懸濁T細胞および3D細胞モデルにおける低入力CRISPRゲノム編集およびmRNAトランスフェクションのためのデジタルマイクロ流体電気穿孔プラットフォーム

サマリー

このプロトコルは、一次ヒトT細胞におけるTCRα/β受容体の微型CRISPR–Cas9ゲノム編集を、デジタルマイクロ流体(DMF)エレクトロポレーションプラットフォーム「DMF-ection」を用いて説明しています。この方法は並列で低入力の遺伝子編集を高生存率で可能にし、さらにmRNAの多細胞3D球体への送達にも適応可能です。

要約

デジタルマイクロ流体(DMF)電気穿孔は、細胞入力を最大100倍に抑えつつ、哺乳類細胞の精密かつ低ボリュームの遺伝子操作を可能にします。本研究は、一次ヒト懸濁T細胞におけるTRAC遺伝子座のCRISPR介接ノックアウトおよび三次元HEK293T球体のmRNAトランスフェクションにおける高スループットDMFベースのトランスフェクションワークフローを提示します。空間的に沈着したCRISPRガイドRNAとオンカートリッジリボ核タンパク質(RNP)アセンブリを用いて、CD4⁺およびCD8⁺ T細胞群の両方で、1条件下10,000個の細胞で効率的な TRAC 位座破壊が達成され、後編集の生存率は85%を超えました。フロー誘導解析およびテイラー分散解析を用いた生物物理的特徴付けにより、ポリマー添加剤は電気孔槽バッファー条件下でCas9–sgRNA複合体を安定化させ、サブマイクロリットルの体積での再現性編集を支持することが明らかになりました。さらに、EGFP mRNAを完全なHEK293T球体に送達することで、3D応用にも適応され、球状体の成長や形態を損なうことなく、堅牢で空間的に均一な蛍光が得られました。これらの結果を総合すると、DMFエレクトロポレーションが懸濁免疫細胞および多細胞球体の両方で効率的なゲノム編集とmRNA送達を可能にすることを示しています。このプラットフォームは、CAR-T細胞療法、機能ゲノミクス、高度な3D細胞モデルへの応用において、スケーラブルで低入力のソリューションを提供します。

概要

一次ヒト細胞における遺伝子編集は、免疫工学、希少疾患モデリング、機能ゲノ^{ミクスなど}、治療開発と基礎研究の両方においてますます中心的な役割を果たしています。エレクトロポレーションは高効率なゲノム編集を可能にしますが、従来のキュベットベースのシステムは通常、1つの疾患ごとに最大数百万の細胞を必要とし、患者由来のサンプルや希少な免疫集団への利用が制限されます²。さらに、これらのシステムはスループット、自動化、試^薬消費量の制限により大規模なスクリーニングには適していません。

マイクロ流体電気孔育は、低入力ゲノ^ム編集の有望なアプローチとして浮上しています。しかし、既存のプラットフォームの多くは、複雑な流体取り扱いを伴う連続流アーキテクチャに依存しており、試薬混合の柔軟性が限られ、条件あたりのセル要件は比較的高いです。これに対し、デジタルマイクロ流体(DMF)は平面電極アレイ上の離散的なナノリットルスケールの液滴を能動的に操作し、反応組成、タイミング、空間的局在を精密に制御することを可能にします。このプラグアンドプレイのドロップレットベースのフォーマットは、一次細胞や試薬の保存^{が不可欠な低}ボリューム・高スループットのワークフローに非常に適しています5。

最近の研究では、三滴電弧電気穿孔アーキテクチャを用いたDMFを用いた細胞内送達の実現可能性が示されており、局所的で低電流の電場を生成し、効率的なRNPおよびmRNAの送達を行い、熱的および電気化学的ストレスを最小限に抑えています^6,7,8。この基盤の上に、次世代のDMF電気孔化プラットフォーム「DMF-ection」が開発されました。これは48の独立アドレス可能な反応部位、完全な自動化互換性、そして拡張可能なカートリ^{ッジ製造9}(図1)を備えています。DMFカートリッジは、下部PCBプレートとプラスチックトッププレートがガスケットで区切られ、アライメントスナップで単一の正しい向きで組み立てられています(図1A)。48プレックスのレイアウトは8つの同一ファミリー(図1A–H)に構成されており、それぞれ6つの独立してアドレス可能な電気穿孔部位を含み、カートリッジあたり最大48の並列編集条件をサポートします(図1B)。ガイドRNAライブラリーは、カートリッジ組み立て前に音響ディスペンサーを使って基質表面に堆積されます。48か所すべてで位置の沈着精度が確認され、ドロップ位置は電極中央点からサブミリメートルの偏り以内に集まり(図1C)、信頼性の高いオンカートリッジRNPアセンブリを支持しました。装填後、セルと液体電極液滴がオンカートリッジで作動され、三滴電弧形状が形成されます(図1D)。電気穿孔後、細胞は培養プレートにオフロードされ、回収およびフローサイトメトリー、シーケンス、顕微鏡検査を含む下流解析を行います(図1E)。このシステムは、標準的なキュベットベースの手法に比べて最大100倍少ない細胞数で高効率なゲノム編集を可能にし、低入力かつ高スループットの応用におけるゲノム工学へのアクセスを大幅に拡大します。

本研究では、mRNAおよびCRISPR–Cas9リボ核タンパク質(RNP)複合体を含む複数の生体分子貨物を送達することでプラットフォームの性能を評価し、効率的なトランスフェクションおよび遺伝子破壊を実現しています。一次T細胞に加え、DMF誘導は核酸を複雑な多細胞構造に届ける汎用的な枠組みを提供します。三次元(3D)球体やオルガノイド型モデルは、その構造と脆弱性の関係から試薬の浸透に大きな障壁を課し、従来の電気穿孔法は形態を乱したり、不均一な送達を生じさせたりすることが多いです。T細胞編集に用いられるのと同じ小型電気穿孔原理が構造組織にも適用されるかどうかを評価するため、DMFワークフローを3D HEK293T球体に適用しました。これらの実験により、DMFベースの電気湿潤法が三滴形状内に無傷の球体を優しく配置し、構造と成長を保ちつつ均一なmRNA送達を支えることが示されました。これらの結果はここで述べた主要なT細胞プロトコルの外ですが、新創薬や疾患モデリングに関連する新興3D細胞システムに対するプログラム可能なDMF電気孔解のより広範な応用可能性を示しています。

