方法論記事

脂肪間隙血管分数における反射光を用いた老化検出

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DOI:

10.3791/70588

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2026年6月5日

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet, 2Nordiska Kliniken Stockholm

この記事について

サマリー

本プロトコルは、ヒト脂肪組織から分離された間質血管画分における老化関連ベータガラクトシダーゼ(SA-β-gal)活性を客観的に単細胞検出するために、反射光共焦点顕微鏡法を提示します。この方法は免疫細胞化学と互換性があり、定量評価のためのpHコントロールを組み込み、さらに従来のSA-β-gal染色よりも感度が高く主観的でない代替手段を提供します。

要約

細胞老化は、ストレスによる状態であり、細胞周期の永久停止と、組織機能に影響を与え、老化や代謝疾患に寄与する独特の分泌プロファイルの発達を特徴とします。老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)活性は、老化細胞のマーカーとして広く用いられています。しかし、従来のSA-β-galアッセイは主観的な視覚評価に依存し、定量的情報は限定的であることが多いです。これらの制限は、脂肪組織由来の基質血管分画(SVF)のような一次細胞集団で特に顕著であり、前脂肪細胞、免疫細胞、内皮細胞が不均一に混在しています。ここでは、ヒトSVF細胞におけるSA-β-gal活性を高分解能かつ定量的に検出するための最適化された反射光共焦点顕微鏡法を提案します。このプロトコルはSA-β-gal活性の客観的単一細胞解析を可能にし、追加の老化マーカーや系統マーカーの多重検出のための同時免疫細胞化学を可能にし、pHマッチ制御も組み込んでいます。これらの特徴を組み合わせることで、この方法は多様な一次細胞集団における細胞老化を高感度で再現性が高く、定量的に研究する手法を提供します。従来のSA βガル染色のより良い代替手段を提供します。

概要

細胞老化は、DNA損傷、テロメアの喪失、オンコ遺伝子の活性化など、さまざまな種類のストレスから生じる多面的な反応です。これは抗アポトーシスタンパク質の誘導によって部分的に促進され、細胞周期の安定した停止とアポトーシス耐性の増加をもたらします1,2。老化は、修復や維持など組織の完全性の維持が不可欠な状況において細胞生存率の向上と関連しています3,4。組織恒常性における役割に加え、老化は胚のパターン形成を促すことで正常な発生にも寄与します(5,6)、また損傷した細胞や潜在的に悪性細胞の除去を促進することで腫瘍形成の障壁としても機能します(7,8,9)。老化は有益な機能を持つこともありますが、複数の研究では、老化細胞が炎症促進分泌プロファイルを獲得し、局所代謝を乱し、周囲の組織を損傷し、さらには腫瘍の進行を支えるという対照的な側面が強調されています10,11,12,13。

老化は複数の組織にわたる多様な細胞タイプで検出されており、しばしば老化、病気、組織機能障害、がんと関連しています。肝臓では、肝星状細胞の老化が分泌因子を通じて代謝恒常性を変化させることで腫瘍の進行を促進することが示されています14,15。肝細胞16や全肝生検17を調査した研究では、これらの細胞の老化が代謝機能障害関連の脂肪性肝疾患や機能障害関連脂肪性肝炎などの代謝的併存症に寄与する可能性があることが示されています。さらに、2型糖尿病と老化の関係は過去10年間で大きな注目を集めており、膵臓β細胞、肝球16、脂肪細胞18、19、20、21の脂肪細胞の老化が糖尿病関連合併症と関連しているという証拠があります。これらの発見は、代謝組織における老化細胞の正確な同定の重要性を強調しています。これらの細胞の蓄積や異質性が疾患の進行や治療的標的化に寄与しているからです22。

老化に関連するシグナル伝達およびタンパク質発現の変化は、しばしば細胞や組織特異的であり、しかし、いくつかの特徴は老年細胞に広く特徴的です。最も広く使われているマーカーの一つは、pH6.0でのβ-ガラクトシダーゼの酵素活性の増加であり、これは老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)23と呼ばれます。β-ガラクトシダーゼはすべての細胞に存在するリソソームの加水分解酵素であり、通常は酸性pH(~4.5–5.0)で活性化し、糖基質の分解に寄与します。SA-β-galの特徴は、最適でないpH条件下でもβ-ガラクトシダーゼ活性が保持されることです。古典的なアッセイでは、細胞を合成基質5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X-gal)とpH6.0で培養します。この状態でほとんどの細胞で酵素活性が低下しますが、老化細胞では検出可能です。これにより、顕微鏡で可視化可能な不溶性の青色沈殿物が形成されます。

