シュミット地中海におけるカンジダ・アルビカン感染の最適化プロトコルを、真菌の病因と宿主防御の研究を目的としています

サマリー

本プロトコルは、プラナリアのシュミッテア地中海をモデルシステムとして用いて、真菌感染時の宿主-病原体の相互作用を研究するための最適化された詳細なガイドを提供します。この方法は、人間の真菌病原体カン ジダ・アルビカンスをプラナリアに感染させるための従来の手法を基にしており、再現性と実験の一貫性を高めるための詳細な指針を提供します。

要約

カンジダ・アルビカンスは、ほとんどの人間に無症状で定植する一般的な機会性真菌病原体です。通常は良性の共生性ですが、抗生物質の使用、免疫機能障害、または上皮バリアの破壊による菌叢乱は、表層粘膜疾患から生命を脅かす全身性カンジダ症まで、真菌の過剰増殖や感染を引き起こすことがあります。異なる感染段階および異なる測定可能な宿主アウトカムを対象に、C. albicansの病因をin vivoで解明するためには、新たな前臨床感染モデルが必要です。プラナリアのシュミットテア地中海は、以前からC. albicans感染時の宿主-病原体相互作用研究のための無脊椎動物宿主として確立されていました。地中海サウスは、細菌や真菌を含む病原性微生物による感染を克服できる保存された自然免疫機構に完全に依存しています。プラナリアンの卓越した再生能力とアクセス可能な幹細胞集団により、この生物は早期免疫応答、組織修復、病原体除去を生体内で解析するのに適したモデルとなっています。このモデルは、真菌の病原性と宿主の転写応答の同時解析を支援し、感染動態に関する貴重な洞察を提供します。ここでは、C. albicansによるS. mediterraneaへの感染に関する詳細な修正、標準化された手順、最適化された手順を備えた最新のプロトコルが提示されており、再現性を高め、真菌の病因および宿主防御の体系的な研究を可能にすることを目的としています。

概要

カンジダ・アルビカンスは、無症状で人間の50〜70%に定着する一般的な機会性真菌病原体です(^1,2,3)。通常、無害な共生菌であるC. albicansは、微生物叢の不均衡、抗生物質の使用、免疫抑制、上皮バリアの破壊、医療機器の存在などの条件下で過剰成長し、表層粘膜感染から生命を脅かす全身性カンジ^ダ症に至るまで幅広い疾患を引き起こすことがあります。.免疫抑制状態の人々、HIV/AIDS患者、化学療法や免疫抑制療法を受けている患者、慢性疾患を持つ患者、集中治療室にいる患者では、死亡率が70%を超えることがあり、侵襲性カンジダ症の重大な公衆衛生負担を強調しています ^6,7,8.世界的に見て、侵襲性真菌感染症は年間650万人以上に影響を及ぼしており、アメリカ合衆国だけでカンジダ関連感染症の直接医療費は年間80億ドルを超え^{ています。}利用可能な抗真菌治療法にもかかわらず、C. albicans感染に関連する罹患率と死亡率は数十年にわたりほとんど変化が見られず、真菌疾患における宿主と病原体の相互作用をより深く理解する緊急の必要性を強調しています。

C. albicansは多様な病原性因子を用いており、さまざまな宿主環境での定着、持続、病原性を支えます。これには宿主組織への接着、免疫回避、細胞壁の再形成、加水分解酵素の分泌、形態的可塑性、バイオフィルム形成(11,12,13,14,15,16)が含まれます。これらの形質は、C. albicansが多様な宿主ニッチに適応し、免疫応答を調節し、抗真菌療法に抵抗することを可能にしています(16,17,18,19,20,21)。これらのプロセスが宿主の罹患率、死亡率、病原体除去など感染結果にどのように影響するかを明らかにすることは、より効果的な予防および治療戦略の開発に不可欠です。

これらの宿主-病原体の動態を調べるため、プラナリアのシュミッテア地中海を宿主としてモデルシステム22,23,24を構築しました。このモデルは、浸漬を基盤とした感染法を活用し、C. albicansへの同時曝露を可能にする多系統宿主反応を研究するための多用途プラットフォームとして機能します。以下のセクションでは、このプロトコルを洗練させ、再現性を高め、ラボ間での一貫した実施を促進するためのステップバイステップの手順を紹介します。