プロトコル

本プロトコルで使用される一次ヒトT細胞は、インフォームドナーの同意のもと、適用される機関的、倫理的、規制ガイドラインに準拠した商業供給者から取得されました。ヒト由来生物材料のすべての取り扱いは、機関のバイオセーフティプロトコルに従って行われました。このプロトコルを実施する研究者は、一次ヒト細胞の使用が地域の機関審査委員会(IRB)または倫理委員会の要件、適用されるバイオセーフティ規制、およびヒト生物材料の使用を規定する関連する国または地域の法令に準拠していることを保証します。本研究で使用された細胞材料には患者を特定できる情報は一切認められませんでした。

1. 一次ヒトT細胞の調製および活性化

1. ヒトの一次CD3⁺ T細胞を37°Cの水浴で迅速に凍結保存します。細胞を予温した基底T細胞培地に移し、180× g で10分間遠心分離します。上澄液を捨て、ペレットを新しい培地に再懸濁させます。
2. 自動細胞計数器を用いて細胞濃度と生存率を測定します。
3. 細胞を1〜10×^6細胞/ mLで再懸濁し、T細胞培養培地に可溶性四量体抗体CD3/CD28 T細胞活性化刺激(ベンダー指示に従い)と200 IU/mLのIL-2を補足します。細胞を37°C、5% CO₂で72時間培養します。
   注意:活性化時は細胞密度を0.5〜2×10⁶ cells/mLの範囲に保ってください。U底96ウェルプレートで活性化を行い、細胞とアクチベーターの接触と活性化効率を最適化します。

2. DMF基質上のガイドRNAスポットの準備(音響ディスペンサースポッティング)

1. ヌクレアーゼフリー水で凍結乾燥したsgRNAを100μMのストック濃度に再構成します。別のチューブで、ヌクレアーゼフリー水にポリL-グルタミン酸(PGA、ナトリウム塩、MW 15,000〜50,000 Da)を100 mg/mLのストックで準備します。sgRNAとPGAストックを5:4の体積比(sgRNA: PGA)で組み合わせると、最終sgRNA濃度は55.6 pmol/μL、最終PGA濃度は44.4 mg/mLとなり、ヌクレアーゼフリー水に表されます。ボルテックスを短時間、遠心分離機で1,00×0 g で30秒間遠心分離し、使い捨ての量に分割し、未使用の分量は−80°Cで最大6か月間保存します。
   注意:繰り返しの凍結融解サイクルは避けてください。
2. ガイドPGA混合液を、目的の反応部位配置に対応するウェル内の低デッドボリューム音響源板に加えます。
3. ガイド-PGA混合物の40 nL(2.2 pmol sgRNAに相当)を、校正済みの音響ディスペンサーを使ってDMF基質の各ターゲットスポッティング領域に移します。
   注:55.6 pmol/μLの場合、40 nLは1サイトあたり2.2 pmolのsgRNAを供給します(55.6 × 0.040 = 2.22 pmol)。ドライガイドはドロップレットマージオンカートリッジの際に再構成されます。完全な停止は、各サイト間の編集効率の一貫によって確認されています。
4. 生物安全キャビネット内で、斑点滴を室温で完全に自然乾燥させ、目に見える液体がなくなるまで約5分間待ります。
   注意:強制的な空気の流れや加熱は使わないでください。ガイドRNAが外れたり劣化したりする恐れがあります。
5. DMFカートリッジを組み立てます。
   1. 生物学的安全キャビネットでは、トッププレートの非対称プラスチックのスナップ機能を下板の切り欠きに合わせて、スポット付き基材の上にトッププレートを合わせます。短辺に沿って均等に同時に圧力をかけ、明確な機械的なスナップ音を感じてロック機能が完全に噛み合うことを確認します。
      注:カートリッジは単一の正しい向きで設計されています。誤った組み立てではスナップは発生しません。基材は常に縁を押さえて、機能的な表面への汚染や損傷を防ぎ、基材同士が滑り合うと表面コーティングに傷がつく恐れがあります。
   2. チェックポイント:機械式のスナップで正しい組み立てを確認しましょう。
      注:コーティングの完全性を示す事前電気的インジケーターはありません。不適切な組立による機能的故障は自動的に検出され、実行後のQCレポートで報告されます。
      一時停止:未使用の組み立てカートリッジを乾燥剤(シリカゲルパック)とともに密封したパッケージに入り、室温で最大48時間保存します。

3. 細胞の製造

1. 使用前にDMF互換電気穿孔バッファーと付属の生体適合性非イオン界面活性剤を20:1(v/v)比率で混合し、最終界面活性剤濃度0.05%(v/v)で1mLの完全トランスフェクションバッファーを準備してください。優しく混ぜて、氷のままにしてください。
   注:ここで使用されているDMF互換トランスフェクションバッファーは、低伝導率の等張バッファー(導電率:3.5 mS/cm、浸透圧:305 mOsm/L)です。代替バッファーを使用する研究者は、DMF作動および細胞の生存可能性との適合性を検証すべきです。生体適合性のある非イオン界面活性剤は、液滴固定を減らす役割を果たします。もし提供された界面活性剤が使われない場合は、適切な代替品を用いてください。
2. 活性化T細胞をトランスフェクションバッファー(界面活性剤なし)で一度洗浄します。180 × g で遠心分離機を5分間行い、上清液を吸引し、細胞ペレットを完全トランスフェクションバッファー(界面活性剤を含む)に1.0 × 10^{7 cell/} mLで1カートリッジあたり100 μLの総容量で再懸浮させます。冷やしておけ。
3. カートリッジに装填直前、Cas9ヌクレアーゼを100μLのTセル懸濁液に直接加え、優しくピペッティングして混合します。氷をつけておけ。
   注:一次T細胞の場合、Cas9は100μLカートリッジ容量あたり42pmol(0.42pmol/μL)で充填されます。各電気孔離脱部位は約1μLの細胞懸濁液を処理し、1回の編集で0.42 pmolのCas9を供給します。他の免疫細胞タイプに適応する際にはこの用量を最適化してください( 表1参照)。

