穀物における植物と微生物の相互作用研究のための植物グノトバイオティック成長システムの組み立てと利用

サマリー

このプロトコルは、穀物を収容するために設計された新しい植物のグノトバイオティック成長システムの組み立てと使用を説明し、小麦とトウモロコシで検証されています。この植物のグノトバイオティクスシステムは、無菌の成長条件、灌漑管理、多様な土壌基質との適合性を提供することで、制御された植物・微生物実験を可能にします。

要約

現場で一貫して効果を発揮する微生物ベースの農業改良剤の開発には、植物と微生物の相互作用の分子メカニズムの理解が必要です。これらの基礎的な相互作用メカニズムを研究するには、環境制御されたグノトバイオティック条件下で植物を育てる能力が必要です(すなわち、植物と相互作用するすべての微生物が知られている状態であり、それが無菌、定義された微生物群集、または自然群集であれ)。現在利用可能な植物グノトバイオティクスシステムは、穀物のような農業に重要な大型植物の研究には適していません。さらに、これらのシステムの多くは灌漑管理能力を欠いています。ここでは、灌漑管理能力を持つ穀物植物に対応するために設計された新しいグノトバイオティックシステム、GNOVAを紹介します。この新しいシステムは、3Dプリントされたベースと市販の素材で構成されたアクセス可能なプラットフォームです。このプロトコルは、システムの組み立てと実験のセットアップに関するステップバイステップのガイドを提供します。さらに、GNOVAとグノトバイオティックバッグシステムのパフォーマンス比較も示します。GNOVAは、小麦の2週間、トウモロコシの4週間に植物の成長を2週間から最大延長しました。両作物の発芽率もGNOVA内で小麦の66%から100%、トウモロコシの75%から100%に増加しました。GNOVA内で栽培された小麦は、袋式システム内の同年代の植物には存在しない分蘫を発達させました。GNOVAで栽培されたトウモロコシの新鮮な重量は、袋式システムよりも594%高かった。さらに、トウモロコシの芽高と根長は、それぞれGNOVAシステム内で袋中より89%と57%長く見られました。GNOVAシステムは、成長空間の増加と灌漑管理を提供することで、穀物の苗木期を超えた植物と微生物叢の相互作用を探求するための科学者向けのツールボックスを拡張します。

概要

微生物ベースの農業処理は、植物の成長や環境ストレスへの耐性を高めることで作物の生産性を向上させる可能性から、ここ数十年で大きな関心を集めています。同時に、これらのバイオスティミュラントの分子メカニズムは依然として十分に解明されておらず、土壌、場所、^{環境条件間}で結果が一貫しない原因となる可能性があります^1,2。既存の微生物ベースの治療の有効性向上と新技術の開発を促進するには、植物と微生物の相互作用の分子メカニズムをより深く理解する必要があります。^3,4。しかし、これらのメカニズムの解明は、自然微生物群集の複雑さから依然として困難^です。植物の利益を促す微生物の効果因子や相互作用を特定するために、環境条件や微生物群集を制御できる合成微生物群集(SynComs)を成長システム内に用いることで、自然系の複雑さを軽減できます。Gnotobiology(定義された微生物群集に関連する宿主の^研究)7では、研究者が無菌宿主と既知の微生物群集に定着した宿主を比較し、微生物機能と植物表現型⁸を結びつけることを可能にします。

初期のグノトバイオティクスシステムは、ガラス試験管^{9、10、11、12}および瓶¹³を用いて構築されました。それ以来、植物をグノトバイオティクス的に研究するための新しいシステムが急速に発展しています。現在最も一般的に用いられているシステムは、ペトリ皿¹⁴、試験管^15、16、ガラス瓶¹⁷、マゼンタボックス¹⁸、密封袋¹⁹、水耕栽培²⁰、FlowPotおよびGnotoPot21、マイクロ流体システム²²、EcoFAB23の使用です。この進歩にもかかわらず、ほとんどのシステムはイメージング²²や滲出物収集^17,20に最適化されているか、小型モデル種14,18,21向けに設計されています。多くは灌漑制御や実験期間を制限する閉鎖システムです。これらの制約は、穀物のような大規模な農作物の研究においても課題となります。穀物は追加のスペース、通気、水管理を必要とします。

より大きな植物や長期研究を受け入れられるシステムの必要性を認識し、EcoFAB 3.0は最近開発され、より大きな植物へのグノトバイオティック栽培を拡大^{しました。}EcoFAB 3.0は根とヘッドスペースのボリュームを大きくし、ソル ガムバイカラー の成長を最大4週間支援し、²⁴歳の滲出液の収集や根の画像撮影を可能にします。この新しいシステムは農作物へのグノトバイオティックシステムを拡張する有望な例ですが、実験室間で容易に採用でき、幅広い実験ワークフローに対応したアクセスしやすく多用途なプラットフォームの必要性は依然として残っています。このため、私たちはGNOVA(多目的植物応用のためのGNotobiotic system)を開発しました。これは、グノトバイオティック条件下で穀物作物を扱うためのシステムです。ここでは、GNOVAの組み立てと運用に関する詳細なプロトコルを提供し、当研究所で日常的に使用されているグノトバイオティックバッグシステムと比較してその性能を示します。この新しいシステムの開発により、従来の閉鎖システムに比べてより広い栽培スペースと内蔵灌漑を提供することで、無菌条件下での小麦やトウモロコシの栽培能力が向上しました。GNOVAの性能はEcoFAB 3.0と同等であり、非モデル穀物作物における植物とマイクロバイオームの相互作用を解剖するためのツールのレパートリーを拡大します。さらに、GNOVAのシンプルな設計、市販材料の使用、そして研究者が研究や予算のニーズに合わせて材料や設計を変更することを可能にする3Dオブジェクトファイルによって、植物グノトバイオティクスの多様性と適応性がさらに高められています。

プロトコル

注:基地の3Dプリントファイルは補助資料に記載されており、Dryad(https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc)で一般公開されています。スピードとコスト効率のために、地元の商業用3Dプリントサービスプロバイダーでの大量印刷をお勧めします。

