方法論記事

酸化的マイオファイバー挙動の評価のための単一線維分離アッセイ

534 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/70637

⸱

2026年3月31日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Health Promotion Sciences, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, 2Department of Immunology, Graduate School of Medicine, Juntendo University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、酸化性のヒメスから完全な単一筋繊維を分離し、これらの繊維から得られる高度に精製された筋芽細胞培養を確立することを記述しています。最適化された手法により、マウスあたり約300〜500本の完全な筋線維を確実に取得でき、下流の分子および細胞解析が可能になります。

要約

骨格筋は多核筋繊維で構成されており、その完全性と機能は運動や全体的な健康に不可欠です。神経筋疾患では、筋肉群は疾患の種類や段階によって異なる影響を受けるため、代表的な筋肉から生存可能な単一線維を分離して機構的な研究を行うことが重要です。このプロトコルの目的は、線維の長さと脆弱性のために解離が難しいマウス・オラ筋(SOL)から、完全な単一筋線維を高収量で分離する信頼性の高い方法を提供することです。コラーゲン酵素濃度と消化時間を最適化することで、このプロトコルは繊維の損失を最小限に抑え、解離時の生存能力を維持します。最適化されたワークフローにより、孤立した線維への残留組織の結合が大幅に減少し、非線維細胞のキャリーオーバーを抑え、細胞間汚染を最小限に抑えます。この技術は単一ファイバー解析や衛星細胞の分離およびその後の増殖に適しており、汚染が最小限の条件下で行われます。この最適化されたワークフローを用いることで、約300〜500本の無傷SOL由来の単一筋繊維を例行的に得て、高効率に免疫標識が可能で、線維芽細胞汚染を最小限に抑えた高品質な衛星細胞群を得ることができます。長伸筋筋(EDL)を用いた比較解析を用いて、神経筋疾患研究における治療法を評価するために、筋肉特有の個別アプローチの価値を強調し、候補薬剤介入を小さく調整可能な実験ウィンドウ内で検証することを可能にします。

概要

骨格筋は人体で最も豊富な組織であり、全体重の約40〜50%を占めます。骨格筋はグリコーゲンという形でエネルギーの貯蔵庫として機能します。寒冷地に曝露している間は、熱発生によって熱を供給し、重要なことに移動を担います。骨格筋は多核化した有糸分裂後筋線維で構成されています。筋肉の成熟と修復を維持するために、骨格筋の常駐幹細胞であるサテライト細胞(SC)によって新しい筋核が生成されます。SCは出生後の骨格筋線維2,3,4の周辺に見られます。SCは転写因子Pax7によって識別され、静止状態と活性化状態の両方で発現します3,5。損傷や肥厚刺激時、SCは筋骨筋を活性化・アップレギュレーションし、筋源プログラムに入り増殖し、最終的に既存または新たに形成される筋線維と融合して筋肉機能を回復します6,7,8。SCは幹能力、胚起源(体性・非体性)、出生後成長段階(若年・高齢)、筋肉構成(速い線維か遅い線維)において多様です9,10,11。

体の部位によって、骨格筋はその部位のエネルギー的・機能的要件に合わせて調整されます。この筋繊維の不均一性は、その収縮性と酸化能力によって起こり得ます。実際、筋繊維は遅いけれん活性化線維(タイプIおよびIIaと呼ばれる)と速収縮する糖分解線維(齧歯類ではIIxと呼ばれる)から構成されています12,13。この美しく機能的な繊維タイプのモザイクは、私たちが日常生活で自由に動くことを可能にしています。例えば、ヒメ筋(SOL)や脊髄起立筋のような姿勢筋は慢性的かつ低レベルの活性化状態にあり、ゆっくりとした酸化性のタイプIおよびタイプIIa筋繊維を多く含んでいます。対照的に、長伸筋(EDL)のような短くも速効性のある筋肉は、主に解糖系のIIX型およびIIb型線維で構成されています。しかし、繊維の組成は固定されていません。むしろ筋繊維は、機能的要求に応じて速さから遅速へ、またはその逆へと変化できる動的な構造です。食物繊維タイプの収縮性の違いは、ミオシンタンパク質の含有量によって起こり得ます。これは骨格筋内の主要なタンパク質であり、ミオシンの軽鎖および重鎖のアイソフォームで構成されています12,14。