構成要素	編集ごとの最終濃度
Cas9	0.42 pmol ⁴ ⁒ ⁻¹ μL 液滴
sgRNA	2.1 pmol(40 nLスポットから)
PGA	スポッティングミックス中の44.4 mg/mLストック
界面活性剤	0.05%(v/v)
セル入力	~10,000セル

表1:各トランスフェクションドロップレットの最終濃度の要約表。

4. DMF生成プラットフォーム上のトランスフェクション

1. マルチチャネルピペットを用いて、Tセル/Cas9混合液を8セルのローディングポートそれぞれに10μL、完全なトランスフェクションバッファー10μLを16の液体電極ローディングポートに注入します( 図 1参照)。
2. 電圧を500Vに、パルス持続時間を3ms、パルス数を2に設定します。プラットフォームの指示に従って電気穿孔シーケンスを開始してください。
   1. チェックポイント:ラン終了直後にQCレポートを確認してください。断続的な失敗(<10%)は介入を必要としません。故障が一定の場合は、付属のQCボードにカートリッジを交換し、システムヘルスチェック(約2分)を実行し、問題が解決しない場合は技術サポートに連絡してください。

5. 編集されたT細胞のオフロードと回収

1. 液体ハンドラーを用いて、各反応部位から電解孔出した細胞を、150μLの予温基底T細胞培地に200 IU/mLのIL-2を補足した96ウェルのU型底板に移します。
2. 細胞を37°C、5%のCO₂で72時間培養し、タンパク質のターンオーバーと表面受容体の発現変化を促します。

6. TRAC ノックアウトのフローサイトメトリー解析

1. 洗浄間の細胞損失を減らすために、無菌の96ウェル円錐形底板に細胞を移します。400 × g で遠心分離し、円錐形底板を優しく反転させて上清液を除去し、フローサイトメトリーバッファー(1× PBS、2% FBS、2 mM EDTA)で2回洗浄します。細胞はプレート内にペレット状のまま残ります。
2. 製造者推奨濃度で、抗CD4、抗CD8、抗TCRα/β抗体を含むフローサイトメトリーバッファー内の表面染色マスターミックスを準備します。1ウェルあたりマスターミックス25μLを加え、光を遮った4°Cで20分間培養します。1×PBS(FBSなし)で400 × g で遠心分離して5分間2回洗います。細胞を1:1,000(v/v)の生存性染料を含む1×PBS100μLに再懸浮させ、光を遮断した室温で10分間培養します。
   注:円錐形の底板は細胞のペレット化に効果的です。すべての段階でセルがしっかり再懸浮されているか確認してください。
3. フローサイトメトリーバッファーで2回セルを洗浄し、1サンプルあたり150〜200μLで再懸濁して取得します。
4. 使用するフルオロクロムに合わせた適切なレーザーラインとフィルターセット(例:バイアビリティ染料用488nm励起、表面マーカー用405nmまたは488nm)を組み合わせてサイトメーターを構成します。単一染色補償制御と染色されていないサンプルを使って電圧を設定します。サンプルあたり最低5,000件のライブシングレットイベントを収集してください。順次ゲートを生細胞→散点する単粒(生存性染料陰性)→→TCRα/β発現。
   注:標準条件下では、細胞が増殖する時間が経っているため、洗浄や染色による損失後、サンプルあたり5,000から10,000以上の生反応が集まることがあります。
5. CD4⁺およびCD8⁺集団内でTCRα/β陰性細胞の頻度を測定することで TRAC 遺伝子破壊を特定します。ノックアウト効率を、各サブセットにおけるTCRα/β陰性細胞の生存シングルレットゲートに対する割合として報告します。

結果

期待される結果
1つの状態につき10,000個の活性化されたT細胞を電気分孔すると、通常は TRAC ノックアウト効率>85%、移植後72時間で生存率>95%となります。フローサイトメトリーでは、TRAC標的条件下でTCRα/β染色が非標的sgRNA対照群(NTC)および電場にさらされていない対照群に比べて明確に失われていることが明らかになりました。特に明記がない限り、nは独立したDMF選択ランが別々の日に行われることを意味します。同じカートリッジの技術的な再現は統計解析前に平均化され、nに独立して寄与しません。ここで報告されたすべてのT細胞実験は、単一の健康なドナーから得られたクリオ保存細胞を用いて行われました。同じプラットフォームを用いたドナー間変動はさらに^特徴付けられています。

陰イオン性ポリマー添加剤による電気ポレーション条件下でのCas9–sgRNAリボ核タンパク質の安定性の向上
デジタルマイクロ流体工学の核心的な設計要件は、電解湿潤中に液滴が自由に滑空できる非常に撥水性の表面です。この特性は液滴の動きや正確な作動に不可欠ですが、試薬の装填には課題をもたらします。アレイスクリーニング用途では、ユーザー定義のペイロードライブラリをカートリッジ表面に直接配置できることが極めて重要です。これにより試薬レイアウトはユーザーのライブラリ設計を反映し、デジタルマイクロ流体ワークフローが追加の転送や手動介入なしにアレイ実験をシームレスに実行できるようにします。音響ディスペンサーを用いたナノディスペンスは、ナノリットルの体積を高精度な位置精度で様々な表面に供給できるため、この作業に非常に適しています。しかし、疎水性カートリッジ表面に落とすと、跳ね返ったりビーディングしたり、均一に広がれず、堆積や回収が不均一になることがよくあります。この変動は、40 nLから120 nLの中間液滴体積で最も顕著に現れます(図2A、n=3、p値< 0.01)。ここで、液滴の運動エネルギーはリバウンドを引き起こすのに十分高いが、表面の付着力が液体を固定するには不十分であると仮説があります。その結果、より高いペイロード投与量での直接オンカートリッジ堆積は、さらなる改良なしには信頼性が低いことがあります。この影響を軽減するために、試薬にはバイオセーフポリマーであるポリL-グルタミン酸(PGA)が補充されました。PGAは生分解性で負に帯電したポリペプチドで、医薬品製剤の安定剤として広く使われており、生細胞のワークフローに優れた適合性を持っています。荷電した骨格は、液滴の接触角を低減させ、より均一な拡散を促進し、反跳を減らし表面の付着を改善すると仮説されています。PGAが存在すると、沈着したフルオレセイン体積は吸収度とともに線形にスケールし、カートリッジ間で分散が著しく減少しました。統計解析により、PGAは40、90、120 nLのスポッティング体積(***p < 0.001、****p < 0.0001)で有意に再現性を向上させ、非常に小さな滴(10〜20 nL)では低運動エネルギーでは反跳があまり顕著でないため、ほとんど差が見られませんでした。

