このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

薬物治療後の肝細胞癌オルガノイドの生成および単細胞トランスクリプトミック解析

495 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/70511

⸱

2026年5月26日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルは、肝細胞がんオルガノイドの生成、薬物治療の適用、治療前後の単細胞RNAシーケンスの簡潔化方法を概説し、治療関連の転写変化を特徴付けます。

要約

肝細胞癌は世界中のがん関連死亡率の主要な原因であり、著しい腫瘍内異質性が特徴で、治療反応の変動、腫瘍再発、疾患進行に寄与しています。したがって、薬物治療の前後に腫瘍細胞が転写レベルでどのように変化するかをより深く理解することは、治療戦略の改善に不可欠です。しかし、オルガノイドベースの薬物治療と下流の単一細胞トランスクリプトムプロファイリングを結びつける実践的な実験ワークフローは限られています。本研究では、肝細胞がんオルガノイドの生成、定義された薬物治療の適用、治療前後に採取されたサンプルに対する単細胞RNAシーケンスの標準化されたワークフローを開発しました。プロトコルにはオルガノイドの再生と増殖、治療前の品質評価、薬物曝露、単細胞解離のためのオルガノイド調製、ライブラリー構築、および単細胞トランスクリプトミクスデータの基本的な比較解析が含まれます。再現性とサンプルの品質を向上させるために重要な技術的注意が講じられています。このワークフローにより、肝細胞がんオルガノイドにおける薬物治療に関連する細胞組成および転写変化の並列解析が可能になります。このプロトコルは堅牢でスケーラブル、異なるオルガノイド系に適応可能であり、単一細胞分解能で処理に関連する遺伝子発現変化を調査するための実用的なプラットフォームを提供します。

概要

肝細胞癌(HCC)は成人における最も一般的な原発性肝臓がんであり、世界的にがん関連死亡の主な原因です。1,2,3。臨床的結果が悪いのは、腫瘍内の顕著な異質性によるもので、治療抵抗性や再発率が原因です。最近の研究では、FOXM1/CEBBB軸などの主要な転写プログラムによって駆動される発生的多様性と細胞状態の可塑性がHCC5の治療抵抗性に寄与していることが示されています。これらの発見は、持続的な治療圧力下で腫瘍細胞集団がどのように適応し、状態間を遷移するかを理解する必要性を強調しています。しかし、ほとんどの前臨床モデルはこれらの治療関連状態遷移の動的かつ連続的な性質を十分に捉えておらず、腫瘍適応や治療失敗の機構的調査を制限しています。

患者由来オルガノイド(PDO)は、元の腫瘍の重要なゲノム変異や細胞の異質性を保持するため、この目的に有用なプラットフォームを提供します。HCCオルガノイドは、主要な組織特徴を保持しつつ長期培養で維持できるため、治療反応研究に特に適しています。さらに、オルガノイドを用いた研究では、肝がんオルガノイドを用いた薬物検査や患者間・腫瘍内治療感受性の違いの捕捉の実現可能性が示されており、治療反応研究の前臨床モデルとしての価値を支持しています8,9。しかし、多くのオルガノイド系薬物研究は依然として主にエンドポイントの生存可能性測定に依拠するか、主にバルク表現型応答に焦点を当てているため、異質な細胞応答や治療関連の転写変化に関する情報は限定的です。同時に、HCCに対するRNAベースの治療戦略の急速な開発は、単一細胞解像度10で治療反応を正確に予測し、メカニズム的に解析できる前臨床システムの必要性をさらに強調しています。

単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)は、オルガノイドモデル11における細胞組成および転写状態の高解像度特性解析を可能にします。処理前後に収集されたオルガノイドに適用すると、scRNA-seqは遺伝子発現の変化、細胞集団の変動、そしてバルクアッセイでは捉えられない異質な応答を明らかにできます。このアプローチは、HCCオルガノイドにおける治療関連転写再構築を調査するための実用的かつ強力な戦略を示しています。しかし、HCCオルガノイド培養、薬物処理、治療前後の単一細胞RNAシーケンスを統合した実用的かつ再現性の高いワークフローは依然として不足しています。このようなワークフローは、薬物曝露時にオルガノイドの完全性が保たれ、下流の単一細胞プロファイリングのために十分な生存細胞が回収される場合に最も効果的です。他のオルガノイドベースのアプローチと同様に、重要な制約には、腫瘍微小環境のストロマル、血管、免疫成分の不完全な表現や、長期の in vitro培養における選択バイアスの可能性があります。

