドメインなど、PAR分子のさまざまな領域を認識しています。PARダイナミクスの細胞解析を促進するために、PBDを強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)に融合させて、細胞ベースのPAR焦点の定量最適化を行いました。PBD/WWEドメインをコードするRNF146の断片を用いてEGFPに結合し、ゲノム損傷部位および進行中のBERまたはSSBR部位におけるPAR蓄積を可視化・定量化するアッセイを記述します。レンチウイルス粒子の産生、標的細胞株のトランスダクション、哺乳類細胞のゲノム損傷誘導処理、共焦点蛍光顕微鏡の取得、データの半自動化定量化などの実験ステップを説明します。

Introduction

このプロトコルはLivePARアッセイを説明しており、哺乳^{類細胞における}ゲノム損傷部位、主に塩基切除修復(BER)または単鎖切断修復(SSBR)に関連する部位におけるポリ(ADP-リボース)(PAR)の可視化と定量解析^{を可能にします。}BERはDNAから損傷または修飾された塩基を除去する重要なDNA修復経路です(BERおよびPARylationのレビューは4,5,6,7参照)。BERは、修飾塩基⁴を認識・切断し、アピリン系/アピリミジン系(AP)部位を残すDNAグリコシラーゼから始まります。例えば、メチルプリングリコシラーゼ(MPG)はメチル化された塩基^8,9を切断し、8-オキソグアニングリコシラーゼ(OGG1)は8-オキ^ソグアニングリコシラーゼ(OGG1)を切除^します。その後、AP部位はAPエンドヌクレアーゼ1(APE1)^11,12,13によって切断され、DNA骨格に切り欠きが生じます。ポリメラーゼ、すなわちDNAポリメラーゼβ(Polβ)^14,15が損傷していない鎖をテンプレートとして調整・埋め、最後にDNAリガーゼが修復された鎖^16,17を封じます。例えば、DNAリガーゼIやDNAリガーゼIIIが挙げられます。

BERおよびSSBRの主要なプレーヤーは、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ1および2(PARP1/PARP2)18,19,20で、BERまたはSSBR中にDNA鎖の切断を迅速に検出する酵素です。これらの断裂を検出すると、PARP1/PARP2は自身や他のタンパク質にADPリボースポリマーを付加させる(PARylationと呼ばれ、レビュー参照^6参照)。これはNAD⁺を加水分解することで行われる。これにより動的なタンパク質スキャフォールド(PAR)が形成され、他のDNA修復因子を損傷部位に誘導し、DNA修復の忠実度を高めます。この動的なPARスキャフォールドを管理するために、ADP-リボース受容体ハイドロラーゼ3(ARH3)、末端ADP-リボース糖基ハイドロラーゼ1(TARG1)、モノ-ADP-リボシルハイドロラーゼ1/2(MacroD1/2)、およびポリ(ADP-リボース)グリコハイドローラーゼ(PARG^{)6,21,22,23,24,25,26}など、PAR鎖の加水分解および除去に寄与します.しかし、PARGはこの過程を主に担い、DNA損傷応答(DDR)^28,29において重要な役割を果たしています。

したがって、PARGはPARP1およびPARP2の機能と極めて密接に関連しています。PARP1およびPARP2がPARポリマーを生成する一方で、PARGは「クリーンアップ」酵素としてこれらのポリマーを加水分解し、PARylationを効果的に逆転^{させます。}このプロセスはBERとSSBRの両方を完成させ、PARP1/PARP2が新たなDNA損傷に反応するためにリサイクルされるために不可欠です。したがって、PARP1、PARP2、PARylation、PARGは協調的に機能し、BERおよびSSBR ^4,6を通じて効率的かつ可逆的なDNA修復を保証します。