次に、DMFワークフローで使用されるポリマー添加剤の添加が、電気分開に用いられる低容積バッファー条件下でCas9–sgRNAリボヌクレオタンパク質(RNP)の挙動に与える影響を評価しました。この目的のために、フロー誘導分散解析(FIDA)技術が用いられました。FIDAは、流体力学的半径と結合親和度を正確に溶液相測定し、実験環境で用いられるバッファー条件下でタンパク質-核酸相互作用を定量できることから選ばれました。FIDAは、遊離sgRNAが3.45 ± 0.26 nmの流体力学半径(Rh)を示し、小型の単鎖RNA種と一致することを示しました。Cas9による滴定により、Rhが15.32±0.46 nm、サブナモル級の結合親和性(KD = 0.70 ± 0.14 nM)の安定したRNP複合体が得られました(図2)。

ポリマー安定化の効果を評価するために、RNP形成前にガイドRNAにポリL-グルタミン酸(PGA)を添加しました。PGAの存在によりCas9とsgRNAの見かけ上の親和性が低下し(K_D = 67.7 ± 9.5 nM)、複合体サイズは約10 nmに減少しました(図2A 右パネル参照)。親和性の低下は結合が少ない錯体を示唆しますが、より小さく均一な_Rh はPGAが過剰なRNPアセンブリの形成を防ぐことを示唆しています(図2B)。

次に、テイラー分散解析を用いて電気穿孔条件下でRNPの安定性を評価しました(図2C)。ポリマーを使わないと、Cas9–sgRNA混合物は幅広く不適合のテイラーグラムを生み出し、凝集を示すものでした(図2B)。これに対し、0.0025 mg/mLのPGAを加えると、R_h ~ 9.6 nmの明確な単分散分散プロファイル(R² = 0.999)が得られました。これらの結果は、PGAが凝集を防ぎRNPの均一性を向上させることで、再現可能なナノリットルスケールの電気穿孔を支持していることを示しています。この安定化は、下流のT細胞実験で観察される高い編集効率のメカニズム的根拠を提供します。

一次T細胞における線量依存編集効率

FIDA実験ではPGAがRNP組立の効率を低下させることが示されましたが、機能的編集の結果は、通常Cas9に比べて余分なガイドRNAで行われるため、機能的編集結果には影響が少ないと仮定されました。したがって、PGA–RNP入力量はTRAC遺伝子座における一次ヒトT細胞のノックアウト効率への影響を評価しました(図2D)。4つのカートリッジにおいて、40 nL(2.1 pmol)、20 nL(1.05 pmol)、10 nL(0.53 pmol)のRNP入力で編集効率は一貫して高い(>75–80%)を示し、CD4⁺ とCD8⁺ のサブセット間で変動は最小限でした。5 nL(0.26 pmol)でも編集は堅牢であり、高用量と比べてわずかな減少が観察されました。最低用量(2.5 nL、0.13 pmol)では編集効率が大幅に低下し、TRAC KO約~60%で横ばいとなりました。対照群は編集の特異性を確認しました:電気穿孔なしウェル(0V)およびオフカートリッジ制御(OCC)ではバックグラウンドノックアウトのみが見られました。オフカートリッジ対照群(OCC)CD8⁺集団で観察されたTCR陰性周波数の上昇は、活性化後のドナー特異的ベースラインTCRダウンモルテーションを反映していると考えられます。これらの細胞はカートリッジにさらされておらず、電気穿孔や遺伝子編集とは無関係です。これらの結果を総合すると、DMF-ectionがナノリットルスケールのRNP入力においてCRISPR媒介による効率的な編集を可能にすることが示されています。重要なのは、CD4⁺ とCD8⁺ T細胞の編集が同等であり、プラットフォームがT細胞のサブセット全体で適用可能であることを示し、RNP使用をノックアウト効率を損なうことなく1桁以上削減できることを示唆しました。

一次CD4⁺およびCD8⁺ T細胞におけるミニチュア化DMF誘導を用いた効率的な遺伝子破壊
DMFの除去ワークフローの性能をより深く検証するため、CRISPR–Cas9を媒介したTRAC遺伝子座のノックアウトを、ヒトの一次CD4⁺およびCD8⁺ T細胞で、各条件あたり10,000個の活性化細胞のみを用いて評価しました。3つの実験群が含まれました。TRACターゲティングガイド条件(TRAC KO)、RNP送達の非特異的効果を考慮する非標的対照群(NTC)、未処理・操作されていない細胞における基線TCRα/β発現を確立するためのオフカートリッジ対照群(OCC)です。標準的なゲーティング戦略を用いて生シントレットを特定し、その後CD4⁺およびCD8⁺サブセットとTCRα/β発現を測定しました(図3A)。 TRAC 遺伝子座の高効率な破壊は、40回の独立した電気穿孔ランを通じて両方のT細胞サブセットで達成されました。CD4⁺ T細胞では、 TRAC のノックアウト効率は88.4±4.9%で、NTCでは3.2±4.7%、OCC条件下では9.8±5.1%でした。同様の結果はCD8⁺ T細胞でも観察され、TRAC KOは89.8±4.2%、NTCは4.2 ± 7.4%、OCCは20.2 ± 4.9%に達しました(図3B、左)。重要なのは、電気穿孔法は条件間で顕著な細胞毒性を生じさせなかったことです。すべてのグループで生存率は96%を超え、TRAC KO(97.1 ± 1%)、NTC(96.8 ± 1%)、OCC(97 ± 1%)の疾患間に有意差はありませんでした(図3B、右)。これらのデータを総合すると、DMF電気穿孔が複数の独立したランで細胞の生存能力を維持しつつ、強固で高効率なTRAC破壊を可能にすることを示しています。一次ヒトT細胞は、ドナーの十分な情報に基づく商業的な情報源から取得され、機関およびベンダーの倫理ガイドラインに従って取得されました。