このアッセイは広く採用されていますが、Xガロン沈殿物の検出は従来明視野顕微鏡に依存してきました。明視野検出は青色沈殿物の視覚的識別に依存しているため、低レベル信号や初期老化状態に対する感度は限定的です。これに対し、反射光イメージングはXガロン析出物の光学密度を捉え、より広いダイナミックレンジにわたる定量的検出を可能にします。近年では、感度を向上させるためにフルオロ生成基質が開発されています。しかし、これらの手法は通常、古典的なpH依存のSA-β-ガルの定義を保持しない条件下でβ-ガラクトシダーゼ活性を測定します。その結果、信号強度は増加する一方で、老化の特異性は低下する可能性があります。対照的に、Xガル沈殿物の固有不透明性により、共焦点反射光イメージングによる検出が可能となり、SA-βガル26の元の酵素的定義を維持しつつ、より感度が高く定量的な読み取りが可能です。

年月を経て、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤P16およびP21の発現増加や、細胞周期停止やその他の老化プログラムを調節する転写因子P53の発現増加など、老化の特徴が確認されています(27,28,29,30,31,32,33.これらの進展により、老化の定義がより堅牢になり、細胞は通常複数のマーカーの複合的存在に基づいて分類されます。しかし実際には、これらのマーカーは異なるモダリティで測定されることが多いです。P16やP21のような核マーカーは通常蛍光ベースの技術で検出されるのに対し、SA-βガル活性は伝統的に明視野顕微鏡で評価されてきました。この分離により、同一細胞内で複数の老化特徴を評価する能力が制限されています。反射光イメージングは、SA-βガル検出と蛍光ベースのマーカーを単一のイメージングワークフロー内で直接統合することで、この制約を克服し、異質な細胞集団における老化のより堅牢で生物学的に意味のある評価を可能にします。

Dedicらは、感度の向上、客観的閾値測定のためのpHマッチコントロールの使用、免疫細胞化学との適合性など、従来のSA-βガルイメージングのいくつかの制約に対処していますが、彼らの反射光共焦点法は分離成熟脂肪細胞に特化して最適化されました。しかし、脂肪組織の老化は脂肪細胞に限らず、気質血管分数(SVF)を調べることでさらなる知見が得られます。SVFは前脂肪細胞、内皮細胞および線維芽細胞集団、多様な免疫細胞で構成されており、これらは老化し、脂肪の再形成、炎症、代謝シグナル伝達の変化に寄与する可能性があります。この異質な区画内での老化の特徴付けは、細胞型特異的プロセスと組織レベルおよび全身の結果を結びつける上で重要です。

ここでは、反射光SA-βガル検出をSVF細胞に拡張し、複数の脂肪組織細胞タイプに応用できるようにします。この手法と免疫細胞化学を組み合わせることで、一次ヒトサンプルにおけるSA-βガル活性と系統および機能マーカーの統合解析が可能になります。

プロトコル

すべての実験はヘルシンキ宣言の規定に従って実施されました。この調査はストックホルムの地域倫理委員会(DNR 2012/50-31)によって承認されました。

1. 細胞の調製

  1. ヒト脂肪組織からコラーゲナーゼ消化によって分離された間質血管分数(SVF)細胞を使用します。
    注:細胞収量は生検の大きさや組織組成によって異なります。しかし、脂肪組織10gあたり約1.0個×10個の6 SVFセルが通常得られます。

2. X-gal染色およびスライド準備

  1. 細胞を1 mLの2%パラホルムアルデヒド(PFA)に、室温(RT)でロッカーの上で20分間固定します。
  2. 600×gで遠心分離機で10分間加熱し、上清液を除去します。
  3. メーカーの指示に従い、老化βガラクトシダーゼ染色キットを使ってX-gal染色液を準備してください。
  4. 染色液を3本(各1mL)に分け、1M塩酸と1MナオーでpHを5、6、8に調整します。校正済みpHメーターを使ってpHを測定してください。
  5. 状態をつけるために0.5 × 106 細胞にXガロン溶液を加え、CO2なしで37°Cで24時間培養します。
  6. 600 × gで遠心分離機で10分間処理し、上清液を除去します。
  7. PBS(pH7)で細胞を洗浄し、600× gで遠心分離機で10分間、上清液を取り除きます。
  8. 一次抗体溶液(CD31[1:200]またはIgGコントロール[1:333])を5%正常なロバ血清(NDS)で調製します。細胞を4°Cで一晩培養します。
  9. ロッカーに乗ってPBST(0.1%)で3回、10分間RTで洗浄セルを行います。
  10. 二次抗体溶液(抗マウスAlexa Fluor 555[1:500])と小麦胚細胞凝集素(WGA [1:200])を5%NDSで準備します。ロッキングカーの上でRTで1時間キュベートします。
  11. 600× gで遠心分離機で10分間過ごし、二次抗体染色液を除去します。
  12. セルをPBST(0.1%)で3回、ロッカーで10分間洗い流します。
  13. 600×gで遠心分離機で10分間加熱し、上清液を除去します。
  14. アンチフェードマウントに細胞を再懸浮させてください。
  15. 細胞懸濁液を顕微鏡スライドにピペットで移します。
  16. 固定培地をRTで一晩硬化させて細胞を固定します。
  17. 100μLの100%グリセロールを加え、カバースリップをその上に敷き、マニキュアで密封します。

