エイメリア寄生虫におけるランダムトランスジーン統合と発現の検証

サマリー

ここでは、トランスジェニックな Eimeria 寄生虫における異物遺伝子の統合と発現を検証するための標準化された方法を提示します。ゲノムおよびタンパク質レベルの解析を統合することで、このワークフローは安定した遺伝子挿入と発現を確認します。このアプローチにより、研究やワクチン応用のための遺伝子組み換え Eimeria の開発が促進されます。

要約

トランスジェニック・ エイメリア 寄生虫の検証は、安定したゲノム統合と外因性遺伝子の発現を確認するために不可欠です。このプロトコルは、 Eimeria tenellaにおけるトランスジーン挿入およびタンパク質発現の検証のための包括的なワークフローを記述しています。この手順は、胞子状卵嚢胞からゲノムDNA抽出から始まり、その後PCR増幅を行って標的断片の存在を予備的に確認します。ゲノム統合のさらなる確認のために、全ゲノム再配列解析を行い、挿入部位を特定し寄生虫ゲノム内で統合構造の安定性を評価します。その後、精製されたスポロゾイトから調製された溶解液のウェスタンブロッティングによってタンパク質発現が評価され、標的組換えタンパク質の検出が可能になります。さらに、感染した宿主細胞を用いた間接免疫蛍光アッセイ(IFA)によって細胞内局在化が可視化されます。これらのアッセイは、遺伝子転換系のエイ メリア 系統の検証のための堅牢かつ再現性の高い枠組みを提供します。このワークフローにより、ゲノム統合とタンパク質発現の信頼性の高い確認が可能となり、遺伝子操作、機能ゲノミクス、 Eimeria 寄生虫を標的としたワクチン開発への応用が支えられます。

概要

コクシディア症はEimeria属によって引き起こされ、家禽における最も経済的に重要な寄生虫病の一つであり、体重増加の減少、飼料転換の悪化、そして年間数十億ドルと推定される世界的な経済的損失を引き起こします(^1,2,3)。エイメリア寄生虫の遺伝子操作は、基礎研究とワクチン開発の両方において強力なツールとなっています ^4,5,6。安定したトランスフェクションにより、蛍光リポーターや保護抗原などの外因性遺伝子の統合と発現が可能となり、寄生虫発生のリアルタイム可視化やワクチン候補の標的評価が可能^{となります。}

Duanらによる以前の論文では、遺伝子組換え寄生虫系統の核分解および生体内での増殖に関する標準化されたプロトコルが 示され、組換え寄生虫系統の効率的な生成と濃縮方法が確立されました¹⁰。しかし、トランスジーンの安定したゲノム統合と機能発現を確認するための統一されたワークフローは現時点で存在しません。このような検証は、下流の生物学的研究やワクチン応用に用いられるトランスジェニック系統の真正性、安定性、再現性を確保するために極めて重要です。

本記事では、感染性滑液包ウイルス(IBDV)VP2抗原(Et-VP2)を発現するE. tenellaラインをモデル¹¹として用いて、Eimeria tenellaにおけるトランスジーン統合と発現を検証するための完全な段階的プロトコルを提示します。発現プラスミドp5′AMic2linkerVP2m3′Aは、VP2遺伝子とmCherryレポーターを含み、野生のE. tenella sporozoites(Et-WT)にトランスフェクトされました。赤色蛍光卵嚢胞は蛍光活性化細胞選別(FACS)によって単離され、コクシジアを含まない鶏に連続的に転換させました。このワークフローでは、ゲノムDNA抽出、PCRベースの予備統合解析、挿入部位同定のための全ゲノム再配列列、タンパク質発現を検証するウェスタンブロッティング、および組換えタンパク質の細胞内局在を可視化するための間接免疫蛍光アッセイ(IFA)の手順を示します。これらの手法は、遺伝子移行系のエイメリア系統の真正性を確認するための再現性かつ包括的な枠組みを提供し、機能ゲノミクス研究やワクチン開発における信頼性の高い利用を可能にします。