HCCオルガノイドの生成、定義された薬物処理の適用、治療前後の単細胞RNAシーケンスのためのオルガノイドサンプル処理のための統合実験ワークフローが記述されています。このワークフローには、オルガノイドの復活と増殖、治療前の品質評価、薬物曝露の管理、そしてマッチしたサンプルの下流単一細胞RNAシーケンスが含まれます。このアプローチは、HCCオルガノイドにおける細胞組成および遺伝子発現プログラムの処理関連変化を単細胞分解で比較するための実用的な枠組みを提供します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

ヒト組織を用いた研究は、広州医科大学の研究倫理審査委員会(承認番号)によって審査・承認されました。GYZL-2024-KY31)。ヒト標本を対象としたすべての手技は、人間研究に関する機関のガイドラインに従って実施されました。臨床標本を医学研究で使用するために、すべての患者から書面によるインフォームドコンセントが取得されました。使用される試薬および機器は 材料表に記載されています。

このワークフローには、低温保存された肝細胞がんオルガノイドの回収と増殖が含まれ、下流の治療的撹乱や単細胞RNAシーケンスのための軽微な適応も含まれます。目的は、後の薬物治療実験のために十分な品質と一貫性を持つオルガノイド培養を生成することです。12。

1. HCC患者由来オルガノイドの確立と増殖

  1. 凍結保存オルガノイドの解凍と回収
    1. 解凍前の準備
      1. 水浴を37°Cまで予温めてください。 24ウェルのプレートを37°Cのインキュベーターで少なくとも1時間、プレ平衡させてからメッキを行います。
      2. 事前に完全なオルガノイド培養培地を準備し、使用までベースメント膜エキス(BME)を氷に保管してください。完全なオルガノイド培養培地の組成は 補足表1に示されています。
    2. オルガノイドの解凍
      1. 凍結されたHCCオルガノイドを含むクライオビアを液体窒素貯蔵から取り出し、直ちに37°Cの水浴に入れます。
      2. 小瓶を優しくかき混ぜて、小さな氷の結晶だけが残ったら解凍を止めます。
    3. クライオプロテクタントの除去
      1. 解凍した懸濁液を優しくピペットで一度だけ使い、中身を再び懸濁させます。
      2. 懸濁液を15 mLの円錐形チューブに移し、その中に3〜5 mLの完全オルガノイド培養培地を含みます。
      3. 遠心分離機で300 × g、4°Cで5分間加熱します。 ペレットを乱さずに慎重に吸引し、上澄液を捨てます。
  2. オルガノイドの埋め込みと再メッキ
    1. リカバリー混合物の調製
      1. オルガノイドペレットを完全なオルガノイド培養培地に再懸濁させます。完全なオルガノイド培養培地の組成は 補足表1に示されています。
      2. 氷のように冷たいBMEと同じ量と優しく混ぜて、盛り付けの混合物を作ります。
        注意:早期重合を防ぐために混合物は氷上に保管してください。
    2. オルガノイドドームのメッキ
      1. 予備加熱された24ウェルプレートの各ウェルに50μLのオルガノイド-マトリックス混合物を投与します。
      2. マトリックス固化を許可するために37°Cで30分間培養します。
      3. 井戸壁に沿って各井戸に、20μMのY-27632を補足した完全なオルガノイド培地500μLを加えます。
        注意:Y-27632の使用は解凍または通過後の最初の2〜3日以内に制限してください。各ドームがコンパクトで井戸の底に固定され、外側に広がらないようにしてください。
  3. オルガノイド培養と拡大
    1. 回復培養条件
      1. オルガノイドは37°C、CO2濃度5%で維持します。
      2. 解凍後最初の2〜3日間は20μM Y-27632を含む培地を使用してください。
    2. 中型交換
      1. 培養培地は3〜4日ごとに優しい吸引で交換してください。
      2. マトリックスドームを乱さないように、各井戸の壁に沿って新しい媒体を加えます。
      3. 同じ実験内のすべての井戸で同じ培地交換スケジュールを維持してください。
    3. 成長モニタリング
      1. 明視野顕微鏡を用いて、一定の画像設定でオルガノイドの回復と拡大を監視します。
      2. 回復および拡大の定められた時点で代表的な画像を記録します。
      3. ほとんどの構造が無傷で、オルガノイドが円形から楕円形の形態を持ち、滑らかな縁取りを持ち、時間とともに徐々に拡大し、破片や崩壊構造が最小限に見られる場合に、回復が成功したことを確認します。
      4. 10個未満の完全なオルガノイドを含む井戸は下流の定量解析から除外します。
    4. 通過と拡大の基準
      1. 安定した膨張後の通過オルガノイドが観察されます。
      2. 形態が保存されたオルガノイドサイズまたは総面積の再現可能増加によって安定した拡大を確認すること。
      3. 実験ごとに一貫した画像間隔、拡大率、包含基準を用いてください。
      4. オルガノイド面積や個数に基づいて代表的な成長曲線を作成し、安定性を確認します。
    5. 下流実験の基準
      1. 安定した三次元成長を示し、汚染や広範な崩壊が見られず、並行実験条件で十分な収量を持つオルガノイド線を用いてください。
      2. 解凍後、または回復終了と1回の増殖サイクルが終わるまで、培養を少なくとも7〜10日間維持してください。
      3. 複製井戸間で一貫した形態を示すオルガノイド線のみを前進させる。