1. グノトバイオティックシステムの組み立て

1. ポット組み立てを開始します(繰り返し実験使用前に一度行ってください)。
   1. 鍋底を閉じるには、ステンレススチールワイヤーメッシュの円をポリカーボネート管の一端にかけ、ホースクランプで円を固定します(図1A)。
   2. ポリカーボネートチューブの開口部の上端から1.5cm離れた場所に1/4インチ(6.35mm)の灌漑口を掘り開けて掘削します。最初の開口部から3cm離れた場所に1/8インチ(3.18mm)のスロットを2つ開け、1つは端から1cm、もう1つは上部スロットから2cmの位置に開けます。
      注意:必要に応じて、同じ手順で鉢の上端に追加のチューブラインを追加することもできます。
   3. 灌漑用チューブは、1/4インチの開口部から短いシリコンチューブを挿入して設置します。
   4. パイプを2つの1/8インチスロットに通して固定します(図1B)。1番のオスルアーをポットの外側に伸びるシリコンチューブに挿入します(図1C)。
      注意:フィッティング1のホースバーブは露出しているべきです。
   5. シリンジの樽を準備するには、空のシリンジ樽にガラスウールを入れ、端を小さなアルミホイルで閉じてしまいます(図1C)。
   6. シリンジバレルのルアーロック端に短いシリコンチューブを取り付けます(図1C)。
   7. 同じ注射器の樽を2つ用意します。準備済みの注射器のバレルを、ポットから伸びたチューブのフィッティング1の露出したホースバーブに取り付けます(図1D参照)。
   8. 一時停止:組み立てられた壺は後で実験的に使うために保管できます。

図1:ポットの組み立て。A) ワイヤーメッシュとホースクランプで閉じたポットの底。(B)鉢の上端にある灌漑用ポート。(C) 灌漑ラインは、準備済みの注射器バレルを持つフィッティング1の露出ホースバーブで終点。(D) 閉じた灌漑管を持つ組み立て済みポット この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

2. 実験のための鍋の準備(新しい実験の前に行う)
   1. 鉢の底には、あらかじめカットされたガラス繊維のパイプ巻きを2枚敷きます(図2A)。
   2. 土質は粘土2份と砂1份を混ぜて準備します。鉢に基質840mLを加えます。
   3. 鉢はプラスチックキャップで覆い、テープで固定します(図2B)。
   4. オートクレーブで121°Cの乾燥サイクルで30分間鍋を充填します。鉢にはプラスチックキャップをつけて一晩冷ます。121°Cのドライサイクルで30分間再オートクレーブします。完全に冷ませます。鍋はプラスチックキャップで覆い続けてください。
      注意:他の土質も使用できますが、鉢ごとの必要な量は事前に最適化する必要があります。GNOVAは100%粘土800mLと100%砂1Lでも試験されています。他の土壌基質は、完全な滅菌のためにより多くのオートクレーブサイクルや異なる設定が必要になることがあります。
      注意:オートクレーブからポットを取り出す際は注意が必要です。素材が熱くなっており、ホースクランプが緩む可能性があります。冷やした後、ホースクランプが指で締められているか確認してからポットを持ち上げてください。
   5. 冷却されたポットを3Dプリントの台座に挿入します。土を詰めた鉢を3Dプリントの台座の中に置きます。壺は開口部の柱ではなく、底を掴んでください。柱は最も壊れやすい部分です。
   6. 灌漑用チューブを3Dプリント台座の下部開口部の一つに通します(図2C)。
      注意:3Dプリントの支持台面をオートクレーブ処理しないでください。これにより作品が溶ける可能性があります。60°Cを超える温度を必要とする実験では、耐熱性のあるフィラメントの代替が必要になる場合があります(材料 表参照)。
   7. オートクレーブ後は鍋を室温に保ち、最終的な実験セットアップまでプラスチックキャップや準備された注射器を外さないでください。

図2:準備済みの鉢の図。(A)グラスファイバーパイプラップで覆われた鉢の底。(B)鍋の蓋をプラスチックキャップで閉じる。(C) 空のポットが最終的な3Dプリントベースデザインの中に収まる。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

3. ガラスシリンダーの準備(新しい実験の前に行う)
   1. ガラスシリンダーの一端をあらかじめカットされたDW4フィルターで覆い、ビニールテープで固定します(図3A)。
   2. ガラスのシリンダーを反対側の開口部に向けるように向き、チューブの端から14cm離れた場所に綿のリングを取り付けます。綿のリングは手術用テープで固定します(図3B)。
   3. シリンダーの下端を2本のゴムバンドで滅菌ラップで閉じます(図3B)。
   4. 使用前に121°Cの乾燥サイクルで30分間、準備済みのガラスシリンダーをオートクレーブ処理します。オートクレーブ後は、巻帯を外さずに必要な時まで室温で保管します。

図3:ガラスシリンダーの組み立て。(A) DW4フィルターメディアとビニールテープで閉じたガラスシリンダーの上部。(B) ガラスシリンダーの下端に綿のリングを装着し、滅菌ラップとゴムバンドで閉じています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

4. 灌漑フィルターの準備(各給水イベントの前に実施し、ステップ1.4.4〜1.4.6は一度だけ行うべきです)
   1. PESフィルター膜(図4A.4)をフィルターホルダー(図4A.5)とフィルターディスク(図4A.3)の間に配置してフィルターホルダーを組み立てます。
   2. フィルター膜の滑らかな面を流出方向に向け、フィルターホルダーの上部に向かっているようにしてください(図4A.1)。
   3. Oリング(図4A.2)をフィルターホルダートップ(図4A.1)に挿入します。フィルタートップをフィルターホルダーに取り付けます。手で締めるだけです。
   4. コネクターを取り付けてください。フィッティング2のオススリップをフィルターホルダーの上部ポートに差し込みます。
   5. フィルターのホースバーブエンドに短いシリコンチューブを取り付けます(図4B)。ステップ1.1.6(図4B)で準備された他の注射器バレルの端に、フィッティング1のオスルアーを挿入します。
   6. フィルターを準備済みの注射器バレルのホースバーブフィッティングに接続します。
   7. 組み立て済みフィルターを121°Cのドライサイクルで30分間オートクレーブ処理します。フィルターは冷えた後、使用前に締め付けてください。
      注意:必要なフィルターはすべて準備し、密閉されたポリプロピレン箱内でオートクレーブ処理することが推奨されます。オートクレーブ後は、準備された注射器を取り除かない限り、室温で滅菌状態を保つことができます。