プロトコル

鶏を対象としたすべての動物実験は、中国農業大学の動物管理利用委員会(承認番号:CAU20160628-2)によって承認されました。すべての飼育および実験手順は、中国農業大学の施設動物ケア・利用委員会の指針に従い、動物を対象とした生物医学研究の国際指導原則に準拠しています。本研究では生後7日齢のオスの病原体フリー(SPF)ホワイトレグホーン鶏が使用されました。実験期間中、鶏は標準的な飼育環境で飼育され、飼料や水の自由なアクセスが可能でした。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. Eimeria spp.の胞子化卵嚢胞からゲノムDNAを抽出すること。

1. 卵嚢胞懸濁液1mL(≥1 ×^{10 7}/mL)を1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。卵嚢胞ペレットに対応する1mmのガラスビーズを同じ量に加えます。組織ホモジナイザーを使い、60Hzで激しくビーズを5分間叩き、卵嚢胞の壁を完全に破壊し内容物を放出するまで破壊します。
2. 混合物(ガラスビーズを除く)を新しいチューブに集め、遠心分離機で12,000 x g で1分間加熱します。上清液を廃棄し、500μLのCTABバッファーと40μLのプロテナーゼKを加え、60°Cで30分間培養します。
3. フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール500μL(25:24:1)を加え、10秒の渦を流し、12,000 x g で遠心分離機で5分間加熱します。上部の水相を新しいチューブに移す。
   注意:有機層を含むチューブは、環境汚染を防ぐためにしっかりとキャップをして廃棄してください。(任意)タンパク質汚染が依然として高い場合は、ステップ1.3を1〜2回繰り返します。
4. クロロホルム500μLを加えます:イソアミルアルコール(24:1)、10秒のボルテックス、12,000 x g で遠心分離機で5分間。水相を新しいチューブに移し、同じ量のイソプロパノールを加えます。DNA沈殿が現れるまで逆回転で混ぜます。
   注:−20°Cでの降水は≥1時間または夜間にわたり、収量を増加させます。
5. 12,000 x g で遠心分離機を10分間かけてDNAをペレット化します。ペレットを70%エタノールで洗浄し、12,000 x g で遠心分離機で5分間処理し、上清液は捨てます。残留液体は真空ポンプで慎重に除去し、ペレットを室温または37°Cで自然乾燥させます。
6. 乾燥したDNAペレットをRNase含有ddH₂OまたはTEバッファーに溶解します。残留RNAを除去するために37≥°Cで1時間、または4°Cで一晩培養します。精製されたDNAは−20°Cで保存します。
   注:長期保存のために、未溶解DNAペレットは−20°Cまたは−80°Cで直接保存できます。 アガロースゲル電気泳動によるDNAの完全性と濃度を評価すること。

2. 寄生虫ゲノムにおけるEt-VP2構成体の存在をPCRで検証

1. Et-VP2構成体のゲノム統合を検証するためのプライマーペア(表1)を設計します。
   注:プライマー配列はPrimer-BLASTを用いて設計され、典型的なパラメータはプライマー長18〜24 bp、融点は約55〜60°C、二次構造形成は最小限でした。各プライマーペアの特異性は、非特異的増幅を避けるため Eimeria tenella ゲノムと照合してさらに検証されました。
2. 2×Taqマスターミックス25 μL、21 μL ddH₂O、順方向プライマーと逆プライマーそれぞれ1 μL、DNAテンプレート2 μLを含む50 μLの反応混合物を準備します。
3. 以下の熱循環条件を用いて増幅を行います:95°Cでの初期変性を5分間行う;95°Cで30秒、55°Cで30秒、72°Cで1分間の30サイクル。その後、72°Cで10分間の延長が行われます。
   注意:熱循環前にすべての試薬を十分に混合していることを確認してください。最適な増幅効率を得るために、新たに調製したDNAテンプレートを使用してください。

