薬用植物におけるトロパンアルカロイドの定量のための効率的かつ迅速なHPLC-QQQ-MS法

サマリー

本研究では、高性能液体クロマトグラフィーと三重四重極質量分析法(HPLC-QQ-MS)法を組み合わせたものを開発し、 Anisodus tanguticus中のトロパンアルカロイド(ヒヨスチアミン、アニソダミン、スコポラミン)を同定・定量しました。この方法は薬用植物の高スループット分析において迅速かつ正確かつ信頼性が高いことが証明されました。

要約

Anisodus tanguticus はチベットの重要な薬用植物です。ヒヨスチアミン、アニソダミン、スコポラミンなどのトロパンアルカロイド(TA)は、鎮痛作用や鎮静作用の薬理学的活性を示し、これらの生物活性化合物を抽出するための貴重な自然供給源となっています。しかし、 A. tanguticus の化学組成は非常に複雑です。構造が解明されていない多くの化合物を含み、その有効成分の体系的な同定と構造的特徴付けが特に重要です。高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)はこの植物からの抽出物の分離に広く用いられていますが、スペクトルデータベースの照合を行っても多くの未知成分の正確な同定は依然として困難です。

本研究では、高性能液体クロマトグラフィーと三重四重極質量分析法(HPLC-QQ-MS)を用いた分析手法を確立し、 A. tanguticusにおけるトロパンアルカロイドの測定を図りました。この手法は、標準化された試料準備、質量分析パラメータの設定、LCの前平衡化、手法確立、MSデータの取得、多段階質量分析(MSⁿ)スキャン、手動データ解釈など、一連の体系的な手順を含みます。この戦略を用いて、 A. tanguticusにおける代表的なトロパンアルカロイドの3つ、ヒヨスチアミン、アニソダミン、スコポラミンの同定に成功しました。さらに、確立されたHPLC-QQQ-MS法の精度を検証し、A . tanguticus におけるトロパンアルカロイド(TA)の定量的決定において迅速かつ感度が高く、実現可能かつ正確であることを確認しました。確立されたアプローチは優れた汎用性と信頼性を示し、 A. tanguticus やその他の薬用植物におけるトロパンアルカロイドの高スループット同定および定量に適しています。

概要

伝統中国医学(TCM)の治療効果は主にアルカロイド、フラボノイド、テルペノイドなどの二次代謝物およびその他の有効成分に依存し^ます。したがって、これら複雑な混合物中の特定的ターゲット代謝物の正確かつ感度の高い質的・定量的分析は、TCMの品質を確保し、その有効性の物質的基盤を明らかにし、^{現代研究を}前進させるための重要なステップです。しかし、TCM成分の多様性と複雑さ、そして多くの主要有効成分の極めて低い濃度が相まって、効率的かつ正確な検出を達成する上で大きな課題となっています。

Anisodus tanguticus(マキシム)パッシャーはトロパンアルカロイド^(TAs)の主要な植物源であり、薬理活性のあるトロパン型化合物の豊富な含有で知られています⁵。主要な特徴アルカロイドにはアニソダミン、スコポラミン、ヒヨスチアミンが含まれ、これらは共通のトロパンコアを共有しながらも異なる官能基置換を示し(図1)、薬理学的プロファイル^6,7,8に分岐しています。構造的な類似性がクロマトグラフィーの解像度を複雑にしますが、植物化学的および代謝学の比較研究においても貴重なモデルを提供します。最近の研究では、メタボロミクスおよびネットワーク薬理学的アプローチを用いて、A. tanguticusの化学組成および地理的変異が調査^{されています。}現在のA. tanguticus代謝物の分析手法は主に高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)¹¹に依存しています。それにもかかわらず、苗生段階のトロパンアルカロイド濃度は0.01%(1万分の1)まで低く、従来のHPLC法は解像度、感度、分析スループットの制限により制約されることが多いです。これらの制限は構造的に類似したアルカロイドホモログの完全な分離を妨げ、微量成分の検出を妨げ、解析精度を損なうとともに、より高度な研究応用への支援を制限しています。近年、HPLCの進歩とタンデム質量分析法の相まって、これらの分析ボトルネックを解決するための強力なツールが提供されています。特に高性能液体クロマトグラフィー三重四重極質量分析法(HPLC-QQQ-MS)は、著しく向上したクロマトグラフィー分解能、分離効率、そして卓越した感度を提供します 12,13,14。この技術はTCMにおける二次代謝物の調査における最先端プラットフォームとして登場し、複雑な生物学的マトリック^ス11,15,16,17における微量ターゲット分析物の効率的かつ正確な定量化を可能にします。そのため、A. tanguticusのような薬用植物の包括的な化学的プロファイリングと品質評価のための強固な技術的基盤を提供しています。本研究では、A. tanguticusにおけるトロパンアルカロイド検出の継続的な課題に取り組み、微量成分の正確な同定と定量に重点を置きます。クロマトグラフィーおよび質量分析条件を体系的に最適化することで、複数の主要トロパンアルカロイドを同時に決定するための新しいHPLC-QQQ-MS法を開発し検証しました。最適化されたアプローチにより、感度、選択性、方法論的堅牢性が大幅に向上し、微量アルカロイド化合物の解析時にしばしば直面する感度の低さ、マトリックス効果、共洗脱干渉など、従来の質量分析アッセイで共通する制約を克服します。