2. 治療的摂動のためのオルガノイドの調製

  1. 治療前品質評価
    1. 形態学に基づく評価
      1. オルガノイドが形態的に丸いか楕円形であることを確認しましょう。
      2. オルガノイドが滑らかで明確な境界を示すことを確認する。
      3. ドーム内の細胞残骸が最小限であることを確認してください。
      4. 広範な断片化、暗いルーメン、広範な崩壊、または明らかな汚染がある培養物は除外してください。
    2. 膨張状態評価
      1. 回復を完了し安定した増殖に入ったオルガノイド培養のみを使用してください。
      2. 時間とともに進行性の拡大を確認しましょう。
      3. 複製井戸間で一貫した形態を確認しましょう。
  2. 薬物治療のためのオルガノイド再プレート
    1. マトリックスからのオルガノイドの回復
      1. オルガノイドドームを氷上に溶かし、1井戸あたり1mLの氷冷セル回収液を15〜20分間溶かします。
      2. 培養中は5分ごとに優しくピペットを動かします。
      3. 遠心分離機で300×gの懸濁液を4°Cで5分間回収しました。
      4. ペレットを完全なオルガノイド培養培地に再懸浮させます。
    2. 再メッキ前の標準化
      1. 薬物治療前に井戸間の初期オルガノイド負荷を標準化すること。
      2. 可能であれば部分解離後に生存可能な細胞数を決定します。
      3. サンプルを井戸あたりの入力セル数に正規化します。
      4. 24ウェル形式で、1ウェルあたり約1,000〜5,000個の有効セルをメッキします。
      5. 直接的な細胞計数が行われない場合は、井戸あたり形態的に完全なオルガノイドの数が同等で、グループ間でサイズ分布が似ていることを保証して正規化します。
      6. 処理前に初期オルガノイド数と基線形態を各井戸で記録します。
      7. 同一実験内のすべてのウェルで同一の包含基準とプレート戦略を用いてください。
    3. 薬物治療のための再塗装
      1. 回収したオルガノイドと氷のように冷たい基底膜マトリックスを最終濃度30%〜50%で混合します。
      2. 24ウェルプレートの各ウェルに50μLドームを供給します。
      3. 重合を促すために37°Cで30分間培養します。
      4. 井戸の壁に沿って1井戸あたり500μLの完全なオルガノイド培養液を加えます。
        注意:各ドームはコンパクトで井戸の底に固定され、外側に広がらないようにしてください。同じ実験内のすべての井戸で同じドーム体積とマトリックス濃度を用いてください。
  3. 薬物治療前の回復
    1. 再メッキ後の回復
      1. 標準的な培養条件下でオルガノイドを一晩回復させます。
      2. 再プレートされたドーム内で形態が完全に回復した後にのみ処理を開始します。
    2. 薬物治療の入学基準
      1. 再プレート後もオルガノイドが無傷で、広範な崩壊や過剰な破片が存在せず、オルガノイド負荷がウェルごとに比較可能な場合にのみ薬物治療を開始します。
      2. 治療前にすべての実験群のベースライン明視野画像を記録します。
      3. すべての対照および処理ウェルにおいて、初期オルガノイド負荷、再プレート後の回復期間、処理開始時間は同一に維持します。
  4. 安全性の考慮事項
    1. 適切な個人用防護具とバイオセーフティの実践を用いて、ヒト由来のオルガノイドを含むすべての処置を行います。
    2. 酵素解離試薬は皮膚や目への露出を避けるため注意深く取り扱ってください。
    3. 液体および固体の生物廃棄物は、機関のバイオセーフティ規則に従って処分してください。