3. トランスジェニック寄生虫系統(Et-VP2)の再配列決定

1. サンプル提出とライブラリ構築
   1. 次世代再配列解析のために、1 mLの卵嚢胞懸濁液(≥1 ×^{10 7}/mL)を市販のシーケンスサービス提供者に提出してください。
   2. ゲノムDNAの品質評価の後、超音波を用いた機械的破壊によりDNAを断片化します。断片化されたDNAを精製し、末端修復を行い、3′末端にアデニン(A)塩基を追加し、シーケンシングアダプターを結紮します。
   3. アガロースゲル電気泳動を用いて所望サイズのDNA断片を選定し、PCR増幅を行いシーケンシングライブラリを構築します。
   4. 構築図書館に品質検査を適用してください。Illumina NovaSeqプラットフォーム上で、リード長150 bpを用いてペアエンドシーケンスを行います。データの正確性を確保するためにシーケンス深度を100×に保ち、最低品質スコアはQ20>90%の最低品質スコアで少なくとも6GBの生データを生成してください。
      注意:すべての試薬およびDNAサンプルは、汚染を防ぐために無菌技術で取り扱ってください。データ解析に進む前に、シーケンスパラメータが必要な深さおよび品質指標を満たしているかを確認してください。
2. データ分析
   1. 以下の基準に従って、Fastpソフトウェア(v0.23.2)を用いて生のシーケンスデータをフィルタリング^します。
      1. アダプターのシーケンスを外してください。
      2. 低品質閾値をQ20に設定し、低品質ベースが総リード長の30%以上を占めるリードは削除します。
      3. 50 bp未満のリードは除去してください。
   2. Bowtie2ソフトウェア(v2.4.5)を用いて品質管理済みリードを E. tenella 参照ゲノム(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_905310635.1)にアライメントします¹³。次世代シーケンシングデータのランダム性は、カバレッジの深さと均一性に基づいて評価されます。
   3. シーケンシングリードがトランスジェニックベクター配列にアラインメントされていることを確認してください。T-DNA領域をマッピングしないリードを除去し、一方の端がT-DNAに、もう一方が E. tenella 参照ゲノムにマッピングされるキメラリードを得る。
   4. キメラリードの配列に基づき、ToxoDB(リリース64)を用いてアラインメントを行い、潜在的なT-DNA挿入部位の特定位置を特定します。Mosdepthソフトウェア(v0.3.3)を用いて、ベクターと Eimeria ゲノム間の相同領域(すなわち5′および3′調節領域)のシーケンス深度を解析します¹⁴。
   5. E. tenellaゲノム内のトランスジェニックプラスミドの潜在的な統合部位を特定し、ステップ2.1で説明した反応系を用いてPCRで検証します。
      注意:データの正確性と再現性を維持するために、解析全体を通じてソフトウェアのバージョンとパラメータ設定を一貫して使用すること。