プロトコル

1. サンプルの調製

1. 標準溶液の調製
   1. ヒヨスチアミン、アニソダミン臭化水素化物、スコポラミン臭化水素化物の基準基準物質を10.0 mgの分析バランスで正確に計量し、それぞれ10 mLの容量フラスコに分けます。
   2. マークラインにクロマトグラフィーグレードのメタノールを加え、超音波処理で標準液を十分に溶解させ、濃度1.0 mg/mLの単一標準ストック溶液を準備します。
   3. ストック溶液を茶色い試薬瓶に移し、暗闇で4°Cで保存します。
      注意:使用されているアルカロイドは非常に有毒です。標準サンプルを取り扱う際は安全対策を講じてください。すべての溶液は分析前に新鮮に準備され、劣化を防ぐために4°Cの暗闇で保存されました。
2. 混合作業液の調製
   1. 前述の各ストック溶液を100 μLのピペットで10 mLの体積フラスコに抽出し、クロマトグラフィーグレードのメタノールで印の線まで希釈して、10 μg/mLの混合標準中間液を準備します。
   2. 線形範囲要件に従い、中間溶液をメタノールで段階的に希釈し、混合作業溶液の連続を得ます。
   3. それぞれ50μL、200μL、500μLを取ってください。0.5 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mLの濃度を得ます。使用前に新鮮な準備をしてください。
   4. 10 μg/mL中間液100 μLを1 mLの体積フラスコに移し、1 μg/mLの希釈溶液を準備します。
   5. 次に、1 μg/mL溶液100 μLを別の1 mLの体積フラスコに移し、メタノールでその体積まで希釈します。
3. サンプル前処理
   1. Sophora flavescensの新鮮な材料を凍結乾燥し、その後高速粉砕機で均質な粉末に粉砕します。
   2. 粉末を0.25mmの標準的なテストソウでふるいにかけます。この粉末20mgを正確に計り、100mLの容積フラスコに移し、ほぼ標示された線にクロマトグラフィーグレードのメタノールを加えます。
   3. 室温で30分間超音波抽出を行います。抽出後、体積フラスコを取り出し、室温で25°Cまで冷却し、クロマトグラフィーグレードのメタノールを100mLのマークラインまで補充し、2分間渦を混ぜます。
   4. 上記の抽出物1 mLを100 mLの体積フラスコにピペットし、メタノールで印の線まで希釈(100倍希釈)します。振動井戸の後、HPLC注入の母溶液として機能します(図2)。
      注意:高速研削機を操作する際は、保護ゴーグルと防塵マスクの着用が不可欠です。過熱を防ぐために、挽く量と時間をコントロールしましょう。
4. 試料ろ過と貯蔵
   1. 1 mLの使い捨て針なし注射器(クロマトグラフィー専用で非吸着性)と0.22 μmの有機相微細多孔膜を準備します。
   2. 母液1.2mLを吸引して注射し、ゆっくりと押し込んでろ過します。
   3. その後のろ過液を内側のインサート付きの2 mLサンプルバイアルに集め、キャップでしっかりと密封します。
      注:超音波洗浄機の周波数は40kHzに固定されています。抽出時に溶媒の揮発を防ぐために、ボリュームフラスコキャップを緩めないようにしてください。実験前で試料のピーク応答に応じて希釈係数を調整し、目標ピーク面積が標準曲線の線形範囲内に収まるようにします。すべてのサンプルは直ちに4°Cの冷蔵庫で保管しなければなりません。

