コラーゲン酵素注射と運動誘発性機械的過負荷の組み合わせ:過負荷ストレス損傷(膝変形性関節症)を模擬したマウスモデル

サマリー

本プロトコルは、関節内コラーゲン酵素注射と運動誘発性過負荷を組み合わせて、過負荷による膝の変形性関節症のマウスモデルを確立し、変性病因を調査するための低侵襲プラットフォームを提供します。

要約

膝関節症(KOA)は、生物組織の劣化と持続的な機械的過負荷の複雑な相互作用によって引き起こされる多因子性変性関節疾患です。従来の外科動物モデルでは、しばしば外傷後関節破壊を引き起こしますが、これはヒトの変性性KOAの徐々かつ累積的な病因を正確に再現できません。この翻訳ギャップを埋めるため、本研究は、軽度の酵素軟骨分解と持続的な機械的負荷を相乗効果でシノジー化し、過負荷ストレス誘発KOAをシミュレートする新規かつ再現可能なマウスモデルを確立します。具体的には、標準化された関節内注射のタイプIIコラーゲンナーゼを、厳格に調整された回転筋型疲労装置による毎日の機械的過剰負荷と4週間にわたり組み合わせました。この二重要因介入の有効性は、包括的な行動分析、組織学的分析、分子分析を用いて検証されました。自動歩行分析により、複合群に重度の運動障害が認められました。これらは歩幅、歩幅、そして立ち込みの最大足面積が大幅に減少したことが特徴です。サフラニンOファストグリーン染色を用いた組織形態学的評価により、これらの機能的欠陥が確認され、軟骨構造損傷の進行性、表面欠陥、そして早期から中期のヒトKOAの病理的特徴を忠実に反映したOARSI(OARSI)のスコアが有意に上昇していることが示されました。さらに、免疫組織化学的評価では、関節軟骨細胞における機械感受性チャネル一過性受容体電位バニロイド4(TRPV4)の著しいアップレギュレーションと、重要なマトリックスタンパク質であるコラーゲンII型アルファ1(COL2A1)の同時減少が示されました。局所的な関節の不安定性と制御された機械的ストレスを統合することで、この低侵襲戦略は外科モデルに伴う急性外傷を回避します。このプロトコルは、動的分子メカニズムの追跡、慢性疼痛表現型の評価、初期変形性関節症の長期治療的介入の検証のための臨床的に関連性の高い実験プラットフォームを確立します。

概要

変形性関節症(OA)は、肥満、機械的負担、外傷などの要因に起因する痛み、腫れ、こわばり、機能障害を特徴とする多因子性の変性疾患^です。膝関節症(KOA)は非常に一般的で加齢に伴い増加していますが、臨床症状の多様さから臨床試験の範囲が限られていることが多いです。したがって、効果的な治療法の開発には適切な動物モデルが必要です^。OAの本質的な異質性を考えると、普遍的に受け入れられた「ゴールドスタンダード」モデルは存在せず、研究者は自分の科学的探求に合致する特定のモデルを特定する必要があります。

KOAは現代医学において、関節軟骨および軟骨周囲組織に機械的および生物学的要因が相互作用する状態として特徴づけられています。この複雑な相互作用の結果として、主に関節軟骨とその周囲のマトリックス3の進行性劣化が起き^{ています。}機械的ストレスは、関節細胞^{や組織内の}さまざまな生理学的・病理学的プロセスを支配する重要な伝達シグナルとして機能します。関節軟骨を健康な状態に保つには、生理的範囲内で適切な機械的負荷が必要でした。逆に、過剰な負荷は軟骨の変性を引き起こし、その後^KOA5の発症を引き起こすことが多いです。自発モデルは多大な時間と経済的投資によって妨げられます⁶ 一方、外科的誘発モデルは主に中後期KOAを代表する破壊的アプローチを用い、自然な進行から逸脱します ^7,8。逆に、化学的に誘導されたモデルはコラーゲンマトリックスを標的としますが、機械的ストレスなしで使用した場合、ヒト変性骨形作り病の包括的な変化を捉えることができません⁹。酵素的分解と機械的過負荷を組み合わせることで、過負荷ストレス損傷の徐々な病因をより忠実に再現することで、これらのギャップを埋めることができます。本研究の目的は、関節内タイプIIコラゲナーゼ注射と回転式ホイール疲労装置を用いた過負荷を組み合わせることで、KOAの新しいマウスモデルを確立・検証することです。