デジタルマイクロ流体を用いたHEK293T球体の取り扱い
次に、多細胞三次元構造を用いた応用におけるデジタルマイクロ流体電気穿孔のワークフローが評価されました。中空HEK293T球体は、低付着型マイクロプレートに1井戸あたり約100個の細胞を播種し、24時間培養して球状体形成を可能にすることで形成されました(図4A)。成形された球体はその後収集され、再懸濁され、デジタルマイクロ流体カートリッジに装填されて電気穿孔処理が行われました。処理後、球体は96ウェルプレートにオフロードされ、下流の画像診断および成長解析が行われました。

電気穿孔後の平均1つの球体回収を得るために、取り扱いや移送中の材料損失を補うために、意図的に余分な数の球体をカートリッジに装填しました。約192個の球体が100μLの電気穿孔バッファーに再懸浮され、カートリッジに装填されました。各反応ファミリーは~9.3μLの懸濁液を受け取り、これは~18球体に相当し、個々の液滴には~1μL(1滴あたり1〜2球体)が含まれていました。カートリッジ作動時に約半数の球体が装填ポートに残るため、この装填戦略では三滴電解部位あたり平均~1球体が得られる。

球状体回収の分析では、電解孔後1井戸あたり通常0〜1球体がオフロードされ、反応ファミリーあたり約4〜6球体が回収されることが示されました(図4B 左パネル)。この回収率は理論上の最大値より低く、洗浄時の損失、上清液の吸引、ローディングポート内の球体の保持を反映しています。これらの損失は、球状体直径が小さい(~100μm)と、懸濁液内で非単細胞構造の均一な分布を維持することの本質的な困難さに起因しています。その結果、一部の球体は分布が不均一であったり、三滴領域に入りませんでした。過剰な数の球体を装填することで、ほとんどの電気孔化部位に少なくとも1つの球体が存在することが保証され、マイクロ流体カートリッジ内のDAPI染色球体の顕微鏡画像により一貫した下流解析が可能となりました(図4B、右パネル)。さらなるプロセス最適化により、同等の回復を達成するために必要な球状体数を減らす可能性があります。これらの取り扱い損失にもかかわらず、ワークフローにより三滴電解形状内の完全な球体の穏やかな位置決めが可能となりました。

EGFP mRNAの送達とHEK293T球体における生存可能性
エレクトロポレーション(球状体あたり50 ngのGFP mRNA)をHEK293T球体に効率的に送達することが観察されました。電気穿孔後24時間後に行われた蛍光顕微鏡では、電気穿孔された球体全体で堅牢かつ空間的に均一なGFP発現が確認されましたが、0Vまたはオフカートリッジ制御条件下では検出可能な蛍光は認められませんでした(図4C、左パネル)。球面面積あたりの正規化平均蛍光強度(MFI)の定量解析により、テストされた両方の電気穿孔パラメータセットでトランスフェクションが成功したことが確認されました(図4C、中央パネル)。具体的には、500 V、2 ms、2パルスで電解された球体は、^10-5 ± 3.50 × ^10-5 × 6.96 MFIを示し、375 V、6 ms、1 パルスで電放されたものは^10-5 ± 3.29 × 10-5 × MFIが5.05 ^10-5を示しました。対照条件下(0 ± 0)では測定可能な蛍光は検出されませんでした。両方の電気穿孔条件では対照群に比べて有意に高い蛍光(p < 0.05)が認められ、パルスパラメータ間に統計的に有意な差はありませんでした。電気穿孔が球状体の成長や構造の完全性に悪影響を及ぼすかどうかを評価するため、治療後5日間毎日球状体直径を測定しました。エレクトロポンドされた球体は未処理対照群と同等の成長速度論を示し、mRNAトランスフェクションが球状体の生存率や増殖能力を損なわないことを示唆しました(図4C、右パネル)。これらの結果を総合すると、デジタルマイクロ流体電気ポレーションが構造の完全性と成長を維持しつつ、mRNAを完全な多細胞球体に効率的に送達できることを示し、このプラットフォームを三次元細胞モデルに拡張する可能性を支持しています。

データは平均±標準偏差として提示されます。統計的有意性は、複数比較に対してTukey氏事後補正を用いた一方向ANOVAを用いて決定され、有意性閾値はp < 0.05でした。N値は図に示された独立した生物学的複製(独立したドナーまたは独立したカートリッジラン)を表します。