2. HPLCの事前実行、方法の確立、MS取得

1. 移動相の調製
   1. 移動相Aを準備します:超純水1000 mLを計測し、クロマトグラフィーグレードの蟻酸(体積分数:0.1% v/v)を1.0mL加え、磁気攪拌器で10分間均一に混ぜます。
   2. モバイル相Bの準備:追加処理なしで直接クロマトグラフィーグレードのメタノールを使用します。
   3. 移動相AとBをそれぞれ超音波脱気装置に注ぎ込み、40kHzで15分間超音波脱気を行います。
   4. 脱気後、脱気された移動相を溶媒ボトルに移し、密封してHPLCシステムの対応するAおよびB溶媒ラインに接続します。
      注意:すべての溶媒はクロマトグラフィーグレードであり、使用前に0.45μmの有機相微多孔膜を通過する必要があります。システムの圧力を定期的に監視してください。圧力変動が±±5%を超える場合は、管内のカラム詰まりや気泡の可能性があるか確認してください。
2. HPLC条件の設定
   1. クロマトグラフィー分離にはC₁₈カラム(2.1 mm × 100 mm、2.7 μm)を使用します。使用前に30分間、メタノール:水=80:20(v/v)でカラムを平衡させ、平衡時の流量は0.3 mL/分で保ちます。コラムオーブンの温度を30°Cに設定し、10分前から予熱を始めます。
   2. 勾配洗脱プログラムを以下のように最適化します:0–10.0分、5%から10%B;10.0〜15.0分、10%から35%のB;15.0〜20.0分、35%から60%のB;20.0–25.0分、60%から95%B。流量を0.60 mL/min、注入体積を2 μL、検出波長を210 nmに設定します。
3. 質量分析条件
   1. 正イオン化モード(ESI+)で動作する電気噴霧イオン化(ESI)源を備えた三重四重極(QQQ)質量分析計を用いて質量分析(MS)検出を行います。
   2. 動作パラメータは以下の通りに設定されます:ネブライザー圧力:15 psi;毛細管電圧:4000 V;気温:300°C;ガス流量:11 L/min。
   3. 各分析対象物のMS/MSパラメータを体系的に最適化します。
      1. まず、 MS2 SCAN モードで個々の標準溶液を直接注入して前駆体イオンを特定します。
      2. MS2 SIMモードを用いて、各前駆体イオンのフラグメンタ電圧を最大信号強度に最適化します。
      3. 次に、 プロダクトイオンスキャン モードを用いて特徴的な生成イオンを特定します。前駆体イオンの衝突エネルギー(CE)を体系的に最適化し、生成物イオン信号強度を最大化します。
      4. 定量化には最も強い生成イオンを選び、定性的確認には2番目に強いイオンを用います。
         注意:MS2 SCANモードで個々の標準溶液を直接注入して前駆体イオンを同定します。信号飽和を防ぐために標準溶液濃度が適切であることを確認してください。パラメータドリフトを避けるために定期的に機器を校正してください。
4. メソッド検証
   1. 特異性
      1. 空blank溶媒(メタノール)、混合標準作業液、サンプル抽出物を別々に注入し、クロマトグラムを比較します。
      2. 以下の要件を満たすこと:空溶媒に干渉するピークがないこと;サンプル中のターゲット成分の保持時間は標準と一致しています(偏差≤ ±±0.1分);量化子イオンと限定子イオンのピーク面積比は標準的なものに準拠します(偏差≤ ±±10%)。
   2. 線形性
      1. ステップ1.1で調製された混合作業液(0.1、0.5、2、5、10 μg/mL)を、前述のHPLC-MS条件下で、1濃度ごとに3回ずつ注入して連続注入します。
      2. 標準曲線をプロットし、各成分の濃度(x, μg/mL)を横軸、量化子イオンの平均ピーク面積(y)を座標としてプロットします。相関係数(R²)≥0.995を必要とする線形回帰解析を行います。
   3. 精度と正確さ
      1. 日中の精度(再現性):1日以内に品質管理(QC)サンプルを3つの濃度レベル(2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL)で6回分析し、相対標準偏差(RSD%)を算出します。
      2. 日間精度(中間精度):同じ乾燥植物原料のロットから独立してQCサンプルを抽出し、異なるオペレーターによって3日連続で分析されます。RSD%を計算します。RSD%≤両方とも10%にしてください。
      3. スパイクリカバリーテストを用いて精度を評価し、リカバリー率(%)で表します。低・中・高濃度の平均回復率を85%から115%の範囲にし、RSD%≤5%にしてください。
         注:線形範囲は、実際のサンプル(低・中・高レベルを含む)におけるターゲット成分の予想濃度範囲をカバーし、実用的な適用性を反映する必要があります。すべての検証実験は三重に行われ、結果は平均値として表されました。