図4:フィルターホルダーアセンブリ。(A) 分解済みフィルターホルダー部品:1. フィルターホルダートップ、2. Oリング、3. フィルターディスク、4. フィルター膜、5. フィルターホルダー。(B) 組み立て済みのフィルターホルダーと対応する準備済みの注射器バレル。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

2. 実験のセットアップ

1. 実験設置の少なくとも1日前に溶液と材料を準備し滅菌してください。
   1. 製造者の指示に従って、0.5倍のムラシゲとスクーグの植物育成培地を準備してください。オートクレーブ培地を液体サイクルで121°Cで30分間使用します。
   2. 分解したボトルトップディスペンサーを121°Cのドライサイクルで30分間オートクレーブ処理します。121°Cの液体サイクルで1リットルの脱イオン水をオートクレーブし、30分間使います。
   3. オートクレーブガラスペトリ皿、500mLのビーカー、ティーストレーナー、ピンセットを121°Cのドライサイクルで1日30分前に用意してください。
      注意:特に記載がない限り、以下の手順は無菌技術を用いて層流フード内で実施されるべきです。
2. 種は表面滅菌。
   注意:表面種子の滅菌プロトコルは使用する植物の種類によって異なります。このグノトバイオティクスシステムは、以下の種子滅菌プロトコルを用いて小麦とトウウモロコシの両方で試験されています。
   注意:漂白剤や次亜塩素酸塩を扱う際は、白衣、手袋、保護用の眼鏡を着用してください。これらの化学物質は皮膚や目に刺激や腐食作用がある可能性があります。エタノールは可燃性であり、近火は使わないでください。
   1. 小麦種子の不妊処理²⁵
      1. 95% v/vエタノール150mLのビーカー、150mLの希釈されていない家庭用漂白剤を1つ、そして150mLの水を2つのビーカーに注ぎます。
      2. 小麦の種を茶こし器に入れます。種入りのティーストレーナーを95%のV/Vエタノールでビーカーに浸して1分間優しくかき混ぜます。
      3. 種を新しいティーストレーナーに移してください。漂白剤に入った種を混ぜた茶用ストレーナーを10分間優しくかき混ぜます。
      4. 種を新しいティーストレーナーに移してください。もう一方のビーカーの種入りティーストレーナーを95%のV/Vエタノールで優しくかき混ぜます。
      5. 種子を混ぜた茶用ストレーナーを滅菌の脱イオン水に優しく30秒かき混ぜます。もう一方のビーカーの種入りティーストレーナーを、滅菌の脱イオン水で2分間優しくかき混ぜます。無菌種子を空の無菌ペトリ皿に入れます。
   2. トウモロコシ種子の滅菌²⁶
      1. トウモロコシの種を50mLの円錐形チューブに入れます。円錐形のチューブに70%のV/Vエタノールを充填します。円錐形の管を優しく逆さに3分間入れます。
      2. 70%エタノールをデカントし、2%のv/v次亜塩素酸ナトリウムを入った種子を円錐形の管に充填します。円錐形の管を優しく逆さに3分間入れます。
      3. 次亜塩素酸ナトリウム2%をデカントし、種子を滅菌の脱イオン水ですすいでください。水を抜き、種を水で4回洗い流します。トウモロコシの種を無菌のペトリ皿に入れます。
3. 該当する場合は培地に微生物接種物を加えます。
   注:グノトバイオティクスシステムの最適化および滅菌性試験では微生物接種は行われませんでした。
4. ボトルトップディスペンサーを組み立ててメディアボトルに取り付けます。
   注意:このシステムはオープンシステムであるため、流媒体を回収するための容器を用意することを推奨します。ベーキングトレイを使うと動きやすく、頻繁に空にする必要があることがわかりました。
5. プラスチックキャップをポットから外し、培地378mLをポットに注ぎます。
   注意:これは約70%の水で満たされた孔隙間隙(WFPS)に相当し、他の土壌基質を使用する場合は調整する必要があります。粘土には360mL、砂には358mLを使いましょう。
   1. 滅菌した種を無菌ピンセットで適切な深さまでまきます。
   2. 小麦は1/2インチの深さで、トウモロコシは1インチの深さで播種します。あるいは、不妊の発芽前苗をGNOVAにまく方法もあります。発芽前の種子をトウモロコシの成長検査に使用してください。
   3. 鉢の上のプラスチックキャップを交換してください。

3. 最終組立および実験運転

1. 鉢とガラスのシリンダーを成長室に移します。ガラスの円筒は底を下に向けて鍋の近くに持つ。
2. 鍋のプラスチックキャップとガラスシリンダーの消毒ラップを素早く外してください。ガラスのシリンダーを上に下ろし、3Dプリントの台座の縁に座らせます。
   注意:成長システムの最終組み立て時に、火炎(例:ポータブル・ブンゼンバーナー)を鉢の隣に置くことで、汚染リスクをさらに低減できます。
   注意:火をつける際は、周囲に他の可燃物がないか必ず確認してください。火傷を防ぐために、炎の位置を体に対して注意してください。
3. 植物種によって4週から17週の間に、種ごとの成長条件を用いて育ててください。
4. 小麦は昼夜の22°C/16°Cで育て、トウモロコシは27°C/23°Cで育てます。 両植物の蛍光灯の下では12時間の光周期です。