3. HCCオルガノイドの薬物治療

  1. 薬剤の調製と治療
    1. 薬剤調製
      1. メーカーの指示に従ってDMSOにレンバチニブのストック溶液を調製してください。
      2. 使用直前に、あらかじめ定められた作業濃度まで、予温された培地でストック溶液を希釈します。
      3. すべてのウェルで最終DMSO濃度を同じに保つこと(≤0.1%)。
      4. 各井戸で最終処理量が均等になるよう十分な体積を準備してください。
    2. 薬物治療
      1. 各ウェルの壁にレンバチニブ含有培地(20μM)を加え、マトリックスドームを乱さないようにします。
      2. 同じ最終DMSO濃度を持つ車両制御装置も含めてください。
      3. オルガノイドを標準培養条件下であらかじめ定められた処理期間内に培養します。
      4. 72時間を超える治療期間は、48〜72時間ごとに薬剤含有培地を交換してください。
      5. 実験内のすべての井戸で同じ培地交換スケジュールを用いてください。
      6. 治療前に明視野の基準画像を記録してください。
      7. 処理中は、同一の顕微鏡設定、倍率、視野位置を用いて一定間隔で画像を取得します。
  2. 治療反応の評価
    1. 形態論に基づく評価
      1. 以下の画像ベースの読み取り値を用いて治療反応を評価する:オルガノイド面積成長曲線、平均オルガノイド直径、生存オルガノイド数。
      2. すべての画像で同じ露出設定、倍率、分析閾値を使いましょう。
      3. オルガノイド面積成長曲線を測定するには、各時点で井戸またはフィールドあたりの総オルガノイド面積を計算し、基準値に正規化します。
      4. 個々の完全なオルガノイドの直径を測定し、井戸ごとの平均値を計算することで平均オルガノイド直径を測定します。
      5. 形態学的に識別可能な完全なオルガノイドを数え、破片や崩壊した破片を除外して生存オルガノイド数を決定します。
    2. オプションの生存可能性測定
      1. 追加のバルク生存可能性評価が必要な場合は、治療エンドポイントで三次元発光の生存可能性アッセイを実施します。
      2. アッセイの実行は製造元の指示に従ってください。
  3. データ分析
    1. オルガノイド面積の成長曲線を時間とともにプロットします。
    2. 車両処理群とレンバチニブ処理群の平均オルガノイド径を比較します。
    3. 治療群間で生存するオルガノイド数を比較します。
    4. 再現性を確保するために、すべてのグループで同一の画像取得スケジュール、オルガノイド包含基準、解析パラメータを適用すること。