プラナリアは自由生活の無脊椎動物で、卓越した再生能力を持ち、損傷や感染で失われた組織を迅速に補充できます²⁵。彼らは適応免疫系を持たず、パターン認識受容体、抗菌ペプチド、粘液分泌、貪食細胞などの保存された自然防御に完全に依存して、^{26日、27日、28}日^、29日以内に細菌や真菌病原体を排除します。自然免疫は真核生物における第一防衛線であり、哺乳類系以外では十分に研究されていないため(²⁷)、プラナリア人はこれらの過程を細胞および分子レベルで生体内で研究する機会を提供します。再生能力は成体多能性幹細胞(新芽細胞)によって駆動されており、これらは成体細胞の約30%を占め、感染後の回復に寄与します^23,30。これらの特徴により、S. mediterraneaは遺伝的、細胞的、組織的、生物のスケールで病原体の病原性と宿主防御を解剖する強力なモデルとなり、従来の哺乳類システムでは研究が難しい課題に取り組むことを可能にします。

さらに、プラナリア類の小型サイズ(通常は数ミリメートル)、低コスト^{、メンテナンスの}容易さにより、脊椎動物モデルに内在する財政的、倫理的、規制上の制約を回避しつつ大規模な実験を可能にしています。C. albicansと同様に、S. mediterraneaはゲノム的に扱いやすく、完全に配列決定・注釈されたゲノムを持ち、転写プロファイリング、高解像度免疫組織化学・組織学、堅牢なRNA干渉(RNAi)などの高度な分子・細胞技術をサポートしています。32,33,34,35,36,37,38.これらのツールは、感染中の宿主および病原体の応答を並行分析することを可能にします。

真菌感染の研究にはいくつかの代替的な前臨床モデルが用いられています。 Galleria mellonella (ワックスガ)、 Caenorhabditis elegans (回虫)、 Drosophila melanogaster (ショウバエ)、および脊椎動物 のDanio rerio (ゼブラフィッシュ)などの無脊椎動物宿主は、それぞれ実験的には明確な利点を提供しますが、顕著な限界もあります。これらのシステムは生存を主要な終点としていることが多いです。なぜなら、感染は急速に宿主の死を引き起こし、罹患率、回復、多系統反応の詳細な評価を妨げるからです。プラナリアンモデルはこれらの特徴を容易に捉えています。

Mus musculus(マウス)、Rattus norvegicus(ラット)、Oryctolagus cuniculus(ウサギ)、Cavia porcellus(モルモット)などの哺乳類モデルは、人間の生理学をより正確に再現していますが、高コスト、小規模なコホート、倫理的・規制上の要件、そして自然免疫反応と適応免疫応答の区別の難しさに制約されています。さらに、マウスにおける数十年にわたる真菌病原研究は主に後期全身感染に焦点を当ててきました。39,40,41,42,43であり、上皮バリアの破壊や粘膜過剰増殖といった初期の出来事を見落としがち^{です。これらは}ヒトにおける真菌病の最も一般的な経路^です。

したがって、宿主と病原体の相互作用を研究することは、真菌の病原性、宿主防御、病気の進行の背後にある生物学的プロセスを理解する上で不可欠です。侵襲性真菌感染症は世界的な脅威を増大させており、複数の種が主要な抗真菌薬クラスすべてに対して耐性を示しています。10億人以上が真菌感染の影響を受けていると推定されており、気候変動、抗菌薬の広範な使用、免疫不全患者の増加などの要因が抗真菌耐性病原体の出現を加速させ^{ています。}病原性菌類がどのように宿主と共存し相互作用するかを理解することは、新たな予防および治療戦略の開発に不可欠です。

以下は、S . mediterraneaとC. albicans の相互作用に関する改訂・標準化された全身感染プロトコルを説明し、再現性を促進し、真菌の病因および宿主防御機構の体系的調査を可能にすることを目的としています。元のプロトコルは、以前の出版物^22、23、24でも採用されました。 表1は 、この改訂版に組み込まれた主要な更新内容をまとめており、真菌接種手順の改善、井戸容量の減少、動物の包含基準の定義、感染量および致死量の決定、そして最新の畜産推奨事項が含まれます。このワークフローは、 C. albicansの培養、浸漬曝露によるプラナリアへの感染、症状および致死量条件下での定性的および定量的指標を用いた真菌病原性と宿主反応の評価に関する詳細な指針を提供します(図1)。ここで提示する最適化された手技は、感染動態や宿主アウトカムの主要な決定要因として実証的に特定された変数を取り入れており、再現性を高め、宿主と病原体間の相互作用の体系的な評価を可能にします。

プロトコル

このプロトコルは前述の手法22,23,24を基盤とし、再現性を高め、南地中海における真菌病因および宿主応答の体系的調査を可能にする明確で標準化された手順を確立します。主要なプロトコルの改良には、あらかじめ定められた動物の包含・除外基準、標準化された微生物調製、宿主エンドポイントの包括的な評価が含まれます。

