Method Article

薬物治療後の肝細胞癌オルガノイドの生成および単細胞トランスクリプトミック解析

DOI:

10.3791/70511

⸱

May 26th, 2026

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1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコルは、肝細胞がんオルガノイドの生成、薬物治療の適用、治療前後の単細胞RNAシーケンスの簡潔化方法を概説し、治療関連の転写変化を特徴付けます。

Abstract

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肝細胞癌は世界中のがん関連死亡率の主要な原因であり、著しい腫瘍内異質性が特徴で、治療反応の変動、腫瘍再発、疾患進行に寄与しています。したがって、薬物治療の前後に腫瘍細胞が転写レベルでどのように変化するかをより深く理解することは、治療戦略の改善に不可欠です。しかし、オルガノイドベースの薬物治療と下流の単一細胞トランスクリプトムプロファイリングを結びつける実践的な実験ワークフローは限られています。本研究では、肝細胞がんオルガノイドの生成、定義された薬物治療の適用、治療前後に採取されたサンプルに対する単細胞RNAシーケンスの標準化されたワークフローを開発しました。プロトコルにはオルガノイドの再生と増殖、治療前の品質評価、薬物曝露、単細胞解離のためのオルガノイド調製、ライブラリー構築、および単細胞トランスクリプトミクスデータの基本的な比較解析が含まれます。再現性とサンプルの品質を向上させるために重要な技術的注意が講じられています。このワークフローにより、肝細胞がんオルガノイドにおける薬物治療に関連する細胞組成および転写変化の並列解析が可能になります。このプロトコルは堅牢でスケーラブル、異なるオルガノイド系に適応可能であり、単一細胞分解能で処理に関連する遺伝子発現変化を調査するための実用的なプラットフォームを提供します。

Introduction

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肝細胞癌(HCC)は成人における最も一般的な原発性肝臓がんであり、世界的にがん関連死亡の主な原因です。1,2,3。臨床的結果が悪いのは、腫瘍内の顕著な異質性によるもので、治療抵抗性や再発率が原因です。最近の研究では、FOXM1/CEBBB軸などの主要な転写プログラムによって駆動される発生的多様性と細胞状態の可塑性がHCC5の治療抵抗性に寄与していることが示されています。これらの発見は、持続的な治療圧力下で腫瘍細胞集団がどのように適応し、状態間を遷移するかを理解する必要性を強調しています。しかし、ほとんどの前臨床モデルはこれらの治療関連状態遷移の動的かつ連続的な性質を十分に捉えておらず、腫瘍適応や治療失敗の機構的調査を制限しています。

患者由来オルガノイド(PDO)は、元の腫瘍の重要なゲノム変異や細胞の異質性を保持するため、この目的に有用なプラットフォームを提供します。HCCオルガノイドは、主要な組織特徴を保持しつつ長期培養で維持できるた....

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Protocol

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ヒト組織を用いた研究は、広州医科大学の研究倫理審査委員会(承認番号)によって審査・承認されました。GYZL-2024-KY31)。ヒト標本を対象としたすべての手技は、人間研究に関する機関のガイドラインに従って実施されました。臨床標本を医学研究で使用するために、すべての患者から書面によるインフォームドコンセントが取得されました。使用される試薬および機器は 材料表に記載されています。

このワークフローには、低温保存された肝細胞がんオルガノイドの回収と増殖が含まれ、下流の治療的撹乱や単細胞RNAシーケンスのための軽微な適応も含まれます。目的は、後の薬物治療実験のために十分な品質と一貫性を持つオルガノイド培養を生成することです。12。

1. HCC患者由来オルガノイドの確立と増殖

  1. 凍結保存オルガノイドの解凍と回収
    1. 解凍前の準備
      1. 水浴を37°Cまで予温めてください。 24ウェルのプレートを37°Cのインキュベーターで少なくとも1時間、プレ平衡させてからメッキを行います。
      2. 事前に完全なオルガノイド培養培地を準備し、使用までベースメント膜エキス(BME)を氷に保管し....

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Results

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図1 は肝細胞がん(HCC)オルガノイドの生成と特徴付けを示しています。 図1Aでは、患者由来の腫瘍組織を用いて組織学的解析および治療研究のためのオルガノイド培養を確立しました。 図1B は、回復後1日目および6日目のオルガノイドの明視野画像を示し、標準的な三次元培養条件下での生存と拡大を示しています。1日目にはオルガノイドは小さくコンパクトな構造として現れますが、6日目には大きくなり、形態が明確に現れます。 図1C は、拡張中のオルガノイドの明視野染色、ヘマトキシリン染色、エオシン染色、さらにEPCAM、AFP、SOX9、HNF4A、ALBの免疫染色を示し、肝細胞系統特性を確認しています。これらの観察は、持続的な成長、形態の保存、肝細胞系譜マーカーの発現から、HCCオルガノイドの確立と拡大に成功したことを示しています。

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Discussion

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再現性、効率性、高品質な単一細胞トランスクリプトミクス解析を確保するために、このワークフローには慎重な管理が必要です。患者由来のHCCオルガノイドの復活および増殖における一貫性は不可欠です。なぜなら、シーディング密度、基底膜マトリックス組成、培養タイミングの変化がオルガノイド形態、成長、下流の処理反応に影響を与える可能性があるからです(13,14)。さらに、解離中の細胞生存率が高いことはscRNA-seqにとって重要であり、激しい酵素消化や過度の機械的破壊はストレス関連の転写アーティファクトを引き起こし、データの質を低下させる可能性があります。低温や低温活性酵素条件を含む最適化された解離戦略は、感受性の高いオルガノイドサンプルの細胞組成の保存に役立つ可能性があります15。

このプロトコルは実験のニーズに基づく戦略的調整を可能にします。成長が遅い、解凍後.......