4. 単細胞RNAシーケンシングのためのオルガノイドの調製

  1. オルガノイドの選択と回収
    1. 解離前の評価
      1. 広範な崩壊なしに完全な三次元形態を持ち、下流の単一細胞捕獲に十分な物質を含み、明らかな汚染がないオルガノイド井戸を選定します。
      2. 対照試料と処理された試料の一致した実験時間点でオルガノイドを採取します。
      3. 試料間で同一のメッキ密度、処理スケジュール、培地置換条件を維持してください。
      4. 分離前に同一の顕微鏡設定、拡大率、場選択基準を用いて、各選択対象の明視野画像を記録します。
    2. 行列の除去
      1. 各井戸から培地を完全に吸引してください。
      2. 各井戸を氷冷PBSで2回洗い、残留中の培地やゴミを取り除きます。
      3. 各ウェルに1mLの氷冷セル回収液を加えます。
      4. 氷で20〜30分孵化します。
      5. 培養中は5〜7分ごとに優しくピペットを動かし、マトリックスの溶解を促します。
      6. 溶解物質を広口径または切断ピペットの先端で予冷却チューブに移し、せん断応力を最小限に抑えます。
      7. マトリックスがほぼ溶解し、最小限の目に見えるゲル残基が残った後にのみ酵素解離を進めます。
  2. 酵素解離と単細胞懸濁調製
    1. 酵素解離
      1. 回収したオルガノイド懸濁液を300× gで4°Cで5分間遠心分離します。
      2. ペレットを乱さないように上清液を慎重に除去してください。
      3. ペレットを1mLの組換え細胞解離酵素に再懸浮させます。
      4. 37°Cで5〜10分間培養します。
      5. ピペットは広口径のP1000チップを使って2〜3分ごとに8〜10回優しく擦り、解離を促進します。
      6. ほとんどのオルガノイド断片が単一細胞に分散し、小さな残留クラスターだけが残った時点で消化を停止します。
      7. 細胞生存率の低下、ストレス関連の転写アーティファクト、周囲のRNA汚染の増加を防ぐために、消化の延長を避けてください。
    2. 焼入れとろ過
      1. 消化を止めるために、2%の胎児用牛血清を含む氷で冷たいPBSを4mL加えます。
      2. 懸濁液を40μmのセルストレーナーでろ過します。
      3. 残留酵素や骨材、ゴミを取り除くためにPBSで一度洗ってください。
      4. 赤血球汚染がある場合は、製造元の指示に従って赤血球溶解を行います。
    3. セルの調製と品質管理
      1. トリパンブルー排除を用いて細胞数を数えます。
      2. ライブラリー準備前に細胞生存率を判断してください。
      3. 生存率85%≥サンプルのみを使いましょう。
      4. 最終セル濃度を700〜1,200セル/μLに調整します。
      5. 過剰な破片、豊富な死細胞、大きな目に見える集合体、または不完全な解離を持つサンプルは除外します。
      6. 骨材がある場合は、装填前に再度ろ過してください。
      7. 解離酵素、消化時間、ピペッティング頻度、ろ過方法、細胞濃度、ロード戦略を含む同一条件下でのプロセス制御および処理サンプル。
  3. 単細胞ライブラリの調製とシーケンス
    1. 単一セルキャプチャおよびライブラリ調製
      1. 製造元の指示に従い、準備済みの単一セルサスペンションを液滴型単一セル捕捉プラットフォームに搭載します。
      2. 対応する単細胞3′ワークフローを用いて逆転写、cDNA増幅、ライブラリー構築を行います。
    2. シーケンスパラメータ
      1. 1セルあたり少なくとも50,000リードの深さにある配列ライブラリ。
      2. ロードセルはライブラリあたり約6,000〜10,000セルの回収を実現しています。
      3. シーケンス化学、読み取り構造、機器設定を記録します。
  4. 下流解析の品質基準
    1. 最終調製物が細胞生存率が高く、残骸が最小限で、骨材負荷が低いことを保証してください。
    2. 細胞の異質性および細胞状態転移の下流単一細胞トランスクリプトミック解析の適合性を確認する。