すべての処置は、適切な無菌および無菌バイオセーフティレベル2技術を用いて行われなければなりません。標準的な実験室用個人用防護具(PPE)は、手袋、白衣、つま先の閉じた靴を常に着用してください。プラナリアの 地中海 動物を用いた処置は、無脊椎動物の倫理的利用に関する制度的ガイドラインに従って実施されました。

すべてのプロトコルの改良は 表1にまとめられています。すべての試薬、重要機器、培地、バッファー、免疫染色レシピは 材料表 および 表2に記載されています。
注:無脊椎動物モデルS . mediterranea を対象としたすべての処置は、動物福祉の最高水準を確保するために実施されるべきです。 南地中海 は自然の生息地を模した最適な環境に飼育されるべきです。実験は、研究全体を通じて倫理的な治療を確保するために、潜在的な痛みや苦痛を最小限に抑えるよう設計されるべきです。

1. 菌類培養

1. C. albicans 株情報
   1. すべての実験で野生型株として標準的な C. albicans 株SN250⁵¹ が使用され、真菌遺伝学ストックセンター(http://www.fgsc.net/)で公開されています。SN250は臨床分離株SC5314から抽出されており、もともとは播散性カンジダ症⁵²の患者の血液培養から採取されました。
   2. C. albicans 株は−80°Cで25%グリセロールストックとして維持されます。
2. 感染のための C. albicans 株の培養
   1. クライオジックストックからのストリーク
      1. 滅菌アプリケーターを使い、−80°Cのストックから酵母ペプトンエキス(YPD)(酵母抽出1%、ペプトン2%、グルコース2%;pH6.8)の寒天プレートにストリークします。
      2. 30°Cで72時間静置培養します。
3. 一晩培養の準備
   1. 無菌のアプリケータースティックを用いて、無菌のホウケイ酸ガラス培養チューブ(18mm×150mm)で、単一のコロニーを4mL液体YPDに接種します。
   2. 同じ条件下で未接種のYPDを含む陰性コントロールチューブを含みます。
   3. チューブをゆるくキャップしてエアレーションを許可し、30°Cで16時間(10°C)で抱卵し、振動インキュベーター内で220rpm(軌道)で振る。
      注:陰性対照群で微生物の増殖が起きた場合は、実験を中止し、新しい培地と無菌技術で再開してください。
4. 収穫と洗浄セル
   1. 無菌技術を用いて、培養液を標識済みの15 mL遠心分離チューブに移します。
   2. 細胞をペレット状にするため、5分間~3,000 × g で遠心分離します。
   3. ペレットを乱さずにYPD上清液を慎重に除去してください。
   4. ペレットをプラナリア水に再懸浮させ(組成については 表2 を参照)、使用されるYPDの体積に相当します。
   5. ボルテックスでしっかりと混ぜます。
   6. 成長培地を完全に取り除くために、ステップ1.4.2-1.4.4をさらに2回繰り返します。
   7. 最終洗浄後、細胞ペレットを渦巻いて新鮮なプラナリア水に再懸浮させます。
5. C. albicans細胞濃度の定量化
   1. OD測定のための希釈
      1. 1:20希釈(50μL培養+950μLプラナリアン水)または代替の希釈因子を用いた無菌1.7mLマイクロ遠心分離チューブを3本準備します。よく混ぜてください。
      2. 1000μLのプラナリアン水を入れた空のチューブを準備します。
   2. 分光光度法
      1. 分光光度計を600 nm(外径₆₀₀)で測定するよう設定します。
      2. 分光光度計をプラナリア水で空にします。
      3. 希釈サンプルごとにOD₆₀₀ を測定し、値を記録してください。
      4. 3つの測定値を平均し、希釈係数を掛けてストック培養のOD₆₀₀ を算出します。OD₆₀₀ を細胞濃度に変換します。
         注意:光密度換算係数は各分光光度計ごとに経験的に決定されるべきです。使用された機器の種類に基づき、OD₆₀₀ of 1は約2 ×10⁷ C. albicans 細胞/^{mL 53}に相当します。
6. 実験接種物濃度の決定
   1. 各実験条件に応じて希望の接種量を準備します。
      注意:特に感染性または致死的エンドポイントに対して、プラナリアコロニーの有効用量を決定するために少なくとも3回の生物学的複製を実施してください。感染性および致死性接種物濃度の準備に関する代表的な計算は 補足ファイル1に示されています。