PARylationの程度は様々な要因によって影響を受け、DNA損傷応答全体に重要な役割を果たします³²。これらの要因には、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(MNNG)、メチルメタンスルホン酸塩(MMS)、過酸化水素(H₂O₂)、またはテルブチルヒドロペルオキシド(tBuOOH)などのDNA塩基に付加するジェノトキシンへの曝露が含まれます。さらに、PARylationの程度は、NAD⁺の前駆体であるジヒドロニコチンアミドリボシド(NRH)や、NAD⁺レベルを増加させることでPARP活性化を促進するNAMPT阻害剤FK866など、PARylationプロセスを調節する分子によって影響を受けることがあります。NAND-866はNAD⁺レベルを低下させ、PARP^活性化を負の調節を行います.最後に、PARP1/PARP2、PARG、その他のDNA修復タンパク質(例:BERの欠陥やBRCA1/BRCA2のような相同組換え因子)の遺伝子変異や小分子阻害がPARPの活性化を変化させる^{ことができます。}

LivePARアッセイは、WWEドメイン(アミノ酸100–182)をコードするリングフィンガータンパク質146(RNF146)の断片を利用し、増強グリーン蛍光タンパク質(^EGFP)と結合しています3。WWEドメインは、結合部位³⁷に保存されたトリプトファン(W)とグルタミン酸(E)にちなんで名付けられた球状ドメインです。WWEドメインはPAR鎖内で最も小さい内部構造単位であるiso-ADP-リボースに結合します^38,39。RNF146はE3ユビキチンリガーゼで、iso-ADP-リボース^38,40を認識し、BERに関与するタンパク質(XRCC1、DNA ligase III、PARP1)を標的化し、プロテアソーム分解を図ると報告^{されています。}このWWEドメインをEGFPに結びつけることで、哺乳類細胞におけるジェノトキシン誘導PARylation部位の可視化と検出が可能になります。本プロトコルでは、LivePARレポーターを発現する安定細胞株の生成(図1A)、PARP1/PARP2を活性化するためのDNA損傷誘導、PARの生成、共焦点蛍光顕微鏡データの取得と解析(図1)を記述します。

pMD2.g(VSVG)プラスミドはウイルスエンベロープ糖タンパク質(VSVG)を提供し、ウイルスが感染可能な細胞の範囲をネイティブのレンチウイルスエンベロープタンパク質と比較して拡大します。pRSV-REVプラスミドは調節要素(REV)タンパク質を提供し、これはウイルスRNAに結合しウイルス遺伝子の転写を活性化する重要なトランスアクチベーターです。効率的なウイルス複製に不可欠です。pMDLg/pRREプラスミドは、マトリックス(MA)、カプシド(CA)、ヌクレオカプシド(NC)タンパク質をコードするgag、ウイルス複製と宿主細胞ゲノムへの統合に必要な酵素をコードするpol、そしてウイルスRNAの翻訳効率とゲノムRNAパッケージングの効率を高めるRNA調節要素(RRE)という、いくつかの重要な内部パッケージングコンポーネントを提供します。pLV-EF1A-LivePAR-Hygroプラスミド(図1A)は、RNF146(アミノ酸100–182)のWWEドメインC末端に融合した強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)をコードするcDNAを含み、またベクターはポリ(ADP-リボース)鎖に結合するタンパク質ドメインです。また、ベクターはヒグロマイシン抵抗性カセットもコードしています。ウイルスは細胞培養上清液から分離され、-80°Cで保存するか、すぐに転移に使用されます(図1B)。

Protocol

1. レンチウイルスの産生

注:このプロトコルは、遺伝的にコードされたPARレポーターを発現する細胞を生成するために、第3世代レンチウイルスパッケージングシステム^42,43を使用しています。レンチウイルス粒子は、エンベロープ、調節、パッケージングからなる4つのプラスミドシステムと、RNF146のEGFPタグ付きWWEドメインをコードするpLV-EF1A-LivePAR-Hygro構成体を用いて293FT細胞で作製され、これはポリ(ADP-リボース)鎖に結合します。得られたウイルスは、PAR蓄積の可視化と定量化のための安定した細胞株を生成するために使用されます。