5. 単一細胞RNAシーケンシングデータの基本的な処理と品質管理

  1. 一次処理
    1. カウント行列の生成
      1. 選択したプラットフォームに推奨されるパイプラインを使って生のシーケンスデータを処理します。
      2. 遺伝子ごとに細胞数を算出するマトリックスを作成します。
      3. 記録ソフトウェアのバージョン、リファレンスゲノム構築、トランスクリプト注釈リリース。
    2. 図書館レベルの初期品質評価
      1. 各ライブラリのシーケンス指標を要約し、総リード数、回収された推定細胞数、細胞あたりの中央値遺伝子数、細胞あたりの中央値UMI、および該当する場合のシーケンス飽和度を含みます。
      2. すべてのサンプルで同一の参照ゲノムと注釈設定を使用してください。
  2. 細胞レベルの品質管理
    1. 低品質セルのろ過
      1. 各細胞について検出された遺伝子数、総UMI数、ミトコンドリア転写産物の割合、および二重または多重の証拠を評価します。
      2. 極めて低い遺伝子数、極めて低いUMI数、または異常に高いミトコンドリア転写物分数を持つ細胞は除外します。
      3. データセットの分布に基づいてフィルタリング閾値を定義します。
      4. マッチした治療群間で同一の閾値を適用します。
    2. おそらくダブルレットの除去
      1. 適切な計算方法を用いて、起こりうる二重形を特定します。
      2. プラットフォーム互換の検出ワークフローでダブルレットを削除してください。
      3. すべてのサンプルに対して同じダブレット検出戦略を適用します。
  3. 正規化、クラスタリング、注釈
    1. データ正規化
      1. 標準的な単一細胞RNAシークエンスワークフローを用いてフィルタリング済みカウントマトリックスを正規化します。
      2. すべてのサンプルに対して同一の正規化手順を適用します。
    2. 次元削減とクラスタリング
      1. 次元削減を行います。
      2. 主要な転写集団を特定するために、教師なしクラスタリングを実施します。
      3. UMAPのような低次元埋め込み法を用いてセル状態を可視化します。
    3. マーカー遺伝子同定
      1. クラスター間の差異発現解析を用いてマーカー遺伝子を特定します。
      2. マーカー発現に基づいて主要な上皮細胞状態に生物学的解釈を割り当てます。
  4. 処理条件の比較解析
    1. メタデータ統合
      1. 各細胞に治療状態、患者由来のオルガノイドライン、処理バッチを注釈してください。
      2. すべてのサンプルで一貫したメタデータ構造を維持しましょう。
    2. 治療関連の変化の分析
      1. 対照サンプルと処理されたサンプルを比較してください。
      2. 治療関連転写リモデリングを特定します。
      3. 細胞状態の組成の変化を特定しましょう。
      4. 治療適応に関連する候補細胞集団を特定すること。
      5. 結果を形態学および生存可能性に基づく読み取りと併用して解釈します。
  5. データ分析の成果
    1. 品質管理された遺伝子ごとの細胞数マトリックスを作成します。
    2. 転写的に異なる集団の低次元可視化を生成する。
    3. 主要なクラスターのマーカー遺伝子を特定しましょう。
    4. 参照ゲノム、前処理ワークフロー、フィルタリング基準、クラスタリング戦略、注釈基準のすべてのサンプル間で一貫性を維持します。
    5. 標準ワークフローから逸脱したサンプル特有の逸脱があれば記録してください。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

図1 は肝細胞がん(HCC)オルガノイドの生成と特徴付けを示しています。 図1Aでは、患者由来の腫瘍組織を用いて組織学的解析および治療研究のためのオルガノイド培養を確立しました。 図1B は、回復後1日目および6日目のオルガノイドの明視野画像を示し、標準的な三次元培養条件下での生存と拡大を示しています。1日目にはオルガノイドは小さくコンパクトな構造として現れますが、6日目には大きくなり、形態が明確に現れます。 図1C は、拡張中のオルガノイドの明視野染色、ヘマトキシリン染色、エオシン染色、さらにEPCAM、AFP、SOX9、HNF4A、ALBの免疫染色を示し、肝細胞系統特性を確認しています。これらの観察は、持続的な成長、形態の保存、肝細胞系譜マーカーの発現から、HCCオルガノイドの確立と拡大に成功したことを示しています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