2. プラナリア属の種と維持管理

1. プラナリア種と維持
   1. すべての実験には、プラナリアの 地中海 のCIW4無性クローン系統を使用してください。
   2. プラナリアのコロニーは、1,500〜2,000 mLの1×プラナリア水を含む透明な食品グレードのプラスチック容器に保管してください。
   3. 容器は20°Cの暗闇に置き、蓋をゆるく閉めてガス交換を促します。
   4. プラナリアには抗生物質で治療しないでください。
2. コロニーの維持と摂食
   1. 週に一度、新鮮な牛レバーピューレをコロニーに与えてください。
   2. 容器は週に2回清掃してください。
   3. プラナリアの密度は1容器あたり200〜400頭に抑えましょう。以前の研究では、コロニーの準備や長期的な維持に関する詳細な手順が示されています。³¹。
3. 実験前の条件付け
   1. 実験的感染前に、代謝とサイズの条件を標準化するためにプラナリアを7〜12日間飢えさせます。
   2. 各実験条件ごとに1井戸あたり5〜10頭の動物グループを用いましょう。すべての条件(陽性・陰性対照)で動物の数が均等であることを確認しましょう。
4. 動物のサイズ選択
   1. 選択されるプラナリアは、約5mmの長さで^{、動物あたり}~5個、10個^×5個の宿主細胞に相当します。
   2. 5mm未満のプラナリアは避けてください。このサイズの動物には、胚芽腫や未完全発育の個体が含まれ、結果が一貫性に欠けることがあります。
   3. 5mmを超えるプラナリアは使用を避けてください。大型の動物は蛍光免疫染色に適さないからです。
   4. 感染線量(ID₅₀)および致死線量(LD₅₀)条件を確立する際には、約5mmのプラナリアを使用してください。
      注意:サイズ選択を一貫させるために、5 mm×5 mmの基準グリッドを印刷し、透明なプラナリア容器の下にプラスチック製バインダースリーブに入れてください。長さを測る前にプラナリアが完全に伸びていることを確認しましょう。
5. 健康および参加基準
   1. 重要なステップ:使用前にすべてのプラナリアを立体顕微鏡で検査してください。
   2. 目に見える損傷や怪我があり、以下の条件を含む動物は除外してください。
      1. 色素沈着のない組織(ブラステマ)や未完全な色素沈着の発生。
      2. 異常な色素沈着、例えば著しく濃い部分が見られること。
      3. 組織の欠損や損傷。
      4. 病変や傷跡。
      5. 開放傷。
      6. 形態的異常や変形。
      7. 慢性的または治癒しない状態。
   3. 発達異常のある動物は除外してください。
      1. 頭部や尾部が二分または重複しています。
      2. 体の形態が歪んでいるか非対称。
      3. 光受容体の数が誤り(両側の光受容体は1対のみ許容)。
      4. 咽頭の位置が異常です。
      5. 繊毛の欠陥により運動性が低下したり、滑空が不規則になったりします。
   4. 体長約5mmで、完全に発達し、目に見える怪我や異常がない動物のみを対象にしてください。
6. プレート準備
   1. すべての包含基準を満たす健康なプラナリアを、非組織培養処理済みの6ウェルポリスチレンプレート内の1井戸あたり2mLの新鮮なプラナリア水に移します。
      注意:感染の前日に移送し、新しい環境と個体密度に慣れるようにしてください。
   2. 以下の実験条件に井戸を割り当てます:
      1. 陰性対照群:感染していない動物または模擬処理された動物。
      2. 陽性対照群:野生型 C. albicansに感染した動物。
   3. 井戸全体の均一さを確保するために、すべての水を取り除き、2mLの新鮮なプラナリア水に置き換えてください。