図1。DMF電気穿孔プラットフォームのアーキテクチャとワークフロー。(A) DMFカートリッジの写真。(B) 組み立て済み48プレックスカートリッジレイアウトの注釈付き回路図(中央画像)。8つの同一ファミリーの(A–H)構成を示しており、それぞれ6つの独立してアドレス可能な電気孔部位を含み、液体電極ローディングポート、セルローディングポート、アノード、カソード、ナノスポット領域がラベル付けされています(左インセット画像)。積み込みポート、荷降ろしポート、組み立てスナップなどの主要な特徴にはラベルが付けられています。カートリッジは、2枚のプレートを一つの正しい向きでスナップフィットさせて、明確な機械的接合を感じるまで組み立てます。右画像:液体ハンドラーのディスペンスマップで、装填ポート(赤)、卸荷ポート(ピンク)、ターゲット領域の識別位置(青)を色分けした位置を示しています。(C) 左:48サイトすべて(n=48)にわたる音響ディスペンスの位置精度を示す画像で、ドロップ位置は電極中央点(mm)に対してプロットされています。この密閉クラスタリングにより、サブミリ波の沈着精度が確認されています。右:細胞液滴による再水和前の正しい中心のスポット(上)と、再水化中に液滴がガイドのある場所を行き来させて再懸浮する様子を示す代表的な写真(下の赤い矢印)。(D) 離散的な電気穿孔領域の上図。(i) ペイロードの再水和による滴の段階的な移動を示す、(ii) 陽極と陰極の間の電気穿孔部位への移動。ここでセル液滴が両側の液体電極液滴と橋渡りし、パルスされる。 (iii)液体ハンドラーによる回収前に、完全なトライドロップが卸荷港に移動すること。(E) エンドツーエンドのワークフロー回路図。ガイドRNAは音響ディスペンサーを使ってカートリッジ基板に沈着します。セルとペイロードは自動液体処理機を使って準備され、カートリッジに装填されます。電気穿孔はDMFプラットフォーム上で行われます。細胞は96ウェルプレートにオフロードされ、インキュベーターに移されて回収されます。下流解析はフローサイトメトリー、顕微鏡、次世代シーケンシング、またはその他の適切な測定結果を用いて行われます。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2.ポリマー補給が堆積およびRNPアセンブリに与える影響。 (A)ポリマー補給は音響沈着の忠実度を向上させます。4つの独立したカートリッジでの沈着および再構成後のフルオレセイン吸収(ポリL-グルタミン酸の有無にかかわらず)を測定します。PGAの存在下で中間体積(40–120 nL)では分散が減少しました。
(B) PGAがCas9–sgRNAアセンブリに与える影響。PGAが存在する場合(左パネル)または有無(右パネル)における流体力学的半径(Rh)を測定するFIDA親和結合曲線。遊離sgRNAは0.26 nmで3.45±、Cas9滴定ではRNP複合体サイズが15.32 ± 0.46 nm(Kd = 0.70 ± 0.14 nM)となりました。PGAの添加は、濃度依存的に複体サイズを減少させ、結合親和性を弱めました。0.005 mg/mL PGAを加えると、遊離sgRNAのRhは4.31±0.07 nmとなり、Cas9滴定ではRNP複合体サイズは10.21±0.38 nm(K)となりました_d = 67.7 ± 9.5 nM)。実験は0.05%プルロン系F-68を用いた低導電率電気穿孔アッセイバッファーで実施されました。蛍光は統合LEDモジュールを用いて480 nmで検出されました。すべての実験には、恒久的に覆われた毛細管管(Ø 75 μm、L = 100 cm)が使用されました。ポリアニオンポリマーがRNPアセンブリに与える影響を検証するため、PGAを0.0025 mg/mLおよび0.005 mg/mL濃度のアッセイ混合物に加えました。これらの条件は、デジタルマイクロ流体、電気湿潤、電気孔隙バッファーで用いられる範囲をモデル化するために選ばれました。直接結合解析には、TRAC遺伝子座を標的とした10 nM FAM標識sgRNAを蛍光指示器として使用しました。Cas9ヌクレアーゼの濃度を増加させた(最大500 nM)を、CapMixアッセイで指示薬に対して滴定し、複雑生成のための分散プロファイルを作成しました。すべての実験は25°Cで行われ、各データポイントは40 nLのIndicatorと~12 μLの分析物(Cas9)を消費しました。実験は以下の順序で行われました:(1) 3,500 mbarで0.1%リン酸を30秒間フラッシュ;(2) 3,500 mbarでアッセイバッファーを用いて30秒フラッシュ;(3) 3,500 mbarで20秒間分析物を毛細管に充填;(4) 指示器を50 mbarで10秒噴射すること;(5) 400 mbarで分析物を動員し測定し、180秒間測定すること。流体力学的半径は、最大ピーク高さの半分あたりで抽出されたピーク幅と解離定数(K)を用いて計算されました_Dは非線形回帰を1:1の結合モデルに適合させることで決定されました。(C) PGAがRNP安定性に与える影響。PGA有無のCas9–sgRNA複合体のテイラー分散プロファイルを、500 nM Cas9ヌクレアーゼと50 nM FAMタグ付きsgRNAを用いて実施。PGAが存在しない場合、安定した複合体は観測されず、大きな集合体の形成が増加し、時間とともに複合体の信号が減少していることが示されています(左)。0.0025 mg/mL PGAを加えると、最小限の凝集でRの明確な単分散テイラーグラムが得られました_h ~ 9.6 nm (R² = 0.999、右)。複合体の安定性は、0.0025 mg/mLの有無にかかわらず標準的な電気穿孔条件下(500 nM Cas9 + 50 nM sgRNA)で評価されました。サンプルは事前に混合され、4°Cの温度でインレットサンプルトレイに保管され、注入は数時間にわたり10分間隔で行われました。実験は以下の順序で行われました:(1) 3,500 mbarで0.1%リン酸を30秒間フラッシュ;(2) 3,500 mbarでアッセイバッファーを用いて30秒フラッシュ;(3) 3,500 mbarで20秒間分析物(アッセイバッファー)を毛細管に充填;(4) 指示器を50 mbarで10秒噴射すること;(5) 400 mbarで分析物を動員し測定し、180秒間測定すること。不安定な複合体の形成は、大きな集合体(テイラーグラムのスパイク)の形成と信号の減少によって示されました。安定複体は、よくフィットした単分散テイラーグラム(R)によって同定されました² > 0.99)、およびR_h 適合プロファイルから値を抽出しました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3。一次ヒトT細胞におけるTCRアルファ/ベータノックアウトの効率と生存可能性。(A) 生シントレット、CD4⁺およびCD8⁺ T細胞サブセット、および対照(非標的sgRNA)および実験的(TRAC sgRNA)条件下におけるTCRα/β発現における代表的なフローサイトメトリーゲーティング戦略。細胞はFSC/SSC、シングレット、生存可能性、CD4⁺またはCD8⁺集団に対して逐次ゲートされ、その後TCRα/β表面発現の評価が行われました。 (B) 左:CD4⁺およびCD8⁺ TセルサブセットにおけるTCRα/βノックアウト効率、TRAC KO、非ターゲット制御(NTC)、オフカートリッジ制御(OCC)の3つの条件下で。CD4⁺:TRAC KO = 88.4 ± 4.9%(n = 40)、NTC = 3.2 ± 4.7%(n = 24)、OCC = 9.8 ± 5.1%(n = 18)。CD8⁺:TRAC KO = 89.8 ± 4.2%(n = 40)、NTC = 4.2 ± 7.4%(n = 24)、OCC = 20.2 ± 4.9%(n = 18)。右:すべての条件下での電気穿孔後の生存可能性、シングレットでゲートされています。生存可能性:TRAC KO = 97.1 ± 1%(n = 40)、NTC = 96.8 ± 1%(n = 24)、OCC = 97 ± 1%(n = 18)。個々のデータポイントは平均とSDで示されています。nは複数のカートリッジと日数にわたる独立した電気穿孔ランを表します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4。DMF抽出による効率的なmRNAをHEK293T球体に送達 すること。(A) 球状体形成および球状トランスフェクションの過程を記述したワークフロー図。1ウェルあたり100個のHEK293Tセルが特殊な球状マイクロプレートに装填され、24時間培養されて直径100μmの球状体が形成されます。球状体(192)はオフロードされ、100μLのトランスフェクションバッファに再懸濁されます。このサスペンションは適切なペイロードとともに、ファミリーあたり9.3μLの精度でガイドスピッテッドDMF発酵カートリッジに装填されます。電気穿孔が行われると、試料は96ウェルプレートにオフロードされ、下流解析が行われます。(B) 左:DMF発酵カートリッジ上でファミリーあたりのオフロード球体数と、手動ピペット式オフカートリッジ制御と比較して。中央:トライドロップの蛍光画像で、大きな赤い四角がトライドロップを輪郭に、赤い楕円形が球体の周囲を囲んでいます。右:装填された球体(青い円)を装填した装填ポートを示す蛍光画像。(C) 左パネル:電気穿孔前の完全なHEK293T球体の明視野画像および EGFP mRNA電気穿孔後24時間の球体の蛍光画像(0Vおよびオフカートリッジ対照群と比較して)。(D) トップパネル:2つの電気穿孔条件(500 V、2 ms、2 パルス、375 V、6 ms、1パルス)における球状面積に正規化された平均蛍光強度の定量化。電気ポトリッジ制御条件間に大きな差はありませんが、すべての電気孔化条件は0Vおよびオフカートリッジ制御(500 V 2 ms 2パルス:6.955 × ^10-5 ± 3.502 × ^10-5、375 V 6 ms 1 パルス:5.045 × ^10-5 ± 3.294 × ^10-5、0 V:0 ± 0、オフカートリッジ制御:0 ± 0(*p < 0.05)と大きく異なります。画像はFIJI画像処理パッケージ¹⁰で処理されました。(500 V、2 ms、2 パルス:n = 6;375 V、6 ms、1 パルス:n = 4;オフカートリッジ制御:n = 3;0 V 制御:n = 3)。(D) 底パネル:電気穿孔後の球体直径を5日間、あらゆる条件下で測定。直径は逆形顕微鏡で20倍倍率で撮影した位相圧縮画像からFIJIを用いて測定されました。(500 V、2 ms、2 パルス:n = 6;375 V、6 ms、1 パルス:n = 4;オフカートリッジ制御:n = 3;0 V 制御:n = 3)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