4. 灌漑

1. ボトルトップディスペンサーに長いシリコンチューブを取り付けます。
2. 水やり時は携帯用炎を使って無菌性を保ちましょう。ポータブル炎が使えない場合は、漂白剤を使って無菌性を保つ灌漑を行いましょう。
3. 携帯炎を使った灌漑。
   注意:身体的な怪我や施設の損傷を防ぐため、露火の近くで注意して作業してください。
   1. 灌漑管の近くに炎を置いてください。灌漑管とフィルターホルダーから注射器のバレルを外してください。すべてのチューブの端を炎のゾーン内に保ちましょう。
   2. フィルターホルダーを灌漑管に接続してください。2つの注射器のバレルをつなげてください。ボトル上部ディスペンサーのもう一つの長いシリコンチューブをフィルターホルダーの下部ポートに接続します。
   3. 0.5倍のムラシゲおよびスクーグ培地を150mL投与します。2つの注射器の銃身を分けてください。
   4. フィルターホルダーからシリコンチューブを外して、シリンジのバレルを1本に交換してください。
4. 10%漂白剤を用いた灌漑
   注:この灌漑戦略は、大規模な実験(n>50)で水やり時の処理量を増やすことを推奨します。
   注意:漂白剤を扱う際は白衣、手袋、保護用の眼鏡を着用してください。
   1. 10%のv/v漂白剤溶液を2つの小さなプラスチックビーカーに注ぎ、灌漑管の近くに置きます。灌漑管とフィルターホルダーから注射器のバレルを外してください。
   2. 必要なら10%漂白剤溶液にすべてのチューブの端を浸してください。余分な漂白剤を振り落とします。フィルターホルダーを鉢の灌漑ラインに接続します。
   3. ボトルトップディスペンサーのもう一つの長いシリコンチューブをフィルターホルダーの下部ポートに接続します。
   4. 0.5倍のムラシゲおよびスクーグ培地を150mL投与します。フィルターホルダーからシリコンチューブを外してください。
      注:灌漑用量は砂で120 mL、粘土で360 mLです。
   5. 余分な漂白剤を振り落とした後、灌漑管のフィルターをシリンジバレルに交換してください。
      注意:灌漑量が変化した場合、灌漑ラインのプライミング用に約20mLの培地を考慮してください。
5. 鉢には週に一度灌漑してください。実験目的や使用する土壌基質に応じて灌漑量と頻度を調整してください。100%砂を使う場合は、灌漑頻度を週2回に増やしてください。

5. 収穫

注:この収穫プロトコルは、グノトバイオティクスシステムのテストおよび最適化の際に遵守されました。採取プロトコルは、特定の研究目標や処理されるサンプル量に合わせて修正されるべきです。

1. 収穫の少なくとも1日前には、すべての溶液や材料を準備し滅菌してください。
   1. オートクレーブ4Lの脱イオン水と0.145 M NaClの500mLを、121°Cの液体サイクルで30分前から投与します。
   2. オートクレーブはさみとピンセットを121°Cのドライサイクルで1日30分前に使用します。
      注意:特に記載がない限り、以下の手順は無菌技術を用いて層流フード内で実施されるべきです。無菌が不要なサンプル採取であれば、これらの工程は層流フードの外でも実施可能です。
2. グノトバイオティクスシステムを成長チャンバーからラボに移し、層流フードの近くに設置します。
3. ガラスのシリンダーをポットから外し、素早くポットをラミナーフローフードに入れます。3Dプリントの台座から鉢を取り出します。
4. 植物を根元に置き、土質を容器に捨てます。根から大きな土の塊を優しく振り落とします。
   注:土壌基質サンプルは、収穫のこの段階で特定の研究目標に応じて採取・処理されます。ここで簡単に説明したプロトコルは、土壌の無菌性を試験するために用いられました。
5. 土壌の細菌採取:^単 一プレートによる連続希釈スポッティング²⁸。
   1. 96ウェルプレートのウェルに0.145 M NaClの270 μLを充填します。一番一列は空けておけ。土壌基質1gを、0.145 M NaClの9 mLを含む15 mLの円錐形チューブに加えます。
   2. ボルテックスは最大速度で5分間。30μLのサンプルを96ウェルプレートの空井に移します。
   3. 各サンプルを7回連続希釈し、各サンプル30μLをピペットで下のウェルに270μLのNaCl溶液を投入して準備します。
   4. 各移動の間、ピペットで上下にピペットを動かしてよく混ぜてください。
   5. 各サンプルの単一プレートシリアル希釈スポッティングを準備し、各シリアル希釈のうち10μLを単一のR2Aプレートにメッキします。
   6. 皿を傾けて滴を広げます。培養皿は常温で培養します。
   7. コロニー形成単位(CFU)を数え、土壌のCFU/gを計算します。
6. 無菌ハサミを使って芽を根から切り離します。新鮮なシュートの重さを記録しましょう。
7. 根は脱イオン水で優しく振ってきれいにします。根元を吸い、乾かし、新しい重さを記録します。
   注:この地点で地上および地下の物質を収集し、関心のある下流分析に最適な方法論で処理することができます。

結果

私たちは、植物と微生物の相互作用を調べるために必要な無菌かつ管理された環境を可能にする新しい植物のグノトバイオティクスシステムであるGNOVAを開発しました。この新しいシステムは、垂直方向に24.4インチ(62cm)のシュートスペースと、複数の土壌基質に対応した1.3リッターの鉢を提供します。完全に組み立てられたシステムは高さ約3フィート(92.4cm)、幅約4.57インチ(11.6cm)です(図5A–C)。他のシステムと比べて、枝の成長に対する垂直方向の能力が最も高く、根室は2番目に大きいです(補足表1)。GNOVAは成長チャンバー内の表面積が0.0135 m^² で十分であるため、このシステムはコンパクトで操作性が高いです。このシステムは、垂直クリアランス1.22mのリーチイン成長チャンバーで使用可能です。このシステムのすべての部品は、3Dプリントされたベースを除きオートクレーブ可能であり、24インチ×24インチ×36インチ(幅×長さ×高さ;61cm×61cm×91cm)のオートクレーブに対応しています。これにより、個々の部品の手動滅菌を回避し、実験のセットアップが効率化されます。さらに、このシステムのほとんどの構成要素は再利用可能であり、初期セットアップコスト54ドルを除いて、実験1回あたりの使用コストは約6USDに抑えられています(補足表2参照)。GNOVA内の環境条件は、生後1週間のトウモロコシ植物で3日間の温度と相対湿度を追跡することで決定されました。GNOVA内の温度は平均して成長室より+1.3°C高かった(補足図1参照)。系およびチャンバー内の温度差は、光サイクル(平均+2.5°C)では暗いサイクル(平均+0.4°C)よりも大きくなっていました。GNOVA内の相対湿度は平均63%で、成長チャンバーの34%と対照的でした。