プロトコル

すべての動物実験は、上海中医薬大学動物ケア・利用委員会が承認したプロトコルに従って実施されました。実験は、上海中医大学倫理実験動物センターが付与したプロジェクトライセンス(番号:PZSHUTCM201016022)のもとで行われ、米国国家研究評議会(米国)の実験動物ケア・利用ガイド更新委員会に準拠しています。

1. 動物モデル生産プロトコル

1. 10週齢のC57BL/6マウス32匹をランダムに4つのグループに割り当てる:対照群、コラーゲン酵素、過度運動、コラーゲナーゼ+過剰運動群。
   1. モデル手順を開始する前に、すべてのマウスを標準的な給餌と飼育環境のもとで1週間慣らしてください。
2. 割り当てられた実験グループに従い、4週間にわたって動物モデルを誘導します。
   1. コラーゲナーゼ群のマウスに関節内注射でタイプIIコラーゲンを投与します。
   2. 過度運動群のマウスに回転車輪装置を用いた運動訓練を施します。
   3. 関節内コラーゲンゼ注射と回転ホイール運動トレーニングの両方を、コラーゲン酵素+過剰運動群のマウスに適用してください。
   4. 関連するすべての運動グループで、同じ頻度と持続時間を維持してください。

2. タイプIIコラーゲン酵素関節内注射プロトコル

1. 麻酔
   1. 校正済みガス麻酔装置を通じて投与されたイソフルランを用いて麻酔を誘導します。イソフルラン濃度2%〜3%で急速誘導を行います。
   2. 麻酔は1.5%〜2%のイソフルラン濃度で維持してください。麻酔除去システムの適切な運用を確保し、職業的な曝露を防ぎます。
   3. 手技中、マウスの呼吸数と反射を継続的にモニタリングしてください。
2. 皮膚の調製
   1. 左膝関節の周囲に脱毛クリームを塗ります。スクレーパーで毛を完全に取り除きます。
   2. 露出した皮膚をしっかりきれいにしてください。調製中は無菌状態を維持してください。
3. タイプIIコラーゲン酵素製剤
   1. タイプIIコラーゲン酵素粉末を無菌のバイオセーフティキャビネットで室温に30分間平衡させます。溶解過程では、無菌リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.2–7.4)を専用の溶媒および緩衝剤として使用します。
   2. 分析天秤を使って必要なコラーゲンパウダーの質量を正確に計量します。無菌PBSを粉末にゆっくり加え、最終作業濃度0.04 U/μLにします。
   3. 混合物をピペットで上下に動かして、透明で目に見える粒子がなくなるまで優しく混ぜます。この段階では酵素活性の喪失を防ぐために激しい渦巻きを避けてください。
   4. 準備済み0.04 U/μL溶液を1,000 rpmで4°Cで5分間遠心分離します。 これにより未溶解の微粒子が除去され、注射後の針詰まりを防ぎます。
   5. 上澄液を無菌チューブに吸引し、4°Cの氷浴で保存してすぐに使用してください。酵素活性を最大化するために、各セッションごとに溶液を新鮮に準備してください。
4. 関節内注射
   1. 利き手でない親指と人差し指でネズミの背中の皮膚を掴みます。両下肢を薬指と小指で固定し、膝関節を自然に伸ばし、注射部位を完全に露出させます。
   2. 30Gの針が付いた10μLのマイクロシリンジを手に取ってください。針を皮膚表面に平行に、入り口で約0.2cm刺して浅い皮膚層に挿入します。
   3. 組織の抵抗が弱まったら、針の向きを皮膚に対して垂直にゆっくり調整します。
   4. 針を約0.3〜0.5 cm進め続け、抵抗が失われて関節腔への侵入を示すまで続けます。逆流がないことを確認するために、注射器のプランジャーをゆっくり引き抜いてください。
   5. II型コラーゲナーゼ溶液(濃度:0.04 U/μL)を5 μLを一定速度¹⁰で関節腔に注入します。
   6. 注射直後は針の位置を保ちましょう。注射部位の周囲の皮膚を10〜15秒ほど優しく押し当てます。
   7. 針をゆっくりと引き抜いてください。薬の漏れを防ぐため、無菌ガーゼで入口を軽く30秒押します。
   8. ネズミを暖かく乾燥したケージに入れます。動物が自然に回復するまで待ってください。通常は5〜10分かかります。
   9. ネズミが完全に回復したら、通常の飼育環境と餌やり環境に戻ります。
   10. これらの関節内注射は週に2回、注射間隔は3〜4日を空けて、4週間のモデル期間中のみ実施します(初期1週間の順応後)。
   11. すべてのシャープは直ちに承認されたバイオハザード容器に処分してください。
       注意:すべての注射は訓練を受けた専門家が行うことを確実にし、関節損傷や実験的変動を最小限に抑えてください。