3. 感染のセットアップ

1. 予防接種の準備(サンプル計算は 補足ファイル1 を参照)
   1. 無菌技術を用いて、6ウェルプレートをユーザーの方に傾けて優しくすべての水分を取り除きます。
   2. 計算されたプラナリアの水の体積を各井戸に加えます。
      注意:動物が乾燥しないように、一度に一つの井戸ずつ作業してください。
   3. 各井戸に計算されたC . albicans の培養物の体積を加えます。
      注意:動物を長時間空気にさらすことは避けてください。乾燥はストレスを引き起こし感染の結果に影響を与える可能性があります。
2. 実験的なプレートインキュベーション条件
   1. 接種済みの6ウェルプレートを暗く静止した室温の場所に置きます。
   2. 実験用プレートは、未感染のプラナリアコロニーとは別の場所に置き、交差汚染を防ぎます。
   3. 接種の日時(時刻0時)を記録してください。
      注意:人通りの多い場所や振動の多い場所(引き出し、器具の表面、混雑した作業台など)は避けてください。動くと動物にストレスを与え、結果に影響を及ぼす可能性があります。
   4. 目的に応じて最大72時間、C . albicans とプラナリアを培養します。
3. 菌類細胞の再懸濁
   1. 各時点で、プラナリアを乱さずに定着した C. albicans 細胞を優しく再懸垂させます。
      注:時間(感染後数時間[h]または日[d])は、初回曝露から経過した時間(時間0)を指します。
   2. 感染後24時間(HPI)
      1. 滅菌3mLのトランスファーピペットを使い、プレートを使用者側に少し傾けます。
      2. プラナリアの水を吸引し、動物がいない井戸のエリアに優しく注ぎ、沈着した菌類層を混ぜます。
      3. この工程を1井戸に5〜10回繰り返し、定着した菌類層を破壊し、プラナリアンとの直接接触を避けます。
      4. リスペンディングの前後に最もよく見えるように、暗い背景にキノコの定着を観察してください。
      5. 感染していない制御井戸を同じ条件下で再吊り下げます。
   3. 48馬力で
      1. 上記の再懸止手順を繰り返します。
      2. すべてのリサスペンション作業は指定された時間から1時間以内に行±。
4. 露光終了(72 hpi)
   1. 72 hpiでプラナリアを新しい6ウェルプレートに優しく移し、各井戸に2 mLの新鮮なプラナリア水を供給します。
   2. 菌類培養物の移動を最小限に抑えるために、液体の体積を最小限に抑えましょう。
   3. 動物が移送されたら、すべての水を取り除き、新鮮なプラナリアの水に置き換えます。
      注意: 動物や組織の破片は、機械的な損傷や追加のストレスを避けるために優しく扱ってください。

4. ホストエンドポイントの評価

1. 宿主結果の記録
   1. 感染後1日目(DPI)から宿主アウトカムの評価を開始し、目的の実験的エンドポイントまで毎日継続します。
   2. 標準化された0–3スコアリングシステムを用いて宿主の損傷を定量化します(図2)。
      スコア0:未感染対照群(健康、無症状)で変化なし。
      スコア1:軽度の症状。
      スコア2:重度の症状。
      スコア3:死。
2. 宿主症状評価の基準
   1. スコア0(無症状):
      1. 感染していない対照群と比較して、正常な形態、色素沈着、行動、反応性を示す動物を特定します。
   2. 評価1(軽度):
      無症状対照群と比較して、以下の症状のいずれかが観察された場合、軽度のスコアを付与します。
      1. 移動速度の低下や異常な滑空行動。
      2. 部分的または完全な光誘導反応の喪失。
      3. 持続的または繰り返しの体の収縮。
      4. 異常または不均一な色素沈着(明るいまたは暗い領域)。
      5. 頭部または尾部組織の後退。
   3. スコア2(深刻):
      動物が生きている間に以下の症状が1つ以上出現した場合、重度スコアを付与します。
      1. 片目または両目の喪失。
      2. 頭部完全喪失または前方組織の顕著な損傷。
      3. 咽頭前領域の主要な組織喪失。
      4. 複数の体領域(頭節、咽頭節、後節)への断片化。
      5. 粘液分泌や内部漏れの有無にかかわらず、開放性創。
      6. 部分的な組織溶解による構造的完全性の喪失。
      7. 「C字型」の姿勢、麻痺、または重度の運動障害。
   4. スコア3(死亡):
      死亡を特定するのは、以下のいずれかの基準のいずれかです。
      1. 完全な組織溶解または全動物溶解。
      2. 刺激に対する完全な反応喪失。
      3. 回復や再生の失敗。
         注: 図2 は、宿主表現型の分類を一貫させるために、各スコアの代表的な画像と特徴を示しています。

5. 真菌曝露後の宿主生存率の決定

1. 3 dpiで、残留菌菌の移動を避け、新しい6ウェルプレートに優しく移します。そこには1井戸あたり2 mLの新鮮なプラナリア水が入っています。
2. 動物を光学顕微鏡(10倍の客眼鏡)で観察してください(≥10倍の客観点で)。
3. 補助ファイル2に記載されている標準化されたスコアシートを使用してホストの結果を記録してください。
4. 生きた動物の判定
   1. 以下のいずれかの基準に基づいて生きている動物を特定してください。
      1. ネガの光走性。
      2. 穏やかな転送ピペットの摂動への応答。
      3. 体の構造は無傷です。
      4. プレートへの安定した取り付け。
5. 死んだ動物の判定
   1. 死んだ動物は、以下のいずれかの基準に基づいて特定してください。
      1. 完全な溶解または崩壊(残留破片のみ)。
      2. 透明または内臓を切り取った体。
      3. 刺激に対する動きや反応の欠如。
      4. 再生不良(芽球形成の欠如)。
6. 死んだ動物の除去
   1. 死んだ動物や破片は顕微鏡で生存が不可能であることを確認した後にのみ除去してください。
   2. 重要なステップ:交差汚染や生存測定の変更を防ぐために、死んだ動物は直ちに除去してください。
   3. 残骸や真菌の残留物がある場合は、C . albicans の再播種やバイオフィルム形成を防ぐため、生き残った動物を清潔なプラナリア水を含む新しいプレートに移してください。
      注:視覚検査時には暗い背景の上に6ウェルプレートを置き、コントラストを改善し表現型評価を容易にします。