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Disclosures

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著者には開示すべき利益相反はありません。

Acknowledgements

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この研究は中国国家自然科学基金(82303022; 82122048; 82372714; 82203380)、広東基礎応用基礎研究基金(2023A1515011416)、広州基礎応用基礎研究基金(2024A04J6575)の支援を受けました。一部の回路図要素はHome for Researchers(https://www.home-for-researchers.com)を用いて作成され、著者によって適応されました。回路図はFigdraw(https://www.figdraw.com)を使って作成され、著者によって適応されました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
[Leu15]-ガストリン I ヒトメルクG9145
1.5 mLマイクロチューブメルクAXYMCT150LC
1×赤血球溶解バッファーサーモフィッシャー・サイエンティフィック00-4333-57
2.0ml内スレッドクライオジェニックバイアル巣607001
A8301(TGFb阻害剤)トクリス・バイオサイエンス2939
AFPポリクローナル抗体プロテインテック14550-1-AP
抗アルブミン抗体 [ALB/2144]アブカムAB236492
抗HNF-4-α抗体[EPR16885] - ChIPグレードアブカムAB181604
抗前アルブミン抗体[EPR3219]アブカムAB92469
抗SOX9抗体 [EPR14335-78]アブカムab185966
ビタミンAを含まないB27サプリメント(503)サーモフィッシャー・サイエンティフィック12587010
細胞回復液、100 mLコーニング354253基底膜マトリックスを溶解し、オルガノイドを回収し、再メッキや下流処理前に使用する試薬
CellTiter-Glo® 3D細胞生存能力アッセイプロメガG9681
CHIR99021メルクSML1046
クロム Next GEM シングルセル3' GEM、ライブラリ&ジェルビードキット v3.110x ゲノミクスCG000227
コーニングセルストレーナー、40 & mu;m、ブルー、S、IND、1/50コーニング431750
Costar 24ウェルクリアフラットボトム超低装アタッチメント、複数ウェルプレート、個別包装、無菌コーニング3473
カルトレックス低減成長因子BME、タイプ2パスクリア(BME)メルク3533-005-02三次元オルガノイド培養とドーム形成を支える細胞外マトリックス
DMSOメルクC6164薬剤ストック溶液の調製および車両制御に用いられる溶媒
ダルベッコの改良型イーグル中型/ハムのF-12サーモフィッシャー・サイエンティフィック12634028高度なDMEM/F-12
E7080(レンバチニブ)セレックS1164オルガノイド治療および治療的摂動に用いられるチロシンキナーゼ阻害剤
胎児用牛血清値FBSギブコA5256701
フォルスコリントクリス・バイオサイエンス1099
グルタMAXサプリメントサーモフィッシャー・サイエンティフィック35050061
ヘマトキシリン・エオシン染色キットビヨタイムC0105S
HEPES、1 Mサーモフィッシャー・サイエンティフィック15630080
ライカ DM6 B 蛍光モーター化顕微鏡ライカ該当なし
N2補足(1003年)サーモフィッシャー・サイエンティフィック17502048
N-アセチルシステインメルクA0737-5MG
ニコチナミドメルクN0636
Nunc 15 mL円錐形無菌ポリプロピレン遠心分離機チューブサーモフィッシャー・サイエンティフィック339651
ペニシリン/ストレプトマイシン(10,000 U/mL)サーモフィッシャー・サイエンティフィック15140122
リン酸塩緩衝生理食塩水ジェノムバイオGNM20012オルガノイドの洗浄および下流処理用の試料準備に用いられるバッファー
組換えヒトEGFペプロテックAF-100-15
組換えヒトFGF10ペプロテック100-26
組換えヒトHGFペプロテック100-39
組換えヒト・ノギンペプロテック120-10C
ローキナーゼ阻害剤Y-27632ジヒドロクロライドメルクY0503解凍または通過後のオルガノイド生存を促進するために用いられるROCK阻害剤
R-スポディン1調制培地(Broutierら)該当なし細胞株の分泌
トリパンブルー染色、0.4%の膜をろ過し、0.85%の生理食塩水で調製ギブコ15250061
TrypLEエクスプレス酵素(1x)、フェノールレッドなしサーモフィッシャー・サイエンティフィック12604013トリプシン代替品
Wnt-3a調整培地(Broutierら)該当なし細胞株の分泌

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