3. 回転車輪誘発過負荷プロトコル

1. 装置の準備と安全確認
   1. 回転式疲労装置の回転速度を12回転(約0.063 m/sに相当)に設定し、1回のセッションに2時間にします。
   2. 電気刺激モジュールをオンにしてください。出力電流が0.1〜0.3 mAの事前設定安全範囲内であることを確認してください。電流強度を手動で増やさないでください。
      注意:電気刺激モジュールは罰則的な刺激ではなく、マウスをホイールに戻すための誘導のみに使用してください。装置配線の損傷を確認し、ショートや感電を防ぐために、操作前に電極の接触を良好にしてください。
2. 順応訓練
   1. 疲労装置の回転ホイールチャンバーが清潔で乾燥し、破片がないことを確認してください。車輪入口の電気刺激電極を無効化し、刺激に関連するストレスを排除してください。
   2. 尾の付け根を優しく扱うか、滅菌した軟組織ですくい上げます。マウスを一匹ずつ回転ホイールの中央部分に置きます。
   3. マウスを水平な走りの表面に自然な四足歩行の立った姿勢で配置します。体を車輪の中心回転軸に平行に向け、前足は前、後足はやや後ろに向けます。
   4. 最初の2分間はネズミが狭い電極ゾーンに入るのを防ぐために、一時的で制限のないソフトバリアを使いましょう。この期間終了後、バリアを外してマウスが自由にチャンバー全体を探索できるようにします。
   5. 最初の3日間は、マウスを固定装置の中に1日10分間置いておく。この間は車輪の回転を始めたり、電気刺激を一切行わないでください。
   6. 持続的な凍結や過度な飼育などの重度のストレスの兆候がないか注意してください。異常な行動を示した場合は、マウスを優しく車輪の中央に位置移し、自然な姿勢を取り戻します。
   7. 4日目に5回転の速度で30分間ホイールをスタートさせます。この工程は、電気的な手がかりを使わずにマウスを装置の動きのリズムに慣らしめます。
   8. リズム適応フェーズ中にマウスが落ちたり止まった場合は、手動でホイールの中心に戻します。4日間の順応期間中、電気刺激は停止状態に保たれます。
      注意:慣化段階では恐怖によるストレス反応を防ぎ、今後のトレーニング遵守を確保するために電気刺激の使用を避けてください。
3. 正式な演習の実行
   1. 正式な研修は毎日決まった時間(例:午前9時から午前11時)に実施します。断熱手袋を着用して、マウスを回転筋タイプの疲労装置に入れてください。
   2. 装置の扉を閉めろ。12 rpm(~0.063 m/s)の事前設定パラメータを開始し、1回のセッションで最大2時間のセッションを行ってください( 図1参照)。
      注意:トレーニング中はネズミを継続的に監視してください。ネズミが連続して(1分間に3回以上)転倒した場合は、激しい疲労やストレスによる怪我を防ぐためにトレーニングを5分間中断してください。
4. 疲労のエンドポイントの決定と刺激
   1. マウスの疲労状態を評価するために継続的にモニタリングしてください。マウスが4つの特定の疲労基準のうち少なくとも2つを満たしている場合は、過度なストレスを避けるために、2時間の訓練を無理に終わらせずに早期に終了してください。
   2. 基準1を、落下する前に5秒以上走行車輪に留まることができないことと定義します。基準2を、1分間に3回以上大幅に増加する落下頻度と定義します。
   3. クライテリオン3を、自発的にホイールに戻る意図がないこと、つまりマウスが電気刺激を受けても動かなくなったり、一瞬しか動かない状態と定義します。
   4. 基準4を異常な運動姿勢の提示と定義します。手足を引きずる、よろめく歩き方などの明らかな兆候を探してください。
   5. マウスがスピナーの入口に落ちた際に、装置が自動的に軽い電気刺激をトリガーできるようにします。マウスがホイール¹¹に戻ったら電気刺激を即座に停止させてください。
      注意:マウスが痙攣や呼吸困難などの異常な状態を示した場合は、直ちにトレーニングを終了してください。マウスを装置から取り出し、必要に応じて症状治療を行います。
5. トレーニング後の処理と頻度
   1. トレーニング終了後に装置の電源を切ってください。ネズミを取り除き、元のケージに戻す際には断熱手袋を着用してください。
   2. マウスに十分な飲料水を与えてください。動物に異常な活動、精神状態、肢体の問題(例:跛行や筋肉の震え)がないか観察してください。
   3. 異常があれば記録し、適時の治療を行いましょう。
   4. このトレーニング頻度は1日1回、1回あたり2時間、4週間連続で続けてください。期間中はトレーニングパラメータと安全監視を一貫させてください。
      注意:毎日のトレーニングセッションの前に、疲労装置と電気刺激モジュールが正常に動作しているかを確認し、刺激強度を一貫させてください。