4. エイ メリア 遺伝子転換タンパク質のウエスタンブロット

1. 少なくとも5個×10個の6個の胞子子を含むPBS懸濁液を1.5mL遠心分離機管に採取し、遠心分離機で2500 x gで5分間投与します。ペレットを100μLのRIPA溶解バッファーに再懸浮させ、氷上で1時間培養します。6×タンパク質ローディングバッファー20μLを加え、混合物を100°Cで10分間加熱します。
2. 1.5mmのガラス板を使ってSDS-PAGEゲルを準備します。標的タンパク質の分子量に応じてアクリルアミド濃度を調整します。重合中は、分離ゲルに蒸留水を重ねて均一な表面を確保し、積み重ねるゲルを加えます。
3. 溶解液を10,000 x g で遠心分離し、各サンプルレーンに40μLの上清液を注入します。タンパク質マーカー10μLを別のレーンに負荷し、残りのレーンには1×ローディングバッファー40μLをコントロールとして充填します。
4. 1×稼働中のバッファーで70Vで20分間電気泳動を行い、その後120Vで60〜90分間、着料前面がゲルの底に達するまで続けます。
5. 予想されるタンパク質の大きさに従ってゲルを切除します。メタノールでPVDF膜を1分間予め活性化し、次の順番で転送サンドイッチを組み立てます:スポンジ、フィルターペーパー、ゲル(カソード側)、PVDFメンブレン、フィルターペーパー、スポンジ。気泡を取り除き、70Vで3時間間タンパク質を移送バッファー内に移します。
6. 膜をPBSTで3回(各5分)洗い、5%無脂肪ミルクで室温で1時間、または4°Cで一晩ブロックします。 残留したブロッキング液を除去するために、膜をPBSTで2回洗ってください。
7. 抗体バッファーで希釈した一次抗体(マウスポリクローナル抗フラッグ(1:2000)およびマウスモノクローナル抗GAPDH(1:2000)で膜をインキュベートします。室温で1時間、または4°Cで一晩、優しく振って孵育させます。抗体溶液を採取し、膜をPBSTで5回(各5分)洗浄します。
8. 膜をHRP結合ヤギ抗マウスIgG(1:2000)で室温で1時間インキュベートします。膜をPBSTで5回(各5分)洗います。
9. 溶液AとBを等量混合してECL基板を準備します。基板を膜に均等に塗布し、化学発光イメージングシステムを用いてタンパク質信号を検出します。
   注意:特に指定がない限り、氷上でタンパク質サンプルを扱うすべての手順を行ってください。メタンオールとECL基質は、手袋と保護メガネを着用しながら、排気フード内で取り扱いましょう。

5. トランスジェニック・エイメリアの細胞内間接免疫蛍光アッセイ(IFA)

1. クロマトグラフィーカラムを用いた胞子子の精製
   1. クロマトグラフィーカラムを蠕動ポンプに接続し、流量を50〜60Hzに調整します。カラムを蒸留水とグリシン溶液で洗浄します。
   2. DE-52セルロース懸濁液をカラムに加え、グリシン溶液を連続的に添加し、セルロース層の高さが約1cmに達するまで続けます。
   3. パーコル法で精製された胞子子をカラムに載せる。グリシン溶液を用いて30〜40Hzの流量を維持し、50mLの遠心分離機管で流れを収集します。
   4. 顕微鏡観察のためにガラススライドに滴を置いて洗出液を監視します。スポロゾイトが検出されなかったらポンプを停止してください。収集した分画を2,500 x g で5分間遠心分離し、上清液を捨ててPBSで再懸濁します。
      注:すべての工程は無菌状態で行い、微生物汚染を防ぎましょう。グリシンおよびパーコール廃棄物は、機関のバイオセーフティ規制に従って処分してください。
2. HFF細胞の胞子虫感染
   1. HFF細胞単層を含む24ウェルプレートに10個×⁶ 個の胞子子をシードします。ペニシリン・ストレプトマイシンを最終濃度1×(ペニシリン100 U/mLおよびストレプトマイシン100 μg/mL)に加え、優しく混ぜて37°Cで4〜6時間培養し、浸潤を待つ。培地を取り出し、1mLのPBSで一度洗浄し、上清液を捨てます。
   2. 無菌鉗子を使ってガラスのカバースリップをウェルから慎重に取り出し、新しい24ウェルプレートに移します。サンプルを4%パラホルマルデヒド1mLに30分間固定し、1mLのPBSで1回洗浄し、上澄液を廃棄します。
   3. 細胞を0.25%トリトンX-1001 mLで30分間透過させます。1mLのPBSで一度洗い、上清液は捨てます。
   4. 3%BSAを1mLで30分間ブロックします。1mLのPBSで一度洗い、上清液は捨てます。
   5. 3%BSAに希釈したマウスモノクローナル抗フラグ抗体(1:200)。希釈した抗体の滴をシーリングフィルムに置き、カバースリップ(細胞面を下に)逆さにして滴を重ねます。カバースリップを37°Cの加湿室で1時間孵化させます。1mLのPBSで3回洗い(各5分)します。
   6. 3%BSAに希釈したFITC結合ヤギ抗マウスIgG(1:200)とHoechst 33258(1:100)。着色剤の滴をシールフィルムに置き、カバースリップをその滴の上に逆さにします。37°Cの加湿チャンバーで1時間培養し、その後1 mL PBSで5回(各5分)洗浄します。
   7. カバースリップは、ガラススライドに5μLのアンチフェードマウントメディウムを置いて取り付けます。カバースリップ(セル面が下)をドロップに逆さにして気泡を避け、端を密閉します。取り付けたスライドは画像検査まで4°Cの加湿チャンバーに保管します。
      注意:パラフォーマルデヒドとトリトンX-100は、手袋とアイプロテクションを着用したまま化学煙幕のフードで取り扱ってください。この手順で使用される試薬の配合は 表2に記載されています。