筋肉の中で力を発生させる最小の機能単位であるサルコメア内で、ミオシンの頭部とアクチンが相互作用してクロスブリッジと呼ばれる構造を形成します。ATPの加水分解により、ミオシンとアクチンの相互作用のサイクルによってエネルギーが放出されます15,16。ミオシン重鎖(MyHC)は繊維タイプ識別に最も適したマーカーです12,13。MyHCのアイソフォームによって、筋肉の収縮率は異なります。前述の通り、タイプI繊維はタイプII繊維とは異なり、酸化が遅い繊維です。タイプI優位の筋肉群は酸化酵素の量が高く、ミトコンドリアも豊富で、筋肉を灌流するための密集した毛細血管網を持っています(マラソンランナーを想像してください)。タイプI線維はMYH7遺伝子13,19によってコードされています。タイプII線維は疲労に早く、解糖酵素の割合が高く、短縮速度も大きいため、短時間のパワーや動き(パワーリフターのような)に理想的です。齧歯類ではタイプIIa、IIx、IIbのタイプII線維は、それぞれMYH2、MYH1、MYH4遺伝子によってコードされています(20,21)。当然のことながら、筋肉の健全性に影響を与える病態生理学的な損傷は、繊維の組成を変え、筋肉機能に悪影響を及ぼし、生活の質を低下させる可能性があります。実際、多くの筋ジストロフィーはサテライト細胞(サテライト細胞オパシー)または筋繊維(運動ニューロンまたは筋組織由来)で始まり、線維タイプ22、23、24、25のシフトを引き起こすことがあります。例えば、脊髄損傷、安静研究、宇宙飛行(微小重力)では、長期的な不運動が姿勢筋を遅い線維から速い線維の表現型へと変化させるトリガーがあることを示しています(26,27,28,29,30)。逆に、デュシェンヌ型筋ジストロフィーでは、ヒトモデルおよびマウスモデル(mdx)において、速い解糖線維は遅いものよりも影響が大きく、重症度も高くなります(31,32,33,34)。同様に、顔蓋上腕上腕性筋ジストロフィー(FSHD)では、タイプI線維の割合が高く、タイプII線維の力の産生が低下するとともに、速いから遅い筋肉への移行が観察されます(24,35,36)。

なぜ特定の筋繊維タイプが異なる疾患で選択的に影響を受けたり、免れたりするのかは依然として不明です。これらのパターンが非ランダムであるという事実は、単一繊維分離が強力かつ広く使われている技術として浮上した基盤となるメカニズムの解明の重要性を強調しています。実際、1980年代半ばにビショフ37によって初めて導入されて以来、この不可欠なツールは継続的に洗練・適応され、筋肉生物学の調査精度がますます高まっています。重要なのは、単一線維分離によりSCを生理学的ニッチにできるだけ近づけ、分子活性を十分に観察できることです。フレビス屈筋(FDB)やEDLなどの筋肉群は比較的容易に抽出できますが、SOL筋は依然として豊富な線維集団を得るのが最も難しい筋肉の一つです。これは剛性、長い繊維長、そして損傷に対する感受性によるものです。これに対処するため、本研究では、SOL筋の分離が非常に困難なこの筋から高品質で実用的な繊維集団を強固に生成する技術が最適化されました。EDL線維分離と組み合わせることで、異なる筋肉群から線維や派生細胞(サテライト細胞、筋芽細胞、筋管)を培養することが可能になります。特に、このプラットフォームは多様な筋肉の病変に異なる要因に寄与する分子因子を体系的に調査し、筋肉タイプ特異的な反応を明らかにし、最終的には骨格筋疾患の効果的な治療法の開発を支援する強力な手段を提供します。

プロトコル

すべての動物は東京都立大学の動物施設に収容されていました(許可番号:A4-4、A5-9、A6-7、A7-018)。すべての動物は特定の病原体フリー(SPF)条件下で飼育されました。本研究で用いられた動物の取り扱いおよび実験手順は、東京都立大学安全倫理委員会の指針に厳格に従っていました。

1. 試薬の調製

  1. 終身手袋を着用してください。25 mLの遠心分離機チューブで、高グルコースのドゥルベッコ改良イーグル培地(DMEM)+グルタMAXに、1%ペニシリン-ストレプトマイシン-アンフォテリシンB懸濁液(AB)を含んでコラゲナーゼタイプI溶液0.5%を準備します。コラーゲナーゼが十分に溶けた後(必要に応じて軽くチューブを叩いて)、0.22μmの低タンパク質結合フィルターで溶液を消毒します。
    注:2.5mLのコラーゲナーゼ溶液は、2匹のオオヤシ(マウス1匹)に十分です。
  2. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に5%の牛血清アルブミン(BSA)10 mLを調製します。60°Cで30分間熱不活化し、その後0.22μmの低タンパク質結合フィルターで溶液をろ過します。
    注:PBS溶液中の5% BSAは4°Cで最大10日間保存可能です。