6. 真菌負荷評価

1. コロニー形成単位(CFU)の定量化
   1. 希望される感染時期にプラナリア(1日あたり1つの状態につき5〜10匹)を採取します。マッチした未感染/模擬対照群と野生型感染対照群を含めてください。
   2. ウェルを2mLの新鮮なプラナリア水で優しく2回洗い流し、背景にある C. albicans 細胞を除去します。
   3. プラナリアを滅菌・ラベル付き1.7 mLまたは5.0 mLのマイクロ遠心分離チューブに移し、残留水分をすべて除去します。
   4. 各チューブに新鮮なプラナリア水300μLを加えます。
   5. 無菌乳棒を使って動物を均質化し、大きな断片が残らなくなるまで(約30〜45秒)行います。
   6. 均質の連続希釈(例:1:10、1:100、1:1000)を行う。
   7. 各希釈液を100〜200μLをYPD寒天プレートにプレートし、アンピシリン、リファンピシン、ストレプトマイシン、ネオマイシンをそれぞれ50μg/mL補足します。滅菌ガラスビーズや無菌細胞スプレッダーを使って均等に広げてください。
   8. 板を板に乗せてから5〜10分間、液体が寒天に吸収されるようにしておきましょう。
   9. それぞれの希釈と状態ごとに三重のプレートを用意します。
   10. プレートは30°Cで48時間培養します。
   11. CFUを数え、希釈係数を掛けます。
   12. CFU値をプラナリアの数に正規化し、各条件ごとの平均CFUを計算します。例えば、5匹の均質動物から10×希釈された100コロニーが観察された場合、計算値は1匹あたり200 CFUとなります。

7. 免疫蛍光抗カンジダ 染色

1. 一般的な染色の考慮事項
   1. 特に指定がない限り、すべてのステップは室温で穏やかな軌道揺れ(100〜140rpm)で行ってください。抗体の詳細および試薬の供給源については 補足ファイル1 を参照してください。
      注意:ホルムアルデヒド、ドーデシル硫酸ナトリウム(SDS)、および過酸化水素は有害化学物質であり、機関の安全規則に従って取り扱う必要があります。ホルムアルデヒドは有毒で発がん性物質に分類されています。SDSは刺激物です。また、過酸化水素は強力な酸化剤で、火傷を引き起こす可能性があります。適切な個人用防護具(白衣、ニトリル手袋、つま先の閉め靴、安全ゴーグル)を着用してください。揮発性試薬を用いる手順を認証済みの化学煙幕で実施し、機関の環境衛生・安全ガイドラインに従って廃棄物を処分します。
2. サンプル採取
   1. 各実験条件と時間点から動物を収集します。
   2. 動物を2 mLのプラナリア水を含む標識付き20 mLのシンチレーションバイアルに移します。
   3. すべての液体を取り除き、新鮮なプラナリア水2mLで一度すすいで、その後再びすべての液体を洗い流します。
3. 固定と透過化
   1. 動物を7.5% N-アセチルシステイン(NAC)に1×PBSで3分間生贄にします。
   2. 溶液を取り出し、動物を4%ホルムアルデヒドに0.3%PBSTx浸して15分間固定します。
   3. 1×PBSで2回サンプルを洗い流します。
   4. 1%のSDSで15分間、透過サンプルを塗ります。
   5. 1×PBSで3回洗い流します。
4. 漂白
   1. 漂白剤は6%過酸化水素を1×PBSに浸し、明るいLEDライトの下で4〜12時間サンプルを採取します。
      注意:漂白がすぐに進めない場合は、固定サンプルを1×PBSで4°Cで最大1週間保存するか、100%メタノールで脱水して長期保存してください。
5. ブロッキングと抗体培養
   1. 動物を1×PBSを含む24ウェルプレートに移します。
   2. 2.5% PBS-TB(トリトンX-100および牛血清アルブミンを含むPBS)で、室温で4時間、または4°Cで8時間非特異的結合をブロックします。
   3. 一次抗カンジダ 抗体(PBS-TBに1:500)を用いて、室温で4時間、または4°Cで8時間培養します。
   4. 一次抗体を採取し、20分ごとに0.3%のPBSTxで8回洗い(合計~2.5時間)洗浄します。
   5. Alexa-568結合抗ウサギ二次抗体(PBS-TB中の1:800)を室温で4時間、または4°Cで8時間インキュベートします。
      注意:光漂白を防ぐためにサンプルを光から守ってください。抗体溶液は再利用可能です。
   6. 二次抗体を除去し、20分ごとに8回、0.3%のPBSTxで洗浄します。
6. オプションのスライドマウント
   1. 動物を顕微鏡スライドに置き、すべての動物を前向きに配置します。
   2. トランスファーピペットを使って余分な水分を除去します。
   3. ペーパータオルの端で残った液体を慎重に吸い取ります。
   4. 動物が完全に覆われるまで、150〜175μLのゲルバトール装着媒体(組成表2参照 )を滴ごとに加えます。
   5. 気泡が出ないように、カバースリップを慎重にサンプルの上にかけてください。
   6. ゲルバトールは少なくとも2時間固まってから画像診断を受けてください。
   7. スライドは涼しく暗い場所に保管し、長期保存しましょう。
7. イメージング
   1. 黄緑励起(~578 nm)を用いた画像サンプルと、オレンジ赤色放射(~603 nm)を観測します。
   2. 2倍対物レンズを使って、動物全体の染色パターンを観察してください。