3. データ取得

1. 多重反応モニタリング(MRM)モードでのデータ取得を行います。各分析物の最適化されたMRMパラメータ(前駆体イオン、生成イオン遷移、フラグメンタ電圧、衝突エネルギー(CE)など)については表 1 を参照してください。
2. 各遷移ごとに各クロマトグラフィーピークに十分なデータポイント数を確保しつつ、適切なサイクルタイムを維持するために滞留時間を計算します。

4. データ分析

1. 定性的分析ソフトウェアを起動し、「 ファイル > データをインポート」をクリックし、 収集したすべてのデータファイル(.d形式)をインポートします。
2. 抽出イオンクロマトグラム(EIC)の抽出: 定量 モジュールで MRM遷移を選択し、各成分の前駆体イオン生成イオンペアを入力し、対応するEICを抽出します。
3. ピーク検証と統合:各EICのターゲットピークのピーク対称性と保持時間の一貫性(標準と比較して0.1分の偏差≤ ±±0.1分)を確認してください。
4. ソフトウェアはデフォルトで自動統合を行います。ベースラインドリフトや干渉ピークが存在する場合は、積分パラメータ(積分の開始点と終了点)を手動で調整し、正確な積分を確保してください。
5. 未知の試料における各成分の濃度を標準曲線を用いて計算します。レポート>レポート生成をクリックし、Excelフォーマットを選択してレポートをエクスポートしてください。報告書には化合物名、保持期間、ピーク面積、濃度、RSD%などが含まれています。

結果

HPLC-QQQ-MS クロマトグラフィー分離およびTAの同定
標準混合物とA.tanguticus根抽出物の分析から得られる典型的なMRMクロマトグラムは図3および図4に示されています。最適化されたHPLC条件下では、ヒヨスチアミン、アニソダミン、スコポラミンの3つの標的トロパンアルカロイドすべてが20分以内に成功して分離され、開発された方法の高い効率が実証されました。スコポラミンとアニソダミン間の分解能(Rs)は8.67、アニソダミンとヒヨスチアミン間の分解能は11.58でした。すべての解像度値は基準分離基準の1.5を大幅に上回り、クロマトグラフィー干渉がないことを示し、正確な定量解析に適していることを裏付けました。すべての化合物は鋭く対称的なピーク形状を示し、マトリックス干渉を最小限に抑えつつ優れたクロマトグラフィー性能を示しました。各TAの同定は、(1)本物の標準と一致する保持時間(±±...

ディスカッション

植物の二次代謝物への関心が高まる中、アルカロイド検出の分析技術が注目を集めています。トロパンアルカロイド(TA)を分析するための基礎的なクロマトグラフィーシステム^{が確立されています}が、毛細管電気泳動(CE)の採用、GC–MSおよびHPLC–MSにおける計測性能の向上、コンボルビンおよびトロピノン様毒素を含む新規構造化合物の同定などの最近の進展は、これらのアルカロイドに関する現在のクロマトグラフィー手法の体系的レビューの必要性を強調しています^{11。19、20、21、22}。TAの分析要件は文脈によって異なります。植物組織解析(例:植物育種、アルカロイド生合成、抽出研究)では、構造的に類似した二次代謝物を識...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Agilent MassHunter software	Agilent Technologies
Agilent ZORBAX SB-C18 column	Agilent Technologies	880975-902	C18 reversed-phase column, 4.6 × 250 mm, 5 μm
アニソダミン ヒドロブロミド	成都グリップバイオテクノロジー株式会社	101-31-5	HPLC>98%
酢酸	シグマ・アルドリッチ	5.33002
凍結乾燥機	EYELA、東京、日本	FDU-2110
高速万能グラインダー	太石機器有限公司、中国天津市	6010210100	FW-100、24,000 rpm、100 g容量、80メッシュ
ヒオシアミン	成都グリップバイオテクノロジー株式会社	55449-49-5	HPLC>98%
メタノール	Thermo Fisher Scientific	022909.K2
マイクロポラス膜0.22μm	ミリポア	SLGV033RB
Milli-Q Direct 8水システム	ミリポアシグマ、バーリントン、MA、米国	ZRQSVP0JP
スコポラミン ヒドロブロミド	成都グリップバイオテクノロジー株式会社	114-49-8	HPLC>98%