このプロトコルは、ナノリットルスケールの液滴を用いて一次ヒトT細胞への効率的な細胞内送達を可能にする小型化されたデジタルマイクロ流体電気穿孔ワークフローを説明しています。この方法の中心的な利点は、1回の反応でわずか10,000個の細胞でCRISPR–Cas9ゲノム編集を行うことができ、従来の電気穿孔に比べて材料の必要量を大幅に削減できることです。ドロップレットベースのアーキテクチャは自動化をサポートし、複数の並列サイト間での試薬取り扱いと反応組み立ての再現性を確保します。

過去の研究では、DMFエレクションプラットフォームを広く使われているシステムと直接ベンチマークした結果、従来のヌクレオフェクションは1回の編集で10,000個の細胞で2%未満のGFP陽性T細胞を産生し、DMFエクションプラットフォームは同じ低入力条件下で>90%のトランスフェクション効率を達成しました。192条件の配列スクリーンにおいて、DMFプラットフォームは従来の手法⁹に比べてセル数が25倍少なく、Cas9も約50倍少なく必要とされました。これらの比較は、低入力およびスクリーニング用途における小型化DMF電気孔孔の材料的利点を示しています

重要なステップとトラブルシューティング
成功にはいくつかの重要なステップがあります。音響液体ハンドラーの正確な校正により、カートリッジ基板上へのガイドRNAの正確な堆積が保証され、RNPの一貫した組み立てに不可欠です。スポッティングが不安定だったり、滴が基質に付着しない場合は、ガイドRNA混合物にPGAが適切な濃度(最終5 mg/mL)で含まれているか、音響ディスペンサーが特定のソースプレート形状に合わせて校正されているかを確認してください。中間体積(40–120 nL)での不均一な斑点は、最も一般的に疎水性表面の滴の反跳によって引き起こされます。PGA濃度をわずかに上げたり、ディスペンス高さを下げたりすることでこの問題を解決できます。

密度のずれは液滴形成を妨げ、編集効率を低下させるため、適切なセル濃度を維持することが重要です。編集効率が75%を下回った場合は、まずT細胞活性化が十分であることを確認し(電気穿孔前にフローサイトメトリーでCD25およびCD69のアップレギュレーションを確認し)、Cas9とsgRNAが事前ではなくロード直前に結合されたことを確認する。

ポリマー添加剤は、電気孔孔バッファー条件下でCas9–sgRNA複合体の安定化に重要な役割を果たし^ます。PGAは名目上の結合親和性を低下させますが、その安定化効果により再現性が向上し、ナノリットル単位での凝集を防ぎます。これは、他のタンパク質-RNA複合体にワークフローを適応させる研究者のための調整可能なパラメータを表します。

トラブルシューティング
液滴橋の失敗
各実験後に機器によるQC報告書を確認してください。電流が検出されない場合は、ドロップが不足しているか、融合不良によるブリッジ失敗を示し、システムによって自動的にフラグが立てられます。影響を受けたサイトは同じラン内で回復できません。故障が散発的(<10%)の場合は、対応は不要です。複数のカートリッジにレプリケートを分散させて影響を最小限に抑えます。故障が体系的な場合は、QCボードとシステムヘルスチェックを行い、問題が解決しない場合は技術サポートに連絡してください。