2. ヒメ筋の解離

  1. 筋肉解離用のレイアウト機器(図1A)。
  2. C57BL/6マウスに、メデトミジン塩酸1mg/mL、ミダゾラム5mg/mL、酒石酸ブトルファノール5mg/mLを含む三重麻酔混合物(0.5 mL/g体重)を腹腔内注射して麻酔し、その後頸椎脱臼による安楽死を行います。
  3. 後肢に連続した皮膚切開を行い、皮膚を剥がします。表面の筋膜を取り外してください。
  4. 足底筋(PLA)腱を腓腹筋(GAS)およびヒラ筋筋(SOL)腱束から分離します。腱からPLAを優しく引き抜きます(図1B)。
  5. GAS腱とSOL腱の束を切断し、筋肉を露出させます。GASとSOLの近位腱の間の隙間にピンを挿入します(図1C)。
  6. 慎重に針を遠位端に滑らせて、SOL筋とGAS筋を分離します(図1D)。
  7. GAS側から腱束を切断します(図1E)。
  8. ガスのせいで最後の時間を稼ぎましょう。SOLの位置を慎重に調整して近位腱を露出させ、マイクロハサミで切断します(図1F)。
  9. SOLを解剖台に置き、残った腱を除去します(図1G)。
    注意:このステップは任意です;残った腱は結果に影響を与えません。

3. ヒズメ筋の消化

  1. 無傷のヒラメを、準備済みの0.5%コラーゲン酵素溶液を含む25mL遠心分離機チューブに移します。37°Cで130分間孵化します。
    注:15〜20分ごとに手動で攪拌して繊維をわずかに分離し、コラーゲン酵素活性を支えます。

4. 立体顕微鏡下での単一線維の分離

  1. パスツールピペットを2つカットし、1本のボアと1本の狭い開口部のピペットを作成します(図2A)。炎下では、筋肉損傷を防ぐために穴を消毒し滑らかにします。
  2. 隔離中の繊維接着を防ぐために、パスツールピペットと50mmペトリ皿3皿に5%のBSA/PBSを塗布してください。
    注:分離工程全体では立体顕微鏡(図2B)が使用されました。
  3. 筋肉消化後、余分なコラーゲン酵素溶液を捨て、1% ABのDMEMを含む最初の皿にヒミサミを移します(図2C)。
  4. 広口径パスツールピペットを使い、優しく上下にすすいで線維を解離させます(図2D)。
  5. 狭口径のパスツールピペットを使い、筋繊維の長さに沿って無傷の単線維を2皿目に移します。ここで、ゴミや縮んだ繊維を除去する機会にしてください(図2E、F)。
  6. 高品質(全長・完全な)単線繊維を3皿目に移し、狭口径パスツールピペット(図2G,H)で純度を確保します。
  7. 繊維をBSAコーティングされた25mL遠心分離機チューブに集めます。懸濁液を優しくかき混ぜ、室温で5分間置いて繊維がチューブの底に沈殿するのを待ちます。
  8. 狭口径のパスツールピペットを使い、上澄液を慎重に捨て、残ったゴミを取り除きます。約500μLのDMEMを1%AB溶液で残します。この沈殿物には、高度に精製された単一筋繊維の集団が含まれる(図2G,H)。
    注:この技術は300本>単線繊維を得ることができ、その後タンパク質やmRNAの抽出およびその後の解析に利用できます。