1. DMEM中の低通過率293FT細胞を、10%のFBSおよび1%のペン/連鎖球菌を含むものを、37°Cの加湿環境と5%の_CO2で培養します。293FTの細胞が培養期間が3週間を超えていないことを確認してください。
   注:私たちは通常、293FTの細胞を使用し、パスセージ番号は3から10の範囲です。293FT細胞がSV40大型T抗原によって形質転換され、不死化されました。これらの細胞は高いトランスフェクション効率を持ち、組換えタンパク質の産生や遺伝子発現研究に不可欠です。脂質系トランスフェクションおよびウイルストランスダクション法の両方に良好に反応します。
2. 1日目に1.7×10個、⁵ 個、293FTの細胞を60mmの組織培養皿に5.5mLの培養培地でプレートします。細胞をインキュベーターに戻して24時間待つ。
3. 2日目(トランスフェクションの日)に、FBSおよびPen/Strepを含まないDMEM培地375μLを1.5mLの無菌マイクロ遠心分離管に追加します。次に、脂質系トランスフェクション試薬10 μg、pLV-EF1A-LivePAR-Hygroプラスミド4 μg、pMD2.g(VSVG)プラスミド2 μg、pRSV-REVプラスミド2 μg、pMDLg/pRREプラスミド2 μgを加えます。マイクロ遠心分離チューブを優しく叩き、培地、トランスフェクション試薬、プラスミドDNAを混ぜます(渦巻きを避けるため)。室温で15〜30分間インキュベートし、DNA/トランスフェクション試薬複合体の形成を促します。
4. プラスミド/トランスフェクション試薬混合物を、トランスフェクト対象の293FT細胞を含む60mmディッシュに、培地を除去せずにドロップごとに加えます。細胞はインキュベーターに戻し、48時間保存してください。
   注:この期間はレンチウイルス粒子が成長培地に生成・放出される期間です。
5. 4日目には、トランスフェクトした293FT細胞から培養培地を採取し、レンチウイルス粒子を単離します。無菌の0.45μmフィルターを通して、レンチウイルス粒子から細胞の残骸を分離します。
6. 利用可能な試薬でレンチウイルスのタイターを決定します(任意)。
   注:この方法は一般的に10⁵ から10⁶ 感染単位(IFU/mL)を生成し、以下のトランスダクションステップで述べた使用時の感染倍数(MOI)はおおよそ~5と相関します。
7. レンチウイルス粒子を含む培地を4つの滅菌クライオビアル(1本あたり1.0 mL)に分割し、-80°Cで保存します。

2. トランスダクション

注:この節では、細胞株にトランス遺伝子を導入するためのレンチウイルストランスデューションプロトコルを概説しています(図1B)。私たちのラボでは1^{、3、33、37、44、45}で一貫して効果的でした。