不安定なsgRNAスポット
ディスペンス後は、すべての予想される飛沫が存在し、電極境界内に集中し、衛星からの飛沫がないことを視覚的に確認します。多分散を防ぐために、ガイドRNA混合物にPGAを含みます。滴が抜けている場合は、ディスペンサーのランレポートを確認し、必要に応じて再配注してください。半月板形成が悪い場合は、1ウェルあたり最低5μLを維持し、プレートを短時間回転させ、平らな面を優しく叩きます。氷の上で作業し、使わないときは蒸発を防ぐためにプレートを密封してください。

編集効率の低下
編集効率の低下が確認された場合は、以下の順にトラブルシューティングを行います:(1) RNPを進める前に EGFP mRNAを用いた送達条件の検証;(2) 測定されたQC電流が期待値と一致するか確認;(3) 滴定細胞密度、ガイドRNA、Cas9濃度;(4) ロード直前に高い細胞生存率を確認すること;(5) 試薬の完全性と保管条件の検証;(6) 読み取り方法が対象の細胞密度およびターゲットに適切かどうかを確認する。

プラットフォームを代替セルタイプやモデルに適応させる
NK細胞や調節性T細胞など他の一次免疫細胞タイプでは、電気孔のパラメータの最適化が必要です。細胞サイズは膜透過に必要な電場閾値の重要な決定要因であり、小型細胞はより高い電界強度を必要とし、大型細胞は低い電圧で透過されます。これは電気穿孔生物物理学でよく知られた関係です。活性化されたCD3⁺ T細胞より小さい細胞タイプの出発点として、過剰な熱ストレスを避けるためにパルス持続時間を短く(2〜3 ms)に保ちつつ、電圧(500〜550 V)を維持またはわずかに増加させることが推奨されます。大型セルの場合は電圧を350〜400Vに下げ、パルス持続時間を10msを超えないように変調します。さらに、ドナーレベルでのマイクロ最適化は電気穿孔法において一般的な手法であり、健康なドナー細胞で検証されたパラメータが病変や患者由来の物質に直接適用されない場合があります。血液悪性腫瘍、慢性感染症、免疫不全を持つドナーの細胞は、しばしば生物物理的特性に変化を示すため、特に健康でないサンプルや臨床サンプルを扱う際には、編集効率と生存可能性を新たなドナーごとに再評価する必要があります。細胞生存率は電気穿孔後24時間および72時間後に評価し、パラメータを反復的に調整する必要があります。RNPの送達効率が低下した場合×Cas9の用量はT細胞プロトコルに比べて1.5〜2/4倍増やす必要があるかもしれません。

直径200μmを超えるオルガノイドのような大型または高密度の3Dモデルでは、カートリッジ内のガスケットが構造サイズや拡散バリアの増加に対応するために改造が必要になることがあります。このような応用を試みるユーザーは、試薬の浸透性を向上させるために外側セル層の事前解離を検討するか、複数のパルス条件を連続して適用することを検討すべきです。ここで検証された100μm球状径を超える構造に対する液滴形状やパルスパラメータの適応については、対応著者にお問い合わせください。

翻訳的関連性
このワークフローの翻訳的な可能性は、単なるノックアウトを超えています。このプラットフォームは、一次T細胞のTRAC遺伝子座における4 kb GFP構成体および機能的抗HER2 CARのホモロジー指向修復ノックイン、さらにCD4⁺ T細胞枯渇の新規調節因子を特定する45ターゲット配列CRISPRスクリーニングにも応用^{されています。}これらの応用は、臨床的に関連性の高い一次細胞モデルにおけるプロトコルレベルの最適化から機能発見への道筋を示しています。それでも重要な制約は残っています。シーケンシングによるアレル破壊率、サイトカイン分泌、 in vivo 移植などの機能的アウトカムは現行プロトコルでは評価されておらず、治療的翻訳に必要な次のステップを示しています。さらに、プラットフォームは1カートリッジあたり48回の並列反応をサポートしますが、より大きな画面では複数カートリッジ並列化が必要です。

制限
小型化プラットフォームと同様に、いくつかの実務的な制約を認識すべきです。下流の表現型は小さな反応スケールに適応させる必要があります。フローサイトメトリーの取得には、十分なイベント数を得るために追加の濃縮ステップや複製ウェルのプール化が必要になる場合があります。また、プラットフォームの電気孔化設定は電場に感度の高いセルタイプ向けに最適化が必要になる場合があり、ユーザーは公開されたパラメータを普遍的に固定された値ではなく出発点として扱うべきです。最後に、ここで提示した球状ワークフローでは、電気穿孔後の延長時間点での正式な生存性染色は行われていません。直径ベースの成長追跡は構造的完全性の代替指標として用いられ、今後の特性評価における重要な方向性を示しています。

全体として、DMFエクションは非ウイルス性トランスフェクション法であり、低入力かつ高スループットの環境下でのゲノム編集およびmRNA送達に強力かつ柔軟なアプローチを提供します。一次T細胞、構造化された3Dモデル、自動液体取り扱いとの互換性により、細胞療法工学、多条件CRISPRスクリーニング、ミニチュア化された機能ゲノミクスの分野での可能性が拡大します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	計測器
1x PBS	Gibco		フローバッファー
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	スフェロイドプロトコル
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	スフェロイドプロトコル
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		計測器
DMEM Media	Gibco	10564011	培養液サプリメント- スフェロイド培養
DMF compatible buffer	DropGenie		トランスフェクション
DropGenie Transfection System	DropGenie		計測器
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		フローバッファー
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		計測器
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	培養液サプリメント- スフェロイド培養
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		計測器
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		スフェロイドプロトコル
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	T 細胞培養液サプリメント
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		末梢血, 凍結保存済み, pan CD3+ ヘルパー T 細胞, ネガティブ選択
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	T 細胞活性化培養液
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	T 細胞活性化培養液
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		計測器
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	計測器
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	培養液サプリメント- スフェロイド培養
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	100mg/ml で使用
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		ソフトウェア
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	スフェロイドプロトコル
Surfactant F	DropGenie		トランスフェクション- DMF 互換バッファーと 1:20 で混合してトランスフェクションバッファーを完成させる
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	スフェロイドプロトコル