5. ハイプス繊維から高純度のマイオブラスト培養の確立

  1. マトリゲルマトリックスを0.1 mg/mLに希釈し、100mmの培養皿をコーティングします。37°Cで30〜60分間培養し、コーティングが均一に重合するまで加熱します。
  2. 筋繊維の懸濁液に同量のアキュターゼを加え、室温で10分間培養します。続いて、10mLの成長培地(30%胎児牛血清、1%グルタMAX、1%鶏胚抽出物、CEE、1% AB、0.01 μg/mLの塩基線維芽細胞成長因子bFGF)を含むグルコースフリーDMEMで構成されています。
    注:この場合、同量のアキュターゼはセクション4.8に記載されている500μLです。アキュターゼは筋繊維の穏やかな解離を促進し、サテライト細胞の放出を助け、その後の筋芽細胞の増殖を支援します。
  3. アキュターゼ処理された筋繊維懸浮液10mLをマトリジェルコーティング皿に移します。100mmの培養皿に約4本の単線繊維/cm² が加えられます。繊維が培養皿全体に均等に広がっていることを確認してください。
  4. 培養培地で3日間放置すると、筋芽菌コロニーが観察されます。成長培地は毎日交換し、筋芽細胞が必要な個体数に達するまで続けます。通常、6日目までにミオブラス培養は実験段階に十分な合流性を持ちます(図3A)。
  5. トリプシンを使って元の培養皿からミオブラストを剥離し、37°Cで2分間培養します。ヘモサイトメーターを使い、筋形成進行に必要なウェルサイズと細胞の合流度に応じて細胞と種子を数えます。
    注意:100mmの皿の場合は、トリプシン1mLを加えます。

結果

本技術により、単離された線維(SOL)および長伸筋(EDL)の線維がPax7に対して効率的に免疫標識できることが示されています(図3B)。これらの分離された繊維は、DMEM + GlutaMAXと10%ホースセラム、1% AB、0.5% CEEからなる浮遊培養培地に3日間保管し、その後免疫標識を施します(図3B)。浮遊繊維を4日以上保持するのは推奨されません。上記の浮遊繊維条件下では、筋繊維はこの時間後に凝集しやすく、その後の免疫標識解析に影響が及ぶ。

提示された技術は、筋原プログラム全体にわたる免疫ブロッティングにもさらに用いられます(図3C)。実際、SOLおよびEDL由来の筋芽細胞は約70%の合流率で24ウェルプレートにプレートされていました。細胞は培養培地で1日間維持された(筋芽細胞)、または2日間または4日間分化を誘導された(それぞれ早期形成および分化した筋管)。免疫ブロッティング解析のために5μgのタンパク質をロードしました。

MyHC Iの発現はほぼ特異的にSOL由来の筋繊維で発現し、筋管内での発現は最小限で、筋芽細胞では無視できるほどでした(図3C)。MyHC IIはSOLおよびEDL筋線維の両方で発現しました。この式は主にタイプIとIIaからなるSOLを反映し、EDLは主にIIxおよびIIbの線維で構成されています。MyoblastsはMyHC IIを発現しませんでしたが、分化過程でその発現が徐々に増加しました。酸化関連タンパク質であるPGC-1αとCOXIVは、SOL由来繊維での期待される高い発現を示しました。また、単離SOL線維ではEDL線維よりもGLUT4の発現が高いことが検出されました。骨格筋生物学者が直面する可能性のある問題は、α-チューブリン、βアクチン、GAPDH、ポンソーSを含む全タンパク質染色などの広く使われているハウスキーピングタンパク質や負荷制御が、筋芽細胞、筋管、孤立筋繊維間で安定しず、それぞれに明確な変動を示すことです。α-チューブリンおよびβ-アクチンの信号強度はマイオチューブで最も高く、ポンソーS染色は筋芽細胞で比較的弱かった。対照的に、GAPDHはEDL筋繊維でより強い発現を示しました。それでも、実験目的によっては、これらのハウスキーピングタンパク質のうちの1つが依然として適用可能であり、熱ショックタンパク質70(HSP70)などの正規化因子も検討可能です。