4. 歩行分析

1. システム概要
   1. 自動歩行イメージングシステムを用いて歩様の習得と分析を行います。
   2. 4週間のモデル化期間終了後、10週齢のC57BL/6マウス32頭に対してすべての歩行手順を実施します。
   3. 高速カメラを透明なトレッドミルベルトの下に配置し、移動中の腹部画像を撮影します。
2. 順応と設置
   1. 正式なデータ収集前に、すべてのマウスをトレッドミル装置に慣れさせてストレスを最小限に抑えましょう。
   2. トレッドミルの速度をマウスの生理的な歩行ペースに合わせて20cm/sに設定します。
   3. 1マウスあたり3件の独立した有効な試験を記録し、試験間に2分の休憩間隔を設けます。
3. トライアル記録とストライド選択
   1. 各試験中、マウスを60秒間の連続的に歩行させてください。
   2. 「フリーズ」やジャンプ、ターンなどで録画が無効の場合は、交換トライアルを実施してください。
   3. ネズミが少なくとも10秒間安定した移動を達成した後にのみデータ収集を開始してください。
   4. 各60秒の試験から最低4回連続したフルストライドを選択して分析します。
   5. 主観的なバイアスを排除するために、2人の独立した盲検観察者がストライド選択を行うことを確実にしてください。
   6. マウスが自然な四足歩行姿勢を維持し、スキップや急激な速度変動がないか確認してください。
   7. 歩幅に体重を支えるスタンスフェーズと前進推進スイングフェーズの両方が含まれていることを確認してください。
   8. トラッキングの損失、ぼやけ、汚染がないクリアな足と帯の接触画像を確認してください。
4. 画像処理とパラメータ抽出
   1. システムソフトウェアの組み込みアルゴリズムを使って、撮影された画像をデジタル化し、ポーベルトの接触点を検出します。
   2. スイング/スタンス比を、スイングフェーズの持続時間とスタンスフェーズの持続時間の比率として計算します。
   3. ストライド長(cm)を、1回のフルストライドで移動した直線距離として測定します。
   4. ストライド幅(cm)を、ピーク時の反対側後足の内側の端の水平距離として測定してください。
   5. 最大体重を支えた時の接触面積を表すピークスタンス時の肉球面積(^cm2)を算出します。
   6. 接地面積変動(^cm2)を連続した歩幅にかかる接触面積の変動係数として計算します。
   7. 各マウスごとに有効な3つの試行の平均値を計算し、最終データセットをエクスポートします。
      注意:不規則な停止、ジャンプ、回転行動を伴う試行は分析から除外します。