8. トラブルシューティング

1. 感染結果が不安定の場合は、野生型SN250または他のベースライン株を用いて、5〜10〜10〜10⁷ 細胞/mL×段階で投与量調整曲線を実施します。
2. 各グループに5〜10匹の動物を含む生物学的複製を少なくとも3回実施します。
3. 交差汚染、無菌技術の失敗、株の生存可能性の問題、または動物の健康状態の悪さなどの潜在的な問題を特定するために、ネガティブおよびポジティブコントロール群を含めます。
4. 用量調整実験を完了した後、プールは重複してグループごとの中央値生存率を決定します。
5. Mantel–Cox対数ランク分析を用いて生存差を解析します。
6. カプラン–マイヤー生存分析を用いて、株や治療法間の死に至るまでの時間差を評価します。
7. 致死量未満または感染性の状態については、生存率ではなく症状のある宿主アウトカム(例:軽度または重度の表現型や真菌の定着)を分析します。
8. 宿主の反応を用量群間で比較し、後続の実験に適した感染用量または致死用量の範囲を決定します。

結果

プラナリアに C. albicans を感染させるための更新プロトコル(図1)と宿主の転帰を体系的に定量化するためのプロトコル(図2)を提示します。この洗練されたワークフローは、罹患率(症状を伴う疾患の重症度)、生存率(致死率)、真菌負荷(CFU)、病原体定着の時空間的動態(蛍光免疫染色)など、複数の感染パラメータの堅牢な評価を支援します。主に生死の二値を示すほとんどの無脊椎動物感染モデルとは異なり、このプラナリアモデルはより広範な感染結果と宿主の応答を捉えています。プラナリアは、亜致死感染による症状性疾患の進行やその後の回復など、さまざまな微生物チャレンジのエンドポイントに使用できます。また、致死量接種を含む生存試験にも使用可能です。これらの能力は、プラナリアンの多様な疾患転帰における宿主-病原体相互作用の柔軟な調査プラットフォームとしての多様性を示しています。

ディスカッション

野生型 C. albicans の感染線量を変えることで、 S. mediterraneaで再現可能かつ線量依存的な罹患率の違いが生じ、真菌病原性の定量的評価に対するモデルの感度性が強調されています。本プロトコルは、実験室で管理されたプラナリアコロニーにおけるベースライン感染および致死量の設定戦略を示し、浸漬による全身感染の成功確認基準を提示します。これらは、CFU定量化および免疫染色を用いた宿主健康スコアと真菌負荷測定の統合です。