図1
図1。ヒメ筋の解離。(A) 解剖に必要な機器。1:マイクロハサミ、2:細い鉗子、3:解剖用のハサミ、4:解剖ピン。(B)PLA腱はGASおよびSOL腱束から切断されました(黄色の矢印)。遠位のPLA(白い矢印)腱は鉗子で持ち上げられました。(C) SOL(赤い矢印)とGAS(緑の矢印)の近位腱の間の空間に解離ピンを挿入した。(D) SOLが解剖ピンでGASから分離された。(E) GAS側でGASおよびSOL腱束を切断した。(F)その後、SOL近位腱をマイクロハサミで切断しました。(G)追加の遠位腱束も除去されました。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2
図2。ヒメ筋線維の単離。(A) 隔離に必要な機器。1:狭口径、2:広口径パスツールピペット。(B) 分離に用いられる立体顕微鏡。(C) コラゲン酵素で消化されたヒヤメウスを1%ABでDMEMに移管した。(D) 最初の10回の洗浄セッション後に筋肉から分離したヒヤメ筋線維。(E) 単一繊維が第2皿に移される。(F) 破片や縮んだ繊維がきれいに除去された画像。(G)ゴミのない単線繊維が3番目の皿に移されました。(H)無傷の単線繊維がはっきりと見える。スケールバー=10mm。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図3
図3。細胞培養の拡大およびEDLおよびSOL由来サンプルの解析。(A) 分離後6日後、増殖培地培養サンプルは、分離されたイモリウス繊維から得られた純粋な筋芽細胞培養を示します。スケールバー=100μm(B)SOLおよびEDL由来の単一線維は、分離直後または3日後にPax7(緑色)に免疫標識されたサテライト細胞を示しています。MyoD(赤)の不在は、衛星細胞がまだ筋生成活性化にコミットしていないことを裏付けています。繊維はDAPI(青)でカウンターステインされました。その後、細胞は蛍光顕微鏡で観察されました。スケールバー=20μm(C)では、マイオブラスト、マイオチューブ、マイオファイバー由来サンプルの免疫ブロットに5μgのタンパク質が使用されました。免疫ブロッティングパネルでは、MyHC I、MyHC II、PGC-1α、COX IV、GLUT4、α-チューブリン、βアクチン、GAPDHがハウスキーピング/正規化標的として用いられました。ポンソーS染色は総タンパク質ローディング制御に使用されました。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

多くの筋繊維をヒズレ筋から分離する最初の鍵(SOL)は、解離中に筋肉の構造的な完全性を維持することです。SOLの上筋膜が断裂されたり、特に縦軸に沿って筋肉が強く引っ張られたりすると、分離収率は著しく低下します。これらの解剖エラーは通常、後で簡単に特定できます。実際、コラーゲン酵素の消化後、筋肉は均一に縮小し、白く緻密な塊を形成します。このような条件下では、解離できる生存可能な線維は非常にごくわずかです。

ヒラメス単離の成功の第二の決定的要因は、タイプIコラーゲナーゼの消化効率です。コラーゲナーゼが最適に作用している場合、最初の10回のリンスセッションで約100〜200本のオオヤシ線維が得られます。対照的に、消化が最適でない場合、最初の20回の洗浄後でも50本未満の繊維が放出されることがあります。より高い繊維収量を得るには、より激しいすすぎと追加のすすぎサイクルが必要です。しかし、SOL繊維は非常に脆いため、すすぎ時に繊維が縮むことがよくあります。

純粋なSOL由来の一次性筋芽菌培養を確立するためには、コラーゲン酵素の消化が再び重要な役割を果たします。消化が効率的に行われると、残留組織に付着する繊維が少なく、培地への移送で線維芽細胞の汚染は最小限に抑えられます。対照的に、SOLがうまく消化されていないと、解離した繊維が残留組織に付着し、筋芽細胞を線維芽細胞で汚染します。研究者はシード細胞サンプルの典型的な線維芽細胞汚染の兆候を探すべきです。これには、接着したマトリゲル被覆皿のはるかに小さい紡錘状の衛星細胞と比べて、はるかに大きな細胞サイズと広範な細胞骨格突出が含まれます。汚染が発生した場合、研究者は他の部分で説明されているように細胞に事前プレート処理を行うことができます。簡単に言うと、SCは分離後3日間培養され、その後トリプシン処理され、コラーゲンコーティングされた皿に短時間プレプレートされます。15〜30分の培養期間中、線維芽細胞は粘着し、SCは懸浮したまま新鮮なマトリゲル被覆プレートに移されます。

前述の通り、私たちの経験と一致して、SOL線維は長伸筋(EDL)や短屈筋(FDB)の線維よりも長く、より脆弱です。そのため、パスツールピペットによる繊維の移動は困難です。繊維は中央から引くのではなく、縦軸に沿って吸引することが不可欠です。そうしないと、繊維は応力で折りたたまれて収縮します。繊維分離の成功を直接決定する決定的な要素に加え、ヤメリウス繊維収量を向上させるためにはいくつかの追加の技術的ステップが不可欠です。その一つは、すべてのパスツールピペット、皿、採集チューブに5%のBSAをコーティングすることです。これにより、新たに解離した筋繊維が表面に付着するのを防ぎ、繊維の折りたたみやそれに伴う収縮を防ぎます。筋肉サンプルを分離するたびに、熱滅菌されBSAコーティングされた新しいパスツールピペットを準備することが推奨されます。あるいは、研究者は長期使用用にパスツールピペットのセットを準備することも可能です。もしそうなら、毎回加熱で滅菌し、使用前にBSAで新たにコーティングしてください。