3. 顕微鏡

注:反射光検出用に設計された共焦点顕微鏡を用いた画像セル。反射光信号は、メーカー提供のビームスプリッターまたは二色性ミラー構成を用いて励起波長付近で収集すべきです。すべての実験では30×の対物レンズにシリコーンオイル(数値絞り1.05)を使いましょう。

  1. 顕微鏡ソフトウェア内でT90/R10ビームスプリッターの設定を選択します。
  2. 633 nmの励起を用いて、635〜645 nmの反射光を収集します。
  3. 405 nm励起でホエヒスト信号を取得。
  4. 488 nm励起でWGA信号を取得。
  5. 555 nm励起でCD31信号を取得。
  6. Zステップサイズをシステム最適(0.74μm)に設定し、膜信号に基づいてZスタックを定義して細胞体積全体を捉えます。
  7. すべてのサンプルに対して同一の取得設定で画像を取得します。圧縮せずにネイティブの顕微鏡形式(例:.oir)で保存ファイル。

4. 画像解析

注意:画像はImageJおよびCellProfilerを使用して解析してください。

  1. ImageJでチャネルを分割して各チャネルごとにZスタック(405、488、555、633)を生成する。
  2. Zプロジェクト関数を使って合計強度投影を作成し、16ビットTIFFファイルとしてエクスポートします。
  3. 画像をCellProfiler(バージョン4.2.8)にインポートすると、自動セルセグメンテーションとセルごとの反射光強度の定量化が行われます(補足図1 および 補足図2)。
  4. 強度測定値をスプレッドシートにエクスポートして後続解析します。

5. SA-β-galスコアリング

  1. SA-βガル陽性の閾値を、pH8条件の平均反射光強度に3標準偏差を加えたものと定義します。
  2. pH6条件で強度値がこの閾値を超える細胞はSA-β-ガロン陽性と分類します。

結果

ヒトSVF細胞の反射光SA-β-gal染色は、3つのpH制御条件下で明確かつ再現性の高いパターンを生み出しました。CD31染色はSVF内の内皮細胞を識別するために含まれ、これらの細胞を他の集団と区別できるようにしました。CD31陽性細胞は少数しか存在しませんでしたが、マーカーは内皮細胞の存在を確認し、異質な一次サンプルとの適合性を示しました。

pH5条件はほとんどの細胞で強い信号を発生させ、酸性pH下での高い内因性ベータガラクトシダーゼ活性と一致しました(図1Aa–Ac)。pH6ではSA-βガル活性を評価する条件で染色強度がpH5より低下し、背景よりも信号を示した細胞の一部のみが示されました(図1Ba–bc)。この信号強度と頻度の変化は、アッセイの期待されるpH依存性と一致し、最適でない条件下でもSA-β-ガラクトシダーゼ活性が保持されている細胞の同定を可能にします。pH8条件では反射光信号は最小限で、ほとんどの細胞は背景レベル付近または近くにありました(図1Ca–Cc)。この条件は、図1Aの赤い点線で示されるSA-βガル陽性の閾値を定義するために用いられました。

定量解析において、SA-βガル活性の閾値はpH8条件の平均反射光強度に3標準偏差を加えたものとして定義されました。pH6の状態で強度値がこの閾値を超える細胞はSA-β-ガロン陽性と分類されました。このアプローチは、背景信号を考慮し、誤検知の分類を最小限に抑える客観的でデータ駆動型のカットオフを提供します。

検出感度と免疫細胞化学との適合性を評価するために、反射光と明視野イメージングをすべてのpH条件下で比較しました。pH 5(図2Aa–Ad)では反射光により強いXガロン沈殿が見られ、明視野では最も目立つ堆積物のみを検出しました。pH 6(図2Ba–Bd)では、反射光により明視野では検出できないSA-βガル陽性細胞が識別され、信号が弱く拡散しているように見えました。pH8(図2Ca–Cd)では反射光は最小限の信号を検出し、酵素活性が低いことと一致しましたが、明視野では検出可能な沈殿物は検出できませんでした。これらの観測は、反射光イメージングが特に中低活性レベルでのXガル沈殿物の検出を向上させていることを示しています。