1. 適切な培地で選んだ細胞株(低い染色数)を、湿度37°C、_CO25%で培養します。
   注意:まずは必要な細胞タイプの早期通過から始めてください。新しい細胞のバイアルは、シードをしてから少なくとも一度は解凍し、配管しなければなりません。
2. 1日目に、1ウェルあたり10⁵–1.5 ×10⁵ 細胞を1ウェルごとに2 mLの培養培地で6ウェルプレートの各ウェルに×シードします。細胞をインキュベーターに戻して24時間過ごしてください。
3. 2日目(トランスデューション日)には、細胞の濃度が20%から40%の間であることを確認してください。15mLの円錐形チューブにウイルス1mL、培地1mL、ポリブレン2μL(ストック2 mg/mL)を加え、逆転で優しく混ぜます(渦巻きを避ける)。
   注:ポリブレンはレンチウイルスのトランスデュクション中にウイルス粒子と細胞膜間の静電気反発を防ぐために使用されます。ポリブレンは正に帯電しているため、負に帯電したウイルス糖タンパク質と相互作用し、その電荷を中和します。さらに、ポリブレンは細胞培養培地中のグリコサミノグリカンに結合し、ウイルスとの相互作用を防ぎます。したがって、ポリブレーンはトランスダクション効率を大幅に向上させます。
4. 6ウェルプレートから培養培地を取り出し、各ウェルにウイルス・培地/ポリブレンの混合液を加えます。トランスダクション混合液を、32 ^°Cの加湿大気と5%_CO2 のインキュベーターに16〜18時間置きます。
   注:レンチウイルストランスダクション中に32°Cで一晩細胞を培養することは、ウイルス感染効果を大幅に向上させる一般的な手法ですが必須ではありません。温度を下げると細胞の代謝が遅くなり、細胞防御が低下し、ウイルス感染への感受性が高まります。
5. 3日目には、ウイルス導入細胞の培地を新しい培地に置き換え、37°Cのインキュベーターに移します。48時間潜伏してください。
   注:この2日間は、細胞がRNF146(100–182)-EGFPトランスジーンを産生し、ヒグロマイシンに対して耐性を持つのに十分です。
6. RNF146(100–182)-EGFPトランスジーンを発現するポリクローナル安定細胞株を開発するために、ステップ2.5で示された2日間のインキュベーション後にヒグロマイシン選択を開始します。
   1. あるいは、ヒグロマイシンが存在しない状態でこの遺伝子変換細胞群を拡大し、次の10〜14日間にわたりPAR解析に利用する(一時的トランスダクション)方法も検討します。前述の^通りです。
7. ヒグロマイシンの存在下で細胞を成長したら100mmのプレートに移し、必要なだけ増殖させます。
8. 将来利用のために、遺伝子移植細胞のクライオストックを準備します。
9. 第3節で述べたように、RNF146(100–182)-EGFPトランス遺伝子の発現を共焦点顕微鏡で検証すること。RNF146(100–182)-EGFPトランスジーンは細胞全体に発現します。
10. RNF146(100–182)-EGFPトランスジェーンの発現を免疫ブロッティングで検証し、^{他の文献で}記述されていることを確認します^1,37。

3. 共焦点顕微鏡および解析

注:このプロトコルのセクションでは、カバースリップの準備、LivePAR発現細胞のシーディング、処理(tBuOOH、MNNG、PARGi、PARPi、および/またはNRH)への曝露、および顕微鏡スライド上の固定細胞の共焦点イメージングおよびPAR焦点解析の準備について詳述しています(図1C)。また、ImageJソフトウェアとPAR焦点の半自動定量化のためのカスタムマクロの使用についても説明しています。このプロトコルは、DNA損傷依存的なPARylationに与える様々な因子(例:小分子、BERタンパク質ノックアウトなど)の影響を調査するために用いられ、当研究室で成功裏に運用^{されています。}