結果

ゲノムPCR解析により、トランスジェニック寄生虫に標的断片が存在することが確認されましたが、野生型対照群では対応するバンドは検出されませんでした(図1A)。全ゲノム再配列解析により、線形化されたプラスミドが寄生虫ゲノムに安定的に統合されていることが示され、結合領域を横断したPCR増幅によって予測された統合部位が検証されました(図1B)。

タンパク質発現はウェスタンブロッティングによって検証され、トランスジェニック株における融合タンパク質の期待分子量に対応する明確なバンドが明らかになりました。野生型制御では信号は観測されませんでした(図2)。

間接免疫蛍光アッセイは、トランスジーンを発現する胞子子体内の細胞内シグナルをさらに明らかにし、その発現と局在を確認した一方で、対照群は陰性のまま...

ディスカッション

本プロトコルは、トランスジェニックE . tenellaにおける外因性遺伝子のゲノム統合、タンパク質発現、細胞内局在の検証のための包括的なワークフローを確立します。単一のアッセイに依存するのではなく、ゲノムレベルとタンパク質レベルのエビデンスを組み合わせ、トランスジェンの挿入が構造的に確認され、機能的に発現されることを保証します。

このプロトコルのいくつかの重要なステップは、遺伝子組み換え系統の成功裏の検証に強く影響します。これらの手順が慎重に最適化されなければ、技術的な問題が発生する可能性があります。精製された寄生虫物質から抽出された高品質なゲノムDNAは、信頼性の高いPCR増幅およびその後のシーケンス解析に不可欠です。卵嚢胞の破壊が不十分であったり、宿主細胞物質に汚染された場合、DNAの質が低下し、DNA収率の低下やPCR増幅の不均一または弱さが生じます。これらの問題は均質化時間を延長したり、ビーズを叩く強度を高めることで軽減できます。統合部位の正確な同定には、十分なシーケンス深度と参照ゲノム...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗褪色マウンティングメディア	MCE	HYK1042	蛍光マウンティングメディア、光漂白防止
BSA（3％）	Beyotime	ST023	ブロッキングバッファーおよび抗体希釈バッファー（IFA）、室温で30分間ブロック
クロロホルム：イソアミルアルコール（24：1）	Sigma	C0549	ゲノムDNA抽出時の残留フェノール除去試薬
Coccidiaフリー鶏	Boehringer-Ingelheim	SPF	トランスジェニック株のin vivo移行と増幅に使用、倫理委員会承認（承認番号：CAU20160628-2）
CTAB（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）	Merck KGaA	H5882	ゲノムDNA抽出バッファーの構成成分、配合：3 g CTAB + 12.27 g NaCl + 15 mL 1 mol/L Tris-HCl + 6 mL 0.5 mol/L EDTA、ddH2Oで150 mLの最終体積に調整
DE-52セルロース	Solarbio	C8350	スポロゾイト精製のためのイオン交換クロマトグラフィーメディア、NaOH、HCl、蒸留水で順番に処理し、グリシン溶液で平衡化
ECL基質（溶液A + 溶液B）	thermofisher	32106	ケミルミネッセンス検出試薬、使用前に溶液AとBを等量混合
FITC共役ヤギ抗マウスIgG	Sigma	AP124F	IFA用蛍光二次抗体、希釈比1：200
ガラスビーズ	Sigma	Z250473-1PAK
グリシン溶液	Sigma	67419	クロマトグラフィーカラム用の平衡および溶出バッファー、配合：0.75 gグリシン + 7.9 g NaClを500 mL蒸留水に溶解、pHを7.4-7.6に調整し、オートクレーブ処理