反射光によるSA-βガルアッセイも96ウェルプレートで実施されました(補足図3)。この構成により、プラスチック表面からの反射により背景信号が増加し、正負セル間のコントラストが低下しました。表面の欠陥、例えば傷が背景反射をさらに強めました(補足図3、黒い矢印)。その結果、定量分析はガラスカバースリップでの画像化に比べて信頼性が低かった。プレート形式が必要な場合は、最適な信号検出のためにガラス底プレートが推奨されます。

これらの結果は、強く正のpH5条件、pH6の中間信号、pH8の最小背景との間に明確な分離があることを示しています。このパターンはアッセイの期待される挙動と一致し、異質な一次細胞集団におけるSA-βガル活性検出に反射光イメージングを用いることを支持しています。

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図1:SVFセルにおけるpH依存反射光SA-β-ガル検出。
WGA(Aa、Ba、Ca)および反射光イメージング(Ab、Bb、Cb)は、pH 5、6、8の条件下でXガル沈殿を検出します。信号はpH5で最も強く、pH6で弱まり、pH8で最小限に抑えられます。反射光強度(Ac、Bc、Cc)の定量化は、各条件下でのβ-ガラクトシダーゼ活性の分布を示します。各点は1つの細胞を表し、赤い点線はSA-β-ガル陽性細胞の分類に用いられる閾値を示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図2:SVFセルにおける反射光と明視野SA-βガル検出の比較。 pH 5、6、8のX-gal染色SVF細胞のズーム画像では、WGA染色(Aa、Ba、Ca)、CD31染色(Ab、Bb、Cb)による内皮細胞の同定、反射光イメージング(Ac、Bc、Cc)によるXガル沈殿検出、対応する明視野画像(Ad、Bd、Cd)が示されています。反射光イメージングは各条件下でXガロン沈殿を検出しますが、ブライトフィールドは主に高強度の堆積物を明らかにし、低信号レベルでは限定的な検出にとどまります。CD31染色はpH 5およびpH 6の両方の条件下で観察され、内皮細胞の同定を可能にします。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足図1:CellProfilerパイプラインの概要。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図2:核および細胞の分割のワークフロー。 (A) ホエスト染色核および (B) 対応する核の断片の代表画像。(C)膜染色に基づく細胞分断。(D) 核および細胞境界の重ね合わせ。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図3:プラスチック底96ウェルプレートにおける反射光SA-βガル画像。 (A) 標準的なプラスチック底96ウェルプレート上のXガル染色SVFセルのWGA染色および(B) 反射光イメージング。背景信号がガラスの画像に比べて増加し、これはプラスチック表面からの光反射によるもので、SA βガル検出のコントラストが低下していることと一致します。表面の擦り傷(黒い矢印)はさらに背景信号(B)を強めます。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

老化関連β-ガラクトシダーゼは、老化細胞の識別に最も広く使われているマーカーの一つです。しかし、従来の明視野検出方法は感度が低く主観性が高いため制約があります。Xガロン染色されたSVF細胞の反射光イメージングは、蛍光抗体染色と互換性を保ちつつ、単一細胞レベルでSA-βガル活性を測定するより感度が高く再現性の高いアプローチを提供します。この手法をSVFに最適化することで、SA-β-gal活性をCD31などの細胞特異的マーカーと併用して検出でき、細胞選別を必要とせずに異質な一次細胞集団の解析が可能になります。

信頼性の高い実装にはいくつかの技術的パラメータが不可欠です。Xガロン染色溶液の正確なpH校正は不可欠であり、わずかな偏差が酵素活性を変化させ、信号検出に影響を与える可能性があります。pHメーターは標準バッファー(例:pH 4.0およびpH 7.0)で使用する直前に校正し、染色溶液のpHは調製後に確認されるべきです。さらに、Zスタック取得はセル全体の体積を捉えなければならず、不完全なカバレッジは反射光の強度を過小評価してしまうためです。レーザー出力や検出器利得を含むイメージングパラメータは、飽和せずに信号を最大化し、サンプル間で一貫性を保つよう最適化されるべきです。

代替的な老化アッセイと比較して、反射光イメージングはいくつかの利点を提供します。ブライトフィールドSA-βガル検出は沈殿物の目視識別に依存しているため感度が限られ、多重解析とは容易に互換性がありません。これに対し、反射光イメージングはXガル析出物の光学密度を検出しつつ、pH依存的な酵素的定義であるSA-βガルを保持します。これにより、蛍光ベースのマーカーと同時にSA-β-gal活性を検出でき、個々の細胞内の複数の特徴を用いて老化を評価することが可能になります。