図5:GNOVAシステムのレンダリング。(A) 支持基盤の最終設計の3Dモデル (B) 支持基盤の3Dモデルの断面図 (C) 完全組み立てGNOVAの3Dモデルの断面図 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

システム内の無菌性を確保するため、灌漑なしおよび植物なしの灌漑システムを対象に4週間の試験を実施しました。ガラスシリンダーの汚染は、綿リングの上下を直接綿棒メッキで採取することで特定されました。非灌漑(n=4)および灌漑サンプル(n=6)の両方で、綿花輪の上方で3コロニー以上(すなわち表面積の3分の1あたり1コロニー)の微生物増殖は観察されませんでした(補足図2A)。綿輪の下では、非灌漑の複製で1つの増殖が観察され、灌漑されたシステムでは成長が検出されませんでした(補足図2B)。これは、綿花リング下の部分から微限の複製にしか存在せず、植物と接触していないため、ガラス円筒からの汚染の可能性が低いことを示唆しています。土壌汚染は、R2Aプレートに連続的に希釈されている箇所を検出することで評価されました(補足図2C)。いずれの条件下でも顕著な微生物増殖は検出されず、連続希釈によるコロニー形成単位数が非評価される灌漑複製株(すなわち<30コロニー)のみ認められました。無菌試験に加え、GNOVA内で栽培された小麦とトウモロコシを、標準的な2週間の^袋中成長プロトコルとのパフォーマンス比較を行いました。小型サイズと灌漑不足が植物のパフォーマンスに与える影響を理解するため、袋内の成長期間をGNOVA内のものに合わせて延長しました。両システムの初期設置時に使用された土壌水分含有量は一致していましたが、GNOVAは週1回の肥料注入を受け、袋はそうではありませんでした。すべての比較において、私たちはバッグシステムを基準にしています。これは私たちのラボの最初のグノトバイオティクスセットアップだったからです。GNOVAでは小麦とトウウモロコシの両方が100%の発芽率を達成したのに対し、袋式では小麦は67%(n = 3)、トウモロコシは75%(n = 8)にとどまりました(図6)。

図6:GNOVA(紫)および袋(緑)システム内での小麦(n = 3)とトウモロコシ(n = 8)の発芽。各複製の発芽結果は、y軸上の点で表されます。各グノトバイオティック系に対して、発芽なしまたは発芽済みです。バーは異なるシステム内の各植物種の発芽率(%)を表しています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

また、小麦とトウモロコシの成長試験も実施され、GNOVA内で最大生存可能な成長期間と植物のパフォーマンスを決定しました。標準的な袋のプロトコルでは成長期間は2週間にとどまりますが、より良く比較するために袋内の成長期間を2週間以上延長しました。2週間後、GNOVA(n=3)内で栽培された小麦はすでにザドックの成長段階(GS)13に達していました(図7A)が、袋内ではGS11のままでした。5週目には、GNOVAシステム内で植物は分蘩の出現(図7B)からGS21に達していました。対照的に、袋システムには耕運機がなく、植物はGS13に残されました。この成長の阻害と袋システム内のフェノロジー変化の欠如により、このシステムの植物は6週目に終了しました。小麦の苗はGNOVA内でさらに5週間成長を続け、葉数とバイオマスの増加が観察されました(図7C)。GNOVA内で小麦バイオマスは12週間の成長後に視覚的に増加したものの、植物はより多くのクロロシス葉を見せ始め、ガラスシリンダーの体積は植物のバイオマスで満たされました(図7D)。その後さらに2週間、小麦を栽培しました(図7E,F)。しかし、バイオマスの目に増えた様子はなく、成長試験は成長17週で終了しました。また、GNOVA内で4週間のトウモロコシの成長も評価し、袋入りトウモロコシと比較していました(図8A,B)。この実験では、トウモロコシの種子をGNOVAまたは袋システム内で播種する前に滅菌し、発芽させました。トウモロコシの新鮮な芽と根重は両システム間で有意に異なっていた(2標本t検定、p値<0.05、補足表3)。GNOVAで栽培されたトウモロコシは、新鮮な芽と根の平均重量がそれぞれ11.2gと5.7gでした(図8C,D)。対照的に、袋内で育てられたトウモロコシの芽と根はそれぞれ1.29gと1.15gの新鮮な重さでした。全体として、GNOVA内で栽培されたトウモロコシの新鮮なバイオマスは、袋式システムで栽培されたトウモロコシと比較して593%増加しました。さらに、GNOVA内での茎と根の長さは、それぞれ袋よりも89%と57%有意に長かった(図8E、F)。