再現性、効率性、高品質な単一細胞トランスクリプトミクス解析を確保するために、このワークフローには慎重な管理が必要です。患者由来のHCCオルガノイドの復活および増殖における一貫性は不可欠です。なぜなら、シーディング密度、基底膜マトリックス組成、培養タイミングの変化がオルガノイド形態、成長、下流の処理反応に影響を与える可能性があるからです(13,14)。さらに、解離中の細胞生存率が高いことはscRNA-seqにとって重要であり、激しい酵素消化や過度の機械的破壊はストレス関連の転写アーティファクトを引き起こし、データの質を低下させる可能性があります。低温や低温活性酵素条件を含む最適化された解離戦略は、感受性の高いオルガノイドサンプルの細胞組成の保存に役立つ可能性があります15。

このプロトコルは実験のニーズに基づく戦略的調整を可能にします。成長が遅い、解凍後...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は中国国家自然科学基金(82303022; 82122048; 82372714; 82203380)、広東基礎応用基礎研究基金(2023A1515011416)、広州基礎応用基礎研究基金(2024A04J6575)の支援を受けました。一部の回路図要素はHome for Researchers(https://www.home-for-researchers.com)を用いて作成され、著者によって適応されました。回路図はFigdraw(https://www.figdraw.com)を使って作成され、著者によって適応されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
[Leu15]-ガストリン I ヒトメルクG9145
1.5 mLマイクロチューブメルクAXYMCT150LC
1×赤血球溶解バッファーサーモフィッシャー・サイエンティフィック00-4333-57
2.0ml内スレッドクライオジェニックバイアル巣607001
A8301(TGFb阻害剤)トクリス・バイオサイエンス2939
AFPポリクローナル抗体プロテインテック14550-1-AP
抗アルブミン抗体 [ALB/2144]アブカムAB236492
抗HNF-4-α抗体[EPR16885] - ChIPグレードアブカムAB181604
抗前アルブミン抗体[EPR3219]アブカムAB92469
抗SOX9抗体 [EPR14335-78]アブカムab185966
ビタミンAを含まないB27サプリメント(503)サーモフィッシャー・サイエンティフィック12587010
細胞回復液、100 mLコーニング354253基底膜マトリックスを溶解し、オルガノイドを回収し、再メッキや下流処理前に使用する試薬
CellTiter-Glo® 3D細胞生存能力アッセイプロメガG9681
CHIR99021メルクSML1046
クロム Next GEM シングルセル3' GEM、ライブラリ&ジェルビードキット v3.110x ゲノミクスCG000227
コーニングセルストレーナー、40 & mu;m、ブルー、S、IND、1/50コーニング431750
Costar 24ウェルクリアフラットボトム超低装アタッチメント、複数ウェルプレート、個別包装、無菌コーニング3473
カルトレックス低減成長因子BME、タイプ2パスクリア(BME)メルク3533-005-02三次元オルガノイド培養とドーム形成を支える細胞外マトリックス
DMSOメルクC6164薬剤ストック溶液の調製および車両制御に用いられる溶媒
ダルベッコの改良型イーグル中型/ハムのF-12サーモフィッシャー・サイエンティフィック12634028高度なDMEM/F-12
E7080(レンバチニブ)セレックS1164オルガノイド治療および治療的摂動に用いられるチロシンキナーゼ阻害剤
胎児用牛血清値FBSギブコA5256701
フォルスコリントクリス・バイオサイエンス1099
グルタMAXサプリメントサーモフィッシャー・サイエンティフィック35050061
ヘマトキシリン・エオシン染色キットビヨタイムC0105S
HEPES、1 Mサーモフィッシャー・サイエンティフィック15630080
ライカ DM6 B 蛍光モーター化顕微鏡ライカ該当なし
N2補足(1003年)サーモフィッシャー・サイエンティフィック17502048
N-アセチルシステインメルクA0737-5MG
ニコチナミドメルクN0636
Nunc 15 mL円錐形無菌ポリプロピレン遠心分離機チューブサーモフィッシャー・サイエンティフィック339651
ペニシリン/ストレプトマイシン(10,000 U/mL)サーモフィッシャー・サイエンティフィック15140122
リン酸塩緩衝生理食塩水ジェノムバイオGNM20012オルガノイドの洗浄および下流処理用の試料準備に用いられるバッファー
組換えヒトEGFペプロテックAF-100-15
組換えヒトFGF10ペプロテック100-26
組換えヒトHGFペプロテック100-39
組換えヒト・ノギンペプロテック120-10C
ローキナーゼ阻害剤Y-27632ジヒドロクロライドメルクY0503解凍または通過後のオルガノイド生存を促進するために用いられるROCK阻害剤
R-スポディン1調制培地(Broutierら)該当なし細胞株の分泌
トリパンブルー染色、0.4%の膜をろ過し、0.85%の生理食塩水で調製ギブコ15250061
TrypLEエクスプレス酵素(1x)、フェノールレッドなしサーモフィッシャー・サイエンティフィック12604013トリプシン代替品
Wnt-3a調整培地(Broutierら)該当なし細胞株の分泌