これらの利点がある一方で、この方法には限界もあります。反射光イメージングはXガロン析出物の光学密度を検出しますが、他の高密度細胞内構造と明確に区別できないため、pH制御条件が不可欠です。pH 8条件は背景反射光の基準値を提供し、特定信号と非特異的信号の識別を支援します。また、適切な反射光検出機能を備えた共焦点顕微鏡も必要であり、すべてのシステムで利用可能なとは限りません。さらに、イメージング表面の特性も信号品質に影響を与えることがあります。プラスチック底板は反射による背景を増やしコントラストを下げるのに対し、ガラス表面はより信頼性の高い検出を提供します。

この方法は、成熟脂肪細胞におけるSA-β-gal検出のための反射光イメージングを確立したDedicらの研究を基盤とし、より広範な細胞タイプ26にアプローチを拡張しています。新たに分離されたSVFへの適用により、Xガロン沈殿物の反射光検出が多様な一次細胞集団と両立していることが示されました。SA-β-gal検出とCD31のような系統マーカーを組み合わせることで、異質な組織内の定義されたサブポピュレーションの解析がさらに可能になります。

一次ヒトサンプルではドナー間の変動が予想されますが、本研究の目的は生物学的変動性の特性評価ではなく、手法の技術的実装を確立することにあります。複数の生物サンプルや実験条件にまたがる将来の応用には、適切な統計解析を組み込むべきです。さらに、確立された老化誘導モデルでの検証や直交老化マーカーとの統合により、複雑な細胞集団におけるSA-β-gal活性の解釈がさらに洗練されます。

開示事項

著者たちは利益相反を一切認めていない。

謝辞

ヒト組織生検へのアクセスを提供してくれたリヴ・エイズモ氏とキーラ・メリカン氏、サンプル処理の支援をいただいたレナ・アペルスヴェッド氏に感謝いたします。本研究は、スウェーデン研究評議会(2022-01236)、カロリンスカ研究所糖尿病戦略研究プログラム(C5471162)、ノヴォ・ノルディスク財団(C5475033)、ヴァレー財団奨学金(C5471234)、マーク財団アスパイア助成金(C5477023)、スウェーデンがん協会(22 2420)、カロリンスカ研究所の幹細胞・再生戦略研究プログラム(C5472022)、クヌート&アリス・ヴァレンベルク財団(2020.0118;2023.0536)からの助成金によってKLSに支援されました。

材料

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この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mLチューブBioSphere72.706.200Biosphere safeseal tube 1.5 mL, 250 PC
5 mLチューブEppendorf30119401Eppendorf tubes 5.0 mL microtube
96ウェルプレートCorning4680Corning 96-well high content ccreening microplates with film bottom
CD31一次抗体AbcamAb9498Anti-CD31 antibody clone JC/70A
反射光機能付き共焦点顕微鏡EvidentFV-4000
カバースライドEprediaBB02400500A113MNZOカバースライド 24 mm x 50 mm, #1.5 厚さ (0.13-0.16 mm) 
DPBSGibco14190-136DPBS, no calcium, no magnesium
固定バッファーSigma Aldrich1.00496.5000Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 
HClSigma-Aldrich320331-500mLHydrochloric acid (37%)
インキュベーターStuartS130HHybridization oven/shaker
顕微鏡スライドAvantor VWR631-1560Single-frosted slides, coloured ends
マウントメディアInvitrogenP36984ProLong glass antifade mountant excitation/emission max 361/497 nm
Mouse IgG1 isotype controlR&D SystemsMAB002
NaOHSigma-AldrichS8045-500GSodium hydroxide ≥ 98%
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch Labs017-000-121
pHメーターMeterLabR21M002 PHM210 standard pH meter 
ピペットチップ (1000 µL)Biosphere70.1186.2101250µL filtered pipette tips
ピペットチップ (200 µL)Corning4823200µL filtered pipette tips
SABGキットCell signaling9860SSenescence beta-galactosidase staining kit
二次抗体, Alexa Fluor 555InvitrogenA31570Donkey anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed excitation/emission max
553/568 nm
Tween-20Fisher Scientific10419000Pure, Fisher chemical
水浴Rowe ScientificSWB20DStandard water bath
WGAInvitrogenW11261Wheat Germ Agglutinin (WGA) Alexa Fluor 488 conjugate: Excitation/emission max 495/519 nm
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参考文献

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