図7:GNOVAプロトタイプ内の小麦の成長。(A)ザドックの成長段階(GS)13の2週間後の小麦。(B) 袋で5週間成長した小麦とGNOVAの比較。ティラーはGNOVA(GS21)内に存在し、袋(GS13)には存在しません。(C) 小麦の生長期10週目にバイオマスが増加すること。(D) 小麦の生長期13週目にクロロティックな葉が現れるとともにバイオマスが増加すること。(E) 小麦の生長期15週目にバイオマスをさらに増加させること。F) 小麦バイオマスは成長17週時点で利用可能な成長量の大部分を占めます。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図8:GNOVA(紫)プロトタイプ内のトウモロコシの成長と袋システム(緑)の比較。 バーは標準誤差±平均値(n=4)(A)を示し、GNOVAおよび袋システムで4週間栽培したトウモロコシを示します。(B) GNOVAと袋システムで栽培された収穫植物のサイズ比較。(C) 新梢の重量(平均±SE)。(d) 新鮮な根重(平均±SE)。(E) 射程の長さ(平均±SE)。F) 根の長さ(平均値±SE)。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足図1:GNOVA(紫)および成長室(オレンジ)内で測定された相対湿度と温度の時間的動態。 データは3日間にわたり5分間隔で記録されました。GNOVA内のデータは、7週間齢のトウモロコシ植物で記録されました。淡い青色で陰影がついた部分は夜間の時間帯に対応しています。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図2:灌漑なし(対照)および灌漑(灌漑)によるGNOVAの不稔性試験による微生物増殖。 (A) 綿輪の上のガラスシリンダーサンプル。(B)綿輪の下にあるガラスシリンダーサンプル。(C) 土壌試料の単一プレート連続希釈板付け。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表1:GNOVAと他の既存の植物グノトバイオティクス(EcoFAB、マゼンタボックス、バッグ、FlowPot、GnotoPot、EcoFAB 3.0)との特徴比較。 システムは、植物の高さ容量、根容量、灌漑制御など、実験設計に関連する重要なパラメータで比較されます。情報は公開文献や利用可能なシステム記述からまとめられました。データが明示的に報告されていない場合は推定値が示されています。† 文献で明記されていない最良近似;‡ システムは分解や層流フードに移動する必要がなく、* システムの修正により可能;コストカテゴリーは、低価格(1ユニットあたりUSD 100)に定義されています。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足表2:単一のGNOVAユニットの組み立ておよび運用にかかる資材表(BOM)および推定費用。 材料は再利用可能または使い捨て部品に分類され、それに対応する単位コスト、システムごとの必要な数量、およびシステムあたりの総コストが示されています。再利用可能な部品は初期セットアップコストに寄与し、使い捨て材料は実験ごとの消耗コストを表します。* コスト効率の高い料金のために交渉された一括価格から計算;** 必要な量は実験期間、使用する土壌基質、研究目的によって異なります。粘土と砂の混合物を使った週1回の灌漑スケジュールによる4週間の実験の価値;† システムあたり必要な材料量の概算;‡ 実験目的によって異なるため、栄養溶液や土壌基質の価格は含まれていません。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足表3: GNOVAおよびバッグシステム内で成長したトウモロコシ成長の2標本t検定のp値は測定された変数を測定しました。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

ここで紹介する植物のグノトバイオティックシステムであるGNOVAは、穀物作物における植物と微生物の相互作用を研究するためのアクセスしやすく多用途なツールを提供します。主な特徴としては、成長能力の向上と組み込み灌漑があり、無菌条件下で穀物の成長を苗木期を超えて延長します。このシステムの性能はEcoFAB 3.0に匹敵し、アクセスしやすい代替植物グノトバイオティクスシステムを提供します。このシステムは、コスト、簡便さ、中型オートクレーブとの互換性を考慮した市販の部品から構成されており、研究所間での普及を促進しています。組み立てと操作は簡単で、専用機器を必要としないため、実装の障壁が減ります。GNOVAは、幅広い土壌基質、種子滅菌プロトコル、微生物接種剤(無菌、SynCom、または自然群集)、多様な下流解析との互換性により、異なる研究目標に適応可能です。

植物のグノトバイオティクス実験では、観察された影響が対象微生物に起因し、汚染物質によるものではないことを確認するために、最小限の汚染が不可欠です。GNOVAのシンプルな操作により、汚染リスクが低減されます。無菌技術の厳格な遵守と以下の主要な推奨事項により、無菌性が確実に維持されます。実験設置中は、微生物接種剤間の層流フードの消毒を推奨し、処理の交差汚染を最小限に抑えることを推奨します。処理の順序も交差汚染の減少に寄与します。生微生物治療の前に無菌処理を施すことが理想的です。異物微生物は種子を通じても持ち込まれることがあります。したがって、表面種子滅菌プロトコルは、各植物種や種子源に応じて最適化され、無菌性と発^{芽のバランス}を取る必要があります。ソルガム²⁴、大麦²⁹、スイッチグラス、オート麦²³ などの非モデル穀物の滅菌プロトコルは、GNOVAで容易に実装可能です。滅菌が発芽に悪影響を及ぼす場合は、発芽前の種子が使用されることもあります。灌漑はグノトバイオティクスシステムにおける主要な汚染源となっています。この工程で最も重要なのは、フィルターを灌漑管に取り付ける部分です。灌漑管やフィルターのチューブの端部はこの過程で無菌状態を保つ必要があります。炎殺菌は器用さを要し、特に大規模な実験では労力がかかることがあります(n >50)。したがって、大規模な実験や炎殺菌が実用的でない場合には、漂白剤ベースの代替法が推奨されます。また、取り扱いシステム材料の汚染に備えて、追加の無菌フィルターを維持し、水やり時に漂白剤やエタノールを用意することも推奨されます。さらに、汚染管理ユニット(植物なし、微生物処理なし、灌漑)の設置は、無菌状態の監視と汚染物質の特定に強く推奨されます。