従来の単一筋線維分離プロトコルは、主にFDBやEDL37などの解糖筋に最適化されていました。しかし、SOLのような酸化筋は構造的に異なります。トランスクリプトミクス解析により、細胞外マトリックス(ECM)関連の遺伝子発現はSOLとEDLで異なり、骨格筋の細胞骨格連結タンパク質であるジストロフィンなども含まれます。したがって、0.2%(2 mg/mL)コラーゲン酵素を用いたEDL筋肉消化の標準的な条件は、SOL筋には最適ではなく、消化後に繊維束が圧縮されたり縮んだりします。本研究では、酸化性SOL筋にプロトコルを適応させるためのいくつかの重要なステップを最適化しました。タイプIコラーゲン酵素濃度を0.5%(5 mg/mL)に調整し、潜伏期間を130分に延長し、洗浄時の機械的ストレスを最小限に抑えることで、1匹のマウスから300〜500本の完全な線維を安定して取得できます。EDLと比較して、SOLサンプルの繊維数と収率は少なく(EDLは>500本の繊維を採取できます)、それにもかかわらず、当社のSOL由来繊維の繊維数と、特に高品質は堅牢であり、免疫標識や免疫ブロッティングなどの下流用途に適しています。私たちの免疫ブロッティング結果は単線繊維サンプルをまとめたものでしたが、本報告で紹介された技術は、免疫ブロッティング、プロテオミクス、RNAシーケンス47 などの後継用途に適合し、単一繊維分解能で利用可能です。この技術を用いて、酸化筋線維と解糖筋線維の代謝および収縮性の違いを研究できます。

総じて、このプロトコルは、無傷の酸化線維をイラウ筋から分離する再現可能かつアクセスしやすい方法を提供し、筋繊維の種類特異的な生理学や分子メカニズムを調査するためのツールキットを拡充しています。

開示事項

著者には利益相反を主張するものはありません。

謝辞

この研究は、科学技術イノベーションの創出に向けた大学フェローシップの設立(JST、助成金番号)によって支えられました。JPMJFS2139からT.H.へ)また、日本学術振興会からの助成金(KAKENHI 23H00457、N.L.F.に授与、20J12849にY.Mi.、24K22254にY. Maに授与)も受けています。本研究はまた、東京都庁の先進研究助成金[R2-2](Y.Ma.、NLF)およびTMUの革新的研究プロジェクト戦略研究基金[R3](N.L.F.)の支援を受けています。古市康郎氏の助言と有益なコメントに感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Basic fibroblast growth factorPeprotech450-33
Bovine serum albuminSigmaA9418
Butorphanol tartrateMeiji Yakuka Co., Ltd711-12製品名：Vetorphale注射
Chicken Embryo ExtractUS BiologicalC3999
Collagenase type IWorthingtonM9B2717
DAPISigma-AldrichD9542
Fetal bovine serumGibco10437-028
Glucose-free DMEMGibcoA14430-01
GlutaMAXGibco10569
High-glucose DMEM+GlutaMAXGibco10569-010
Horse serumLife technology16050-130
Low-protein binding filterMilliporeSLGVR33RB
MatrigelCorning354230
Medetomidine hydrochlorideKyoritsu Seiyaku Co., Ltd8816製品名：Dorbene注射
MidazolamMaruishi Pharmaceutical Co., Ltd4987211762100製品名：Dormicum注射
Penicillin-streptomycin-amphotericin B suspensionWako161-23181
Ponceau S stain solutionSigma-Aldrich24-3875-5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056
Equipment
Centrifuge tubes (25 mL)IWAKI2362-025
Fluorescence microscopeKeyenceBZ-X810
Pasteur pipettesIWAKI5 3/4 IK-PAS-5P
StereomicroscopeLeicaM165C
Sterilin dishes (100-mm)Thermo Scientific3020-100原稿ではペトリ皿として参照
Anbitodies for immunolabelling
Goat anti-mouse (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-327231:400
Goat anti-rabbit (H+L), Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-110121:400
Mouse Anti-Myosin Heavy ChainR&D SystemsMAB44701:400
Mouse Anti-Pax7DSHBAB-5284281:100
Rabbit Anti-MyoDSanta Cruz Biotechnologysc-7601:100
Anbitodies for immunoblotting
HRP-conjugated Anti-mouse IgGCytivaNA9311:1000/馬蹄鉄ペルオキシダーゼ
HRP-conjugated Anti-Rabbit IgGCytivaNA9341:1000/馬蹄鉄ペルオキシダーゼ
Mouse Anti-MyHC ISigmaM84211:1000/ Myosin Heavy Chain I
Mouse Anti-MyHC IISigmaM42761:1000/ Myosin Heavy Chain II
Mouse Anti-PGC-1αSanta Cruz Biotechnologysc-5173801:1000/ Pparg coactivator 1 alpha
Mouse Anti-α-tubulinCell Signaling Technology#38731:1000/ Alpha tubulin
Rabbit Anti-COXIVCell Signaling Technology#48501:1000/ Cytochrome c oxidase IV
Rabbit Anti-GAPDHCell Signaling Technology#22181:10000/ Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase
Rabbit Anti-GLUT4Cell Signaling Technology#22131:1000/ Glucose Transporter 4
Rabbit Anti-β-actinProteintech20536-1-AP1:2000/ Nonmuscle Beta-actin