5. 組織学

1. 組織採取と固定
   1. 4週間の誘発期間終了後、すべてのマウスを子宮頸部脱臼で人道的に安楽死させてください。左膝関節を慎重に切り離し、周囲の余分な軟組織を取り除いてください。
   2. 試料を直ちに予冷の4%パラホルマルデヒド(PFA)固定剤(w/v)に浸します。組織を完全に浸すには、固定液の容量を標本体積の10〜15倍にしてください。
   3. 組織を室温で48時間固定します。固定容器を8時間ごとに優しく攪拌し、十分な固定液の浸透を確保します。
2. 組織脱石灰化
   1. 固定された標本はゆっくり流れる水で10分間すすいでください。このすすぎを3回繰り返して、残留PFAを除去します。
   2. 試料を0.5 mol/Lのエチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)脱石灰化溶液(pH 7.2–7.4)に移します。脱灰溶液の体積は試料体積の20倍に保ち、4°Cで保存してください。
   3. 組織を14〜21日間脱石灰処理します。古い液体は3日ごとに新しいEDTA脱石剤溶液に交換してください。
   4. 脱炭素の終点を無菌針で軟骨下骨を優しく刺して検査します。脱灰過程は針が抵抗なく滑らかに貫通した時点で終了します。
   5. 完全に脱鈣された標本を流水で2時間洗い、残留EDTAを除去します。その後、リン酸塩緩衝生食塩水(PBS)で3回、各5分間洗浄します。
3. 埋め込みとセクション分け
   1. 脱鈣された標本を段階化されたエタノール系列(70%、80%、90%ずつ2時間、95%1時間、絶対エタノール2回各1時間)を用いて順次脱水します。
   2. 脱水組織をキシレンで2回、それぞれ10分間清浄化します。クリアした組織をパラフィンに埋め込む。
   3. パラフィン埋め込み組織をミクロトームで5μm厚の矢状状連続切片に切断します。セクションをポリL-リジンコーティングガラススライドに取り付け、スライド乾燥ホットプレートで60°Cで2時間焼きます。
4. 組織形態学的評価
   1. 関節軟骨の組織形態を評価するために、サフラニンO-fastグリーンで切面を染色します。
   2. 二重盲検条件下で変形性関節症研究学会国際(OARSI)のスコアリングシステムを用いて軟骨変性を評価する¹²。
5. 免疫組織化学(IHC)コアワークフロー
   1. 切断をキシレンで2回、それぞれ10分間脱脂します。区画を段階的なエタノール系列で順次再水和させ、脱イオン水にします。
   2. 切片を0.01 mol/Lのクエン酸バッファー(pH 6.0)に浸し、マイクロ波による熱エピトープ回収を行います。バッファーを高温で沸騰させ、中程度の強火で15分間やさしく煮ます。
   3. セクションを自然に室温まで冷やしてください。スライドをPBSで3回、各5分間洗ってください
   4. 切片を室温で3%過酸化水素(H2O2)メタノール溶液で20分間培養し、内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断します。スライドはPBSで3回、それぞれ5分間洗います。
   5. 5%のヤギ血清ブロッキング液を切片に塗布します。室温で60分間培養し、非特異的な結合部位をブロックします。
   6. ブロッキング液は洗わずに捨ててください。特定の一次抗体作動液(Transient Receptor Potential Vanilloid 4(TRPV4)を1:100、カスパーゼ3を1:200、またはコラーゲンIIアルファ1(COL2A1)を1:150希釈)に適用します。
   7. 一次抗体の切片を4°Cの加湿チャンバーで12〜16時間培養します。
   8. 翌日、室温に30分間均等にし、その後PBSで3回、各5分間洗います。ホースラディッシュ過酸化酵素(HRP)結合ヤギ抗ウサギまたは抗マウスIgG二次抗体(希釈1:500)を適用します。
   9. 切片を二次抗体と共に室温で60分間培養します。スライドはPBSで3回、それぞれ5分間洗います。
   10. 3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)クロモゲン溶液を塗布し、暗闇で室温で3〜5分間培養します。顕微鏡観察で明確な茶色信号が現れたら、脱イオン水で反応を直ちに止めてください。
   11. ヘマトキシリン溶液で5分間カウンターステインを塗ります。流水で10分間すすいで、シミが青く変わるのを待ちます。
   12. 1%酸性アルコール溶液で30秒間区切を分離します。スライドを流水で5分間洗い流します。
   13. 切片を段階化されたエタノール系列で素早く脱水し、組織をキシレンで2回、それぞれ10分間洗浄します。
   14. スライドを中性バルサムで取り付け、光学樹脂カバースリップで覆います。取り付けたスライドは室温で乾かします。
6. IHC制御と画像解析
   1. 染色手順中に一次抗体をPBSに置き換えて陰性対照を確立します。抗体の有効性を検証するために、既知の軟骨組織切片を陽性対照として含めてください。
   2. 染色した断面画像は、40×および100×倍率のスライドスキャナーで取得します。
      注意:主観的バイアスを減らすため、すべての組織学的評価は少なくとも2人の盲検観察者によって独立して実施してください。