1. カバーリップの準備
   1. 20 × 20mmのカバースリップをガラス容器の排気フード内のジエチルエーテルに20分間浸します。
      注意:ジエチルエーテルを扱う際は、可燃性と潜在的な危険性があるため、フームフードを使用してください。
   2. ジエチルエーテルを取り除き、カバースリップをエタノール濃度を徐々に減らして洗います[100%、70%、50%、そして0%(ddH₂O)]。
   3. 水を抜き、カバースリップを1N HClに20分間優しくかき混ぜて浸します。
   4. HClを除去し、カバースリップをddH_2.0で3回洗います。
   5. カバースリップは使用まで70%エタノール、4°Cで保存してください。
2. セルのメッキ
   1. 20mm×20mmの滅菌カバースリップを60mmの細胞培養皿に並べて置きます。実験に必要なだけ料理を用意してください。カバースリップを入れた皿にセルを加える前に、すべてのエタノールが蒸発していることを確認しましょう。残留したエタノールは、無菌PBSを10〜15分間入れて洗い流します。細胞をシードする前にPBSを除去してください。
   2. 細胞培養皿あたり20万個のLivePAR発現細胞を種子化。細胞がカバースリップに24〜36時間付着し、培地を調整して増殖(増殖)を開始します。
3. PARフォーカスの誘導
   1. LivePAR発現細胞を100μM NRH、10μM PARGi、10μM MNNGまたは40μM tBuOOHにさらします。さらに、PARP1/PARP2依存性PAR形成を検査するために、10μMのPARPiを加えてPARP1/PARP2を阻害します。カバースリップの細胞を含む培地に直接化合物を加え、培地を優しく攪拌して化合物を分散させます。60mmの皿は37°Cで60〜90分間孵化します。
      注:NRHは、最適なPARP1/PARP2介在PARylation 33,46,47のために十分な細胞内NAD+レベルを確保するために使用されます。PARGiは、PARP1/PARP2によって合成されたPAR鎖がPARGによって分解されるのを防ぐために使用されます。MNNGまたはtBuOOHはDNA塩基修飾を誘導してBERを開始させ、PARP1/PARP2の活性化につながります。PARPiは、信号(焦点)がPARP1/PARP2の活性化によって生じることを確認するために用いられます。
4. セルの固定とカバースリップの取り付け
   1. 培地を取り除き、PBSで洗います。
      注意:細胞培養に使う培地には血清タンパク質の濃度が高いため、PBSで1回か2回洗浄することが重要です。PBSで洗浄すると、メディア中に残留するMNNGやtBuOOHも除去できます。
   2. 4%ホルムアルデヒドをPBSに15分間室温でプレフィックスします。PBSで細胞を3回洗浄します。
   3. 細胞に3mLの冷水(-20 ^°C)メタノール(アセトン、7:3)を加えて固定します。皿を-20 ^°Cで9分間置きます。
   4. メタノールを除去する:アセトン。PBSで3回洗ってください。
   5. ガラススライドにDAPIを含むアンチフェード培地15μLをピペットで置きます。セルを内側に向けて、カバースリップを装着培地の位置に優しく取り付け、気泡を最小限に抑えます。
   6. カバースリップの側面を中央に固定し、ガラススライドに少量のクリアトップコートネイルエナメルを塗ってシールします。スライドを暗闇に置き、トップコートのネイルエナメルが乾くまで待ちます(~10分)。スライドは4°Cの暗闇で保存し、撮影準備をします。
5. イメージングセル
   1. すべてのスライドを63×倍以上で共焦点顕微鏡で画像化します。488 nmレーザーでPAR焦点を検出し、405 nmレーザーで核染色(DAPI)を検出します(例: 図2参照)。

Results

LivePARプローブを発現する細胞は、RNF146(100-182)-EGFP融合タンパク質をコードするレンチウイルスを産生することで生成されます(図1A)。細胞は、トランスダクション後最大2週間の一時的な発現後、またはヒグロマイシンで選択後の安定した細胞株として評価することができます(図1B)¹。ジェノトキシン処理後、DNA損傷誘発性PAR焦点を核内で可視化し、固定後は共焦点蛍光顕微鏡で画像化されます(図1C)。画像は車両制御セルにおける汎細胞間のEGFP染色を明らかにしています(図2、上部)。しかし、ジェノトキシン処理細胞は核焦点の蓄積を示し、これはPARに結合したRNF146(100-182)-EGFPの局在を示しています(