灌漑汚染のリスクを克服するため、最初の植物グノトバイオティクスシステムは完全に閉鎖され、灌漑能力を持たなかったため、実験期間が制限されていました。トウモロコシは、袋^19、30、ガラス管、ペトリ皿¹⁵ で2〜4週間の間にグノトバイオティックで栽培されました。植物の成長中に水分と栄養を補充するために、EcoFAB²³、FlowPot、GnotoPot²¹ などの代替システムが、層流フード内で部分的に分解して灌漑を行うことが可能になりました。これにより、その大きさや大型植物との相性が制限されていました。灌漑ラインはGNOVA以外でも容易にアクセスできるため、分解は不要であり、システムは層流フードのサイズに制約されません。これにより、栄養素や水分の継続的な供給が可能になるだけでなく、利用可能な成長スペースも広がります。芽のスペースが減少すると光合成能力が低下し、成長の阻害に寄与します²⁴、根の容量制限は根の結合を引き起こし、水分や栄養^分の吸収を減少させることがあります。袋システムにおける小さな成長空間と灌漑の欠如の組み合わせが、GNOVAシステムと比較してトウモロコシや小麦のバイオマス減少やフェノロジー的進展の欠如を説明する可能性があります。この新しいシステムは、EcoFAB 3.0²⁴においてソルガムと同等の期間でトウモロコシのグノトバイオティック成長を可能にしました。さらに、より代表的な土壌システムでは、水耕栽培システム(20)で小麦のグノトバイオティック成長を4週間上回ります。物理的制約に加え、グノトバイオティックシステムは無菌性を維持するために空気の流れを制限することに依存しています。空気の流れが限られていることがあり、温度や湿度の増加、ガス交換率の低下が植物の生理に影響を与える^{可能性があります。}GNOVAで使用されているDW4フィルターと同様の動作をするHEPA^{フィルター33} を搭載したマゼンタボックスなど、空気流が強化されたシステムで成長の改善が報告されています。同様に、EcoFAB 3.0は温度と相対湿度が上昇しましたが、ソルガム²⁴のグノトバイオティック成長の堅牢なプラットフォームと見なされていました。これは、グノトバイオティックシステム内には物理的・環境的制約が依然として存在するものの、ここで示されたシステム設計の進歩は、穀物のグノトバイオティック成長をより効果的に支える改善された条件を提供していることを示唆しています。

改造の容易さもGNOVAの重要な特徴の一つです。その設計のモジュール性により、ユーザーは個々の部品を研究ニーズや予算により適した変更を行うことができます。このシステムは、自然土壌を含むあらゆる土壌基質に適合します。設置量、栄養溶液濃度、灌漑量および頻度の変更は、土壌の物理化学的性質に基づいて行うべきであり、これらは栄養素や水の利用可能性や分布に直接影響します^。干ばつはGNOVAシステム全体の重量を監視し、土壌水分含有量を重力^計で測定することで誘発できます。根の浸出物は、収穫された植物を超^純水で 培養するか、システムを洗浄して非無菌の浸^{出液を得る}ことで破壊的に収集できます。滅菌浸出物が必要な場合、GNOVAのポットおよび3Dプリント支持ベースを改造し、EcoFAB 3.0²⁴の設計に似た組み込みの浸出液収集機能を組み込むことができます。微生物群集の組み立てに対する優先効果³⁸ を理解したい科学者は、鉢の周囲に追加の灌漑ラインを設置することができます。これにより、主灌漑ラインの無菌性を維持しつつ、微生物接種剤の後続の散布が可能になります。環境条件は、GNOVA内に消毒された無線温度・相対湿度センサーを設置することで監視できます。あるいは、ガラスシリンダーをポリカーボネートチャンバーに置き換え、サンプリングポート²⁴ を掘ることで、環境の測定やガスのサンプリングが可能になります。これにより、_CO2、_O2、エチレンなどのガスや揮発性化合物の定量化が可能となり、^{プラントの性能}に影響を与える可能性があります。また、ガラスシリンダー内の綿リングを外すことでシステムへの空気の流れを増やすこともできます。しかし、これらの改変はいずれかが汚染リスクを高める可能性があり、GNOVA内ではまだ検証や最適化がなされていません。

GNOVAの利点と多様性にもかかわらず、いくつかの制限を考慮する必要があります。このシステムは、温室や畑での制御されていない環境が性能に影響を与える可能性があるため、制御された成長室での使用に最適であることに注意が必要です。小麦は17週間内成長できましたが、成長の約12週間でストレスの兆候が観察されました。したがって、小麦は12週を超えて栽培すべきではありません。さらに、不妊の維持は4週間の成長期間中に週4回の灌漑によってのみ確認されました。実験時間が長いほど汚染リスクが高まります。GNOVAは根の容積容量を増加させていますが、根の制限は依然として可能であり、根の形態を時間的に評価することで、根の結合を最小限に抑える最適な成長期間を決定するのに役立つかもしれません。さらに、ガラス製シリンダーをポリカーボネートシリンダーに交換するなどのシステムの改良により、設置コストが1台あたり100ドルを超えることもあります。現在、GNOVAはエンドポイント破壊的サンプリングのみを認めており、これにより微生物動態、浸出パターン、無菌モニタリングの時間的研究における労働量と再現性の要件が増加しています。最後に、設置、灌漑、収穫時の無菌性維持は時間がかかり、GNOVAのような簡易システムでも専念的な労力が必要となり、全体の運用コストが増加します。これらの制限を総合的に考慮して、このシステムを採用する際には考慮すべきです。さらに、グノトバイオティックの成長による環境制約は、実験計画や結果解釈の際に考慮する必要があります。これらは植物の生理学や関連するマイクロバイオームに影響を与える可能性があります。