系統的な最適化を通じて、一貫した感染動態と再現可能な宿主アウトカムを達成するために不可欠ないくつかの実験パラメータが特定されました。接種物の濃度だけでなく、プラナリアの大きさ、個体密度、表面積と体積の比率などの要因も感染の進行や重症度に大きな影響を与えます。ここで導入された改良点、標準化された包含基準、管理された感染条件、詳細な評価項目スコアリングは再現性を大幅に向上させ、実験や実験室間での意味のある比較を可能にします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.7 mLマイクロ遠心分離機チューブおよびnbsp;	VWR/ジェネメイト	490004-436-BOXOF500	クリア、500ピース入りの箱
20 mL シンチロンバイアル	フィッシャー・サイエンティフィック	12-100-006	免疫染色用の透明ガラス瓶
24ウェル未処理ポリスチレン板	フィッシャー・サイエンティフィック	08-772-51	免疫染色
5.0 mLマイクロ遠心分離機チューブおよび	エッペンドルフ/シグマ・オルドリッチ	EP0030119487-200EA	クリア、200ピース入りの箱
6ウェル未処理ポリスチレン板	フィッシャー・サイエンティフィック	08-772-49	感染アッセイ
寒天	VWR	89405-066	YPD培地の細菌グレード
アプリケータースティック	サーモフィッシャー/ピューリタン	22-029-491	<>C. albicans培養
バイオレンダー	バイオレンダー社	該当なし	回路図の生成に使われる図形設計ソフトウェア
塩化カルシウム(CaCl2)	シグマ・オルドリッチ	C5080-500G	プラナリア水/モンジュイウム1回;C塩
< エム>カンジダ・アルビカンズ ポリクローナル抗体抗ウサギ IgG	サーモ・フィッシャー	PA1-27158	免疫染色
遠心分離機チューブ	VWR	89039-664	<>C. albicans収穫
培養チューブ ホウケイ酸ガラス 18x150mm	VWR	47729-583	<>C. albicans培養
キュベット	フィッシャー・サイエンティフィック	14-955-127	培養の光学密度を測定するために
デキストロース(D-グルコース)	フィッシャー・サイエンティフィック	D16-3	YPDメディア
グリセロール	フィッシャー・サイエンティフィック	G33-4	分子生物学のグレードで、C. albicans の低温保存のための補助剤として;<も>
グラフ作成およびデータ可視化ツール	グラフパッド/プリズム		統計ソフトウェアと視覚化ツール。Verison 10.6.1。
グラフ作成ツール	R		統計ソフトウェア。Verison 4.4.3。
インキュベーターシェーカー	エッペンドルフ	EPM1282-0004-1EA	ニューブランズウィック州イノーバ44/44R<種>C. albicans培養
塩化マグネシウム(MgCl2)	シグマ	M8266-100G	プラナリアの水に関しては、(1xモンジュウウムル;C塩)
硫酸マグネシウム(MgSO4)	シグマ・オルドリッチ	M7506-500G	プラナリアの水に関しては、(1xモンジュウウムル;C塩)
顕微鏡スライド	VWR	16004-368
マルチズーム顕微鏡	ニコン		ニコンAZ100
N-アセチル-L-システイン	シグマ・オルドリッチ	A7250-50G	粘液溶解剤および犠牲試薬;固定
パラマルデヒド、16%溶液、分子生物学グレード	電子顕微鏡科学	15710	固定試薬
ペレットペッスルコードレスモーター	フィッシャー・サイエンティフィック	12-141-361	プラナリア均質化
ペプトン、細菌学グレード	ヒメディア/VWR	89129-480	YPDメディア
乳棒	フィッシャー・サイエンティフィック	12-141-368	プラナリア均質化のためのRNaseフリー使い捨てペレット
ペトリ皿、100 x 15 mm	VWR	25384-342
ポリ(ビニールアルコール)	シグマ・オルドリッチ	P-8136	ゲルヴァトルのために
塩化カリウム(KCl)	シグマ・ライフサイエンス	P9541-500G	プラナリアンの媒介物/水 (1xモンジュウウムル;C塩)
二次抗体ヤギ抗ウサギ、IgG、Alexa フルオナ568	フィッシャー・サイエンティフィック	A-11011	免疫染色
SN250	真菌遺伝学ストックセンター		野生型C. albicans 菌株(https://www.fgsc.net/)
アジ化ナトリウム	フィッシャー・サイエンティフィック	S227-100	ゲルヴァトルのために
重炭酸ナトリウム(NaHCO3)	シグマ・オルドリッチ	S5761-1KG	プラナリアンの媒介物/水 (1xモンジュウウムル;C塩)
塩化ナトリウム(NaCl)	シグマ・ライフサイエンス	S3014-500G	プラナリアンの媒介物/水 (1xモンジュウウムル;C塩)
分光光度計	アジレント	26354	BioTek Epoch 2マイクロプレートによる光学密度測定
静的インキュベーター	フィッシャー・サイエンティフィック	15-015-2634	<>C. albicans culturing
転送ピペット	フィッシャー・サイエンティフィック	13-711-9CM	移送プラナリア用の滅菌使い捨てグラデアピペット
トリス・ベース	シグマ・オルドリッチ	252859	ゲルヴァトルのために
酵母抽出物	サーモ・フィッシャー	212750	YPDメディア