参考文献

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18–88 yr. J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).
  2. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9 (2), 493-495 (1961).
  3. Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. The skeletal muscle satellite cell: The stem cell that came in from the cold. J Histochem Cytochem. 54 (11), 1177-1191 (2006).
  4. Zammit, P. S., et al. Pax7 and myogenic progression in skeletal muscle satellite cells. J Cell Sci. 119 (9), 1824-1832 (2006).
  5. Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
  6. Günther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  7. Gnocchi, V. F., White, R. B., Ono, Y., Ellis, J. A., Zammit, P. S. Further characterisation of the molecular signature of quiescent and activated mouse muscle satellite cells. PLoS One. 4 (4), e5205(2009).
  8. Halevy, O., et al. Pattern of Pax7 expression during myogenesis in the posthatch chicken establishes a model for satellite cell differentiation and renewal. Dev Dyn. 231 (3), 489-502 (2004).
  9. Biressi, S., Rando, T. A. Heterogeneity in the muscle satellite cell population. Semin Cell Dev Biol. 21 (8), 845-854 (2010).
  10. Zammit, P. S. All muscle satellite cells are equal, but are some more equal than others. J Cell Sci. 121 (18), 2975-2982 (2008).
  11. Ortuste Quiroga, H. P., Fujimaki, S., Ono, Y. Pax7 reporter mouse models: A pocket guide for satellite cell research. Eur J Transl Myol. 33 (4), (2023).
  12. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  13. Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
  14. Ahmetov, I. I., Vinogradova, O. L., Williams, A. G. Gene polymorphisms and fiber-type composition of human skeletal muscle. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 22 (4), 292-303 (2012).
  15. Guth, L., Samaha, F. J. Qualitative differences between actomyosin ATPase of slow and fast mammalian muscle. Exp Neurol. 25 (1), 138-152 (1969).
  16. Aguilera-Alcala, N., Morales-Reyes, Z., Martin-Lopez, B., Moleon, M., Sanchez-Zapata, J. A. Role of scavengers in providing non-material contributions to people. Ecol Indic. 117, 11(2020).
  17. Sullivan, S. M., Pittman, R. N. Relationship between mitochondrial volume density and capillarity in hamster muscles. Am J Physiol. 252 (1), H149-H155 (1987).
  18. Fujita, N., et al. Changes in lipid metabolism and capillary density of the skeletal muscle following low-intensity exercise training in a rat model of obesity with hyperinsulinemia. PLoS One. 13 (5), e0196895(2018).
  19. Narusawa, M., et al. Slow myosin in developing rat skeletal muscle. J Cell Biol. 104 (3), 447-459 (1987).
  20. Faerman, A., Shani, M. The expression of the regulatory myosin light chain 2 gene during mouse embryogenesis. Development. 118 (3), 919-929 (1993).
  21. Denardi, C., et al. Type 2x-myosin heavy chain is coded by a muscle fiber type-specific and developmentally regulated gene. J Cell Biol. 123 (4), 823-835 (1993).
  22. Ciciliot, S., Rossi, A. C., Dyar, K. A., Blaauw, B., Schiaffino, S. Muscle type and fiber type specificity in muscle wasting. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2191-2199 (2013).
  23. Talbot, J., Maves, L. Skeletal muscle fiber type: Using insights from muscle developmental biology to dissect targets for susceptibility and resistance to muscle disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (4), 518-534 (2016).
  24. Celegato, B., et al. Parallel protein and transcript profiles of FSHD patient muscles correlate to the D4Z4 arrangement and reveal a common impairment of slow to fast fibre differentiation and a general deregulation of MyoD-dependent genes. Proteomics. 6 (19), 5303-5321 (2006).