GNOVAは穀物作物と互換性のある多用途なグノトバイオティックプラットフォームを提供します。このシステムは、RhizoVision explorer³⁹やARIA⁴⁰などの根構造解析ツールに適したほぼ完全な根系の回収を可能にし、多様な微生物接種剤や環境条件に応じて根の形態を特徴付けることを可能にします。SynComsやマルチオミクス解析と組み合わせることで、GNOVAは微生物エフェクターと植物応答との機構的関連の特定を促進します。より大きなSynComs(会員数>100人)とメタゲノム解析(41,42,43)を組み合わせることで、共生パターンを調査し、^{異なる条件下で}生態学的に重要な微生物を同定できます^5,44。対照的に、より小さなSynCom(<50株)はメタトランスクリプトミック^45,46、メタプロテオミクス19,47,48、メタボロミクス49,50,51と組み合わせることで、植物および微生物の機能的応答の詳細な特徴付け^{が可能です。}.これらの能力を合わせることで、GNOVAは農業システムの持続可能性を高める新たな生物接種剤の開発を加速させる主要な微生物形質の同定に貴重なツールとして位置づけられています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Powerconnect コードレスドリル& 100ピースキット	Black+Decker	BDC120VA100	1/4インチと1/8インチのドリルビットが必要です。
ビニールテープ、黄色、1インチ幅×36ヤード	3M	471	消耗材料
スターリングゴムバンドサイズ#32 （システム1つにつき2本のゴムバンド）	Amazon	B001I1QO00	消耗材料。
麦の種			この実験で使用された品種：カタウバ
ガラス繊維パイプラップ断熱材、3インチ幅x1/2インチ厚 （システム1つにつき2つのプレカット円）	Lowe's	28930	2 7/8インチ（7.3 cm）直径の円に切る。消耗材料。高スループット生産の円は、ラップ断熱材を広げ、鉢の開いた端を使って、鉢を断熱材のラップの上に置き、圧力をかけ、ねじることによって円を切ります。
DW4フィルターメディア、15インチx75ヤードにプレカット （システム1つにつき1つのカット円）	Class Biological Clean, Ltd	NA	6.3インチ（16.02 cm）直径の円に切る。CBCには、代わりに購入できる他のプレカットまたは標準ロールサイズがあります。  消耗材料。円のテンプレートを段ボールに切り取り、DW4メディアの領域全体に円を描き、はさみで切ります。
シリコンチューブ、Versilon SPX-50高強度、1/8インチID x 1/4インチOD x 1/16インチ壁の厚さ	Saint-Gobain	ABX00007	2つの長い部分（16インチ//40.64 cm）と3つの短い部分（2.5インチ//6.35 cm）に切る
水溶液中5%の利用可能な塩素を含む次亜塩素酸ナトリウム	VWR	JT9416-1	2% v/vに希釈し、トウモロコシの滅菌プロトコルに使用
ムラシゲ&スクーグ培地、微量元素と多量元素。25 L	Research Products International	M10200-25.0	0.5倍濃度の希釈
エタノール、100%、Deacon Labs	Fisher scientific	04-355-451	95% v/vに希釈
注射器3 mL、ルアーロック非滅菌 （システム1つにつき2本）	Fisher scientific	14-817-117	プランジャーを捨て、バレルのみを保管し、ガラスウールで満たし、ホイルでキャップをします。
ガラスビーカー、250 mL	VWR	470191-150	麦の種の滅菌に5つ必要
トウモロコシの種			この実験で使用された遺伝型：メキシコ21–22 B73XMo17
アルミニウムベーキングトレイ18インチx26インチ	Amazon	B01FIK54LQ	フローフードの寸法に合うことを確認してください
塩化ナトリウム	Fisher scientific	BP358-1	0.145 M溶液を準備します。
3Dプリントベース、ポリ乳酸（PLA）フィラメント使用（システム1つにつき1つ）	Protolabs	NA	印刷と編集可能なファイルは補足資料にあります。Dryad.org DOI https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbcで利用可能。PLAを使用したベースの場合はオートクレーブをしないでください。PLAは150℃以上で溶け、60℃以上で変形する可能性があります。40℃以上で使用する場合は、PLA 3Dプリントベースの完全性をテストすることをお勧めします。PETG（ポリエチレンテレフタレートグリコール）やPC（ポリカーボネート）などの耐熱性の高い材料を使用することもできます。ただし、これにより部品のコストが上がり、オートクレーブ可能でない可能性もあります。ベースプロトタイプの3D印刷は、256×256×256 mm（長さ×幅×高さ）のビルドボリュームを持つ個人用プリンターで行われました。速度とコスト効率を考慮すると、ローカルの商業3D印刷サービスプロバイダーでバルク印刷することをお勧めします。
ルアーオスからホースバーブへの継手1/8インチID、動物由来フリーポリプロピレン （システム1つにつき2本）	Cole-Parmer	EW-50114-69	プロトコルでフィッティング1として参照
オススリップルアーからホースバーブへの継手1/8インチID、動物由来フリーポリプロピレン （システム1つにつき1本）	Cole-Parmer	EW-50114-63	プロトコルでフィッティング2として参照
201ステンレス製ウォームギアホースクランプ、1 1/2インチ-3 1/2インチクランプ径（システム1つにつき1つ）	Grainger	5CZF2	プロトコルでホースクランプとして参照
エアストリームGen 3ラミナーフローキャビネット、シンプルスイッチ付き、寸法24 1/4インチx47インチx28 1/4インチ	ESCO Lifesciences	2120707	プロトコルでラミナーフローフードとして参照。同様の寸法の任意のラミナーフローフードが機能します。小さなフローフードでは修正が必要になる場合があります。
プレイサンド、Quikreteプレミアム。50ポンド	The Home Depot	1001709466	プロトコルで砂として参照
304ステンレス製編み線、120メッシュ（システム1つにつき1本）	Amazon	B09KRS5F7T	記事でステンレス製ワイヤメッシュとして参照。4.7インチ（11.9 cm）直径の円に切る。高スループットまたは円の生産には、段ボールに円のテンプレートを切り取り、ワイヤメッシュの編み目の領域全体に円を描き、はさみで切ります。
粘土（モンモリロナイト）、OIL-DRIルーズソルベント、50ポンド重量、香料なし	Grainger	44Z111	プロトコルで粘土として参照。消耗材料。
透明なハリケーンキャンドルシェードチムニーチューブ、底なし4インチODx30インチ長さ（システム1つにつき1本）	WCG International	HST0430	プロトコルでガラスシリンダーとして参照
透明なプラスチックキャップ、3インチ（7.6 cm）直径 （システム1つにつき1本）	ClearTec Packaging	PCC3.000	プロトコルでプラスチックキャップとして参照
透明なポリカーボネ