ホエヒスト33258	Sigma	94403	核染色試薬、希釈比1：100、IFA局在化に使用
HRP共役ヤギ抗マウスIgG	Sigma	12-349	ウェスタンブロッティング用二次抗体、希釈比1：2000
Illumina NovaSeqシーケンシングプラットフォーム	Personalbio Biotechnology Co., Ltd.（中国上海）		次世代シーケンシングプラットフォーム、ペアードエンドシーケンシング（150 bpリード長）、シーケンシング深度100×、生データ≥6 GB（Q20>90％）を生成
低速遠心機	BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE	DT5-2
マウスモノクローナル抗Flag抗体	Sigma	F1804	一次抗体、希釈比1：200、Flagタグ付き融合タンパク質のIFA検出に使用
マウスモノクローナル抗GAPDH抗体	Sigma	G8795	一次抗体、希釈比1：2000、ウェスタンブロッティングのローディングコントロールとして使用
脱脂乳（5％）	Beyotime	P0216	ウェスタンブロッティング用ブロッキングバッファー、室温で1時間または4℃で一晩ブロック
パラホルムアルデヒド（4％）	Merck KGaA	30525	細胞固定溶液、室温で30分間固定
PBS	Solarbio	P1010
ペニシリン-ストレプトマイシン（100×）	Yeasen	60162ES76	細胞培養用抗生物質、微生物汚染を抑制
Percoll（DG勾配ストック）	GE Healthcare	17-0891-09
フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）	Merck KGaA	77617	ゲノムDNA抽出時のタンパク質除去用試薬
タンパク質ローディングバッファー（6×）	Beyotime	P0015F	タンパク質電気泳動ローディングバッファー、配合：100 mM Tris（pH 6.8）、4％SDS、2 mM EDTA、2％グリセロール、6 M尿素、使用前に50 μL 2 M DTTと50 μL 5％ブロモフェノールブルーと混合
プロテイナーゼK	Merck KGaA	39450-01-6	ddH2O 10 mLに200 mg溶解、ゲノムDNA抽出時のタンパク質消化に使用
PVDF膜	thermofisher	88518	タンパク質転写膜、使用前にメタノールで1分間活性化
RIPA溶解バッファー	Yeasen	20101	スポロゾイトタンパク質抽出用溶解バッファー
RNase A	Merck KGaA	9001-99-4	0.01 mol/L NaAcに25 mg溶解、100℃で10-15分間加熱、1 mol/L Tris-HClでpHを7.4に調整、DNAサンプルからのRNA除去に使用
SDS-PAGEゲル試薬（アクリルアミド、ビスアクリルアミド、Tris、SDS、APS、TEMED）	Bio	101	SDS-PAGEゲル調製用試薬、標的タンパク質の分子量に応じてアクリルアミド濃度を調整
ナトリウムタウロデオキシコール酸水和物	Sigma	T0875
solution）
Taqマスターミック（2×）	Vazyme	P112-01/02/03	タクポリメラーゼ、dNTPなどを含むPCR増幅プレミック
トリトンX-100（0.25％）	Merck KGaA	9036	細胞透過溶液、室温で30分間インキュベート
トリプシン	Solarbio	T8150
ボルテックスミキサー	Beijing North TZ-Biotech	HQ-60-II
水浴恒温器	Grant Instruments（ケンブリッジ）	GD120,GM0815010