  25. Ganassi, M., Muntoni, F., Zammit, P. S. Defining and identifying satellite cell-opathies within muscular dystrophies and myopathies. Exp Cell Res. 411 (1), 112906(2022).
  26. Gallagher, P., et al. Effects of 84-days of bedrest and resistance training on single muscle fibre myosin heavy chain distribution in human vastus lateralis and soleus muscles. Acta Physiol Scand. 185 (1), 61-69 (2005).
  27. Grimby, G., Broberg, C., Krotkiewska, I., Krotkiewski, M. Muscle fiber composition in patients with traumatic cord lesion. Scand J Rehabil Med. 8 (1), 37-42 (1976).
  28. Shenkman, B. S. From slow to fast: Hypogravity-induced remodeling of muscle fiber myosin phenotype. Acta Naturae. 8 (4), 47-59 (2016).
  29. Ohira, T., Kawano, F., Goto, K., Ohira, Y. Responses of skeletal muscles to gravitational unloading and/or reloading. J Physiol Sci. 65 (4), 293-310 (2015).
  30. Higashino, K., et al. Early changes in muscle atrophy and muscle fiber type conversion after spinal cord transection and peripheral nerve transection in rats. J Neuroeng Rehabil. 10, 46(2013).
  31. Webster, C., Silberstein, L., Hays, A. P., Blau, H. M. Fast muscle fibers are preferentially affected in Duchenne muscular dystrophy. Cell. 52 (4), 503-513 (1988).
  32. Pedemonte, M., Sandri, C., Schiaffino, S., Minetti, C. Early decrease of IIx myosin heavy chain transcripts in Duchenne muscular dystrophy. Biochem Biophys Res Commun. 255 (2), 466-469 (1999).
  33. Rafael, J. A., et al. Dystrophin and utrophin influence fiber type composition and post-synaptic membrane structure. Hum Mol Genet. 9 (9), 1357-1367 (2000).
  34. Kotelnikova, E., et al. Novel approach to meta-analysis of microarray datasets reveals muscle remodeling-related drug targets and biomarkers in Duchenne muscular dystrophy. PLoS Comput Biol. 8 (2), e1002365(2012).
  35. Banerji, C. R. S., Zammit, P. S. Pathomechanisms and biomarkers in facioscapulohumeral muscular dystrophy: Roles of DUX4 and Pax7. EMBO Mol Med. 13 (8), e13695(2021).
  36. Lassche, S., et al. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Neurology. 80 (8), 733-737 (2013).
  37. Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Dev Biol. 115 (1), 129-139 (1986).
  38. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (10), 773-779 (1995).
  39. Collins, C. A., Zammit, P. S. Isolation and grafting of single muscle fibres. Methods Mol Biol. 482, 319-330 (2009).
  40. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system—a more mature muscle culture system. Cell Motil Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  41. Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods Mol Biol. 946, 431-468 (2013).
  42. Smith, L. R., Meyer, G. A. Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment. Connect Tissue Res. 61 (3-4), 248-261 (2020).
  43. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skeletal Muscle. 8 (1), 14(2018).
  44. Omairi, S., et al. Regulation of the dystrophin-associated glycoprotein complex composition by the metabolic properties of muscle fibres. Sci Rep. 9 (1), 2770(2019).
  45. Moyle, L. A., Zammit, P. S. Isolation, culture and immunostaining of skeletal muscle fibres to study myogenic progression in satellite cells. Methods Mol Biol. 1210, 63-78 (2014).
  46. Hettige, P., Tahir, U., Nishikawa, K. C., Gage, M. J. Comparative analysis of the transcriptomes of EDL, psoas, and soleus muscles from mice. BMC Genomics. 21 (1), 808(2020).
  47. Blackburn, D. M., Lazure, F., Soleimani, V. D. RNA sequencing of single myofibers from Mus musculus. Bio Protoc. 10 (4), e3525(2020).

再版と許可

タグ

酸化的マイオファイバー挙動の評価のための単一線維分離アッセイ
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。