参考文献

  1. Villanueva, A. Hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 380 (15), 1450-1462 (2019).
  2. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).
  3. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  4. Safri, F., et al. Heterogeneity of hepatocellular carcinoma: from mechanisms to clinical implications. Cancer Gene Ther. 31 (8), 1105-1112 (2024).
  5. Zhang, X. F., et al. Targeting cell-state plasticity driven by FOXM1/CEBPB axis disrupts developmental heterogeneity and therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 84 (2), 370-384 (2026).
  6. Thorel, L., et al. Patient-derived tumor organoids: a new avenue for preclinical research and precision medicine in oncology. Exp Mol Med. 56 (7), 1531-1551 (2024).
  7. Liu, Y., et al. A decade of liver organoids: advances in disease modeling. Clin Mol Hepatol. 29 (3), 643-669 (2023).
  8. Li, L., et al. Human primary liver cancer organoids reveal intratumor and interpatient drug response heterogeneity. JCI Insight. 4 (2), e121490 (2019).
  9. Yang, H., et al. Pharmacogenomic profiling of intra-tumor heterogeneity using a large organoid biobank of liver cancer. Cancer Cell. 42 (4), 535-551.e8 (2024).
  10. Xing, L., et al. RNA-based therapies in hepatocellular carcinoma: state of the art and clinical perspectives. Hepatoma Res. 10, 24 (2024).
  11. Aissa, A. F., et al. Single-cell transcriptional changes associated with drug tolerance and response to combination therapies in cancer. Nat Commun. 12 (1), 1628 (2021).
  12. Zhang, C. Y., et al. Development and optimization of a human hepatocellular carcinoma patient-derived organoid model for potential target identification and drug discovery. J Vis Exp. (198), e65785 (2023).
  13. Wang, Q., et al. Breakthroughs and challenges of organoid models for assessing cancer immunotherapy: a cutting-edge tool for advancing personalised treatments. Cell Death Discov. 11 (1), 222 (2025).
  14. Yang, C., et al. Modeling methods of different tumor organoids and their application in tumor drug resistance research. Cancer Drug Resist. 8, 32 (2025).
  15. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
  16. Yip, S., et al. Give them vasculature and immune cells: how to fill the gap of organoids. Cells Tissues Organs. 212 (5), 369-382 (2023).
  17. Zhou, C., et al. Standardization of organoid culture in cancer research. Cancer Med. 12 (13), 14375-14386 (2023).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

シングルセルRNAシーケンシング薬物治療応答オルガノイド薬物スクリーニングオルガノイド解離細胞生存率アッセイオルガノイド形態解析遺伝子発現プロファイリング腫瘍異質性パスウェイ濃縮解析
薬物治療後の肝細胞癌オルガノイドの生成および単細胞トランスクリプトミック解析
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。