6. 統計分析

1. データ処理と全体的なテスト
   1. すべてのデータ収集と解析は、実験バイアスを最小限に抑えるためにブラインド条件下で実施すること。
   2. 4つの実験群間の連続変数を一方向分散分析(ANOVA)を用いて解析し、全体的な差異を検証します。
   3. 必要なパラメトリック仮定を満たさない変数にはクルスカル・ウォリスH検定を適用します。
2. 事後検定と有意性閾値
   1. 初期ANOVAで統計的有意性が示された場合、Tukey検定を用いて事後比較を行い、特定のグループ差を特定します。
   2. 家族ごとの誤差率を制御するにはTukeyテストのみに頼ってください。これに加えて、追加の多重比較補正方法を組み合わせてはいけません。
   3. 統計的有意意を一様に p < 0.05 と定義します。

結果

歩行分析
歩行サイクルパラメータ:スイング/スタンス比は、体重を支えないスイングフェーズと単一歩の体重をかけるスタンスフェーズの比率として定義され、体重負荷と推進のバランスを反映するために評価されました。対照群(2.10 ± 0.06)と比較して、関節内注射を受けたマウス(1.45 ± 0.05)または過度な運動を受けたマウス(1.68 ± 0.05)は、スイング/スタンス比が有意に低かった。この減少はコラーゲン酵素+過剰運動群で最も顕著で(0.93 ± 0.05)、コラーゲン酵素群または過剰運動群単独(p < 0.05)と比較して最も顕著であることに注目に値します( 図2参照)。

距離パラメータ:距離パラメータには、歩幅長(1歩で前進する直線的な前進距離)と歩幅(ピーク時の反対側後足の内側の横断間距離)が含まれていました。対照群(歩幅:2.01 ± 0.23 cm;歩幅:1.97 ± 0.26 c...

ディスカッション

本研究では、関節への過度なストレスの影響を模倣する新しいマウスモデルを開発しました。関節内注射コラーゲン酵素と車輪による疲労誘導トレーニングを組み合わせて。これらの発見は、KOAが生物学的要因と機械的要因の相互作用から生じるという考えを改めて裏付けています。これらの要因を理解し特定することで、個別化された治療計画や予防戦略を立て、膝変形性関節症に苦しむ人々の症状緩和と生活の質を向上させることが期待されます^。さらに、コラーゲン酵素は腱や靭帯内のコラーゲンマトリックスを劣化させ、関節の不安定性を引き起こす可能性があります¹⁴。過度の運動は機械的過負荷を引き起こし、最終的にKOA¹⁵を引き起こす可能性があります。従来のKOAモデルと比べて、このモデルは病原性の観点から人間機械的に誘導されたKOAにより近い特徴を示しました。さらに、関節内コラーゲン注射と10週齢の幼獣における過度な運動を組み合わせることで、数週間以内に高齢マウスの自然発...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4%パラホルムアルデヒド固定液	ビヨタイム	P0099
酢酸	シノファーム	631-61-8
マウス用DigiGaitイメージングシステム	RWDライフサイエンス	ミシ・ディグ・ミス
EDTA解	プロセル	PB180320
埋め込みカセット	ライカ	IP C
エタノール	シノファーム	64-17-5
速い緑色ステイン	レイアン	1085995
脱毛クリーム	ヴェート	G20161330
ヘマトキシリン	アダマス	61753A
高速冷蔵遠心分離機	ヘルムレ	Z366K
インキュベーター	タイテック	M-210FN
吸入麻酔装置	レンジャー	RZ-バイキング
イソフルラン	Webio	W100
ミクロトーム	テッド・ペラ	10180-220
マウス回転型疲労装置	北京知樹多宝生物技術	YLS-10B
中性バルサム	シノファーム	96949-21-2
サフラニン・オー・ステイン	バイオス	S0062
半自動組織埋め込みセンター	サーモ・フィッシャー	ヒストスター
スライド乾燥ホットプレート	電子顕微鏡科学	XH-2002
組織浮遊水浴	バイオベース	BT-I
タイプIIコラーゲン酵素	シグマ・オルドリッチ	C4-22-1G
スライド全体スキャナー	ライカ	アペリオ・ヴェルサ
キシレン	シノファーム	1330-20-7