Discussion

LivePARアッセイは、PARP1/PARP2がPAR鎖を積極的に合成している核ゲノムDNA損傷部位を検出するために開発されました。これを達成するために、WWEドメイン(アミノ酸100–182)をコードするRNF146の断片をEGFP 1,2,3,37に融合させました。私たちが記述した追加のPARプローブは、DTX4のアミノ酸残基1から166、PARP11のアミノ酸残基22から112、DTX2のアミノ酸1から178に融合したEGFPをコードし、それぞれ拡張されたWWEドメイン³⁷をコードし、PARのiso-ADP-リボース部分を認識しています。さらに、最近では、EGFPがAf1521³⁷の遺伝子操作マクロドメインに融合し...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<ストロング>試薬、化学物質、ペプチド
0.45 & micro;m Durapore steriflipフィルター	シグマ・オルドリッチ	キャット# SE1M003M00
20×20mmの顕微鏡カバースリップ	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	猫#22-170-371
アセトン	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	カタログ# A18-1
細胞培養皿、100mm	VWR	カタログ#25382-166
細胞培養皿、60mm	フィッシャー・サイエンティフィック	キャット# 430166
細胞培養プレート、6ウェル	VWR	カタログ#62406-161
クライオバイアル、2 mL	VWR	カタログ# 89499-722
ジエチルエーテル	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	猫 # 60-29-7
ジメチルスルホキシド	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	Cat# BP231-1
使い捨て滅菌フィルター、0.45およびマイクロ;m	シグマ・オルドリッチ	キャット# SE1M003M00
DMEM	コーニング	カタログ# 15-017-CV
エタノール、200プルーフ	デコン・ラボ	カテゴリー#2701
ガラス顕微鏡スライド	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	カタログ# 12-544-4
熱不活化胎児用牛血清	アトランタ・バイオロジックス	猫 #S11150
塩酸	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	猫 # A144-212
ヒグロマイシン	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	猫#10687010
ラージキムワイプ	キンバリー・クラーク	カタログ#34256
Lenti-X GoStix Plusキット	宝	猫#631280
メタノール	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	カタログ#A452SK-4
MNNG	モルポート	キャット# N493990
NRH(1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル]-4H-ピリジン-3-カルボキシアミド)	マリー・ミゴー またはニューケムサイエンシズ株式会社
PARG阻害剤(PDD00017273)	シグマ・オルドリッチ	猫#SML1781
PARPi阻害剤(ヴェリパリブ、ABT-888)	MedChemExpressなど;	カテゴリー# HY-10129
ペニシリン/ストレプトマイシン	ギブコ	カタログ#15140-122
ポリブレン	シグマ・オルドリッチ	Cat# TR-1003-G
tBuoooh	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	キャット# 180345000
TransIT-x2(トランスフェクション試薬)	ミルス	カテゴリ# MIR-6006
トリトン-X100	VWR	猫#0694
トリプシン-EDTA	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	猫番号#25200-056
Vectashield(H-1000)フェード防止マウントメディウム	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	猫#NC1695563
<強力>細胞株
293-FT	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	Cat# R70007
(SV40 大T抗原で形質転換されたヒト胚性腎細胞から得られます)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	Cat# R70007
LN428	寛大な贈り物	該当なし
(ヒト膠芽腫腫瘍細胞株)	イアン・ポラック博士(ピッツバーグ大学)	該当なし
RPE-1	ATCC	Cat# CRL-4000
(ヒトhTERTで不死化網膜色素上皮細胞)	ATCC	Cat# CRL-4000
U2OS	ATCC	カテゴリー# HTB-96
(ヒト骨肉腫細胞株)	ATCC	カテゴリー# HTB-96
組換えDNA
pMDLg/pRRE	ラボストック#253	Addgene、カタログ#12251
pRSV-Rev	ラボストック#254	アドジーン、カタログ#12253
pMD2.G	ラボストック#252	Addgene、Cat#12259
pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (LivePARはRNF146のWWEドメインで、アミノ酸残基100-182がEGFPと融合;ヒグロマイシン耐性カセットを含む)	ラボストック#1727	Addgene、Cat# 176063
Software and Algorithms
Adobe Illustrator(図の準備用)	アドビシステムズ	バージョン2024
GraphPad プリズム	グラフパッド	バージョン 10.5.0 (Mac OS X)
イメージJ	NIH	https://imagej.net/ij/download.html