線形イオントラップ質量分析法に基づく、ホオシャン正奇口腔液体中の未知化合物の構造解析の技術的アプローチ

Summary

ここでは、多段階質量分析木と火翔正奇経口液体に基づく断片化プロセスを組み合わせた標準プロトコルを示します。

Abstract

中国漢方化合物(CHC)は中国医学においてかけがえのない役割を果たしており、その複雑な成分の特定は近年重要な研究重点となっています。火香正気の経口液体は、分子レベルでさらなる研究が必要な中国の古典的な特許薬です。従来の質量分析計、例えば飛行時間分析儀やオービトラップ分析儀は、通常は二次的な断片情報のみを提供します。線形イオントラップ質量分析計に基づき、化合物をより詳細に分解でき、より深い断片情報を得ることができます。本論文は、試料前処理、超高性能液体クロマトグラフィー製剤、質量分析準備、フルスペクトル試験、二次質量分析試験、多層質量分析試験、結果解析を含む、未知のCHC中の構造探索技術を開発します。代表的な結果は、化合物構造の導出過程を示しています。異性体、ポリヒドロキシ化合物、機器の解像度など、実験技術に影響を与える要因について議論します。未知化合物の微小分子構造を多段階質量分析による断片解析に基づくこの確立された実験手法は、伝統中国医学における生体活性小分子の構造特性評価や薬理学的メカニズムとの関連に多用途かつ応用可能です。

Introduction

中国漢方化合物(CHC)は、伝統中国医学(TCM)の貴重な資産として、何千年にもわたる実証済みの臨床経験を蓄積しています^。彼らは疾病予防、治療介入、リハビリテーションにおいてかけがえのない役割を果たし^{ています。}マルチハーブの相乗効果を通じて、CHCは人体全体を総合的に治療し、ホリズムと症候群分化に基づく治療の核心的理念を実践しています^。現代医療の枠組みの中で、CHCは多標的経路に関与する多薬理的メカニズムで世界的に認められ^{ており、消化}器疾患、呼吸器感染症、免疫調節に広範な応用があります^。火香正気の経口液体(HXZQ)は、古典的なCHC配合の典型^です。その成分は、パチョリ、ペリラリーフ、アンジェリカ・ダフリカ、アトラクティロデス、ポリア、乾燥みかんの皮など複数の薬用ハーブを組み合わせています。発汗、熱の浄化、湿気の溶解、脾臓の胃の強硬^化効果で知られています。HXZQは、湿気誘発性インフルエンザ様症候群、上腹部膨張、嘔吐、下^{痢疾患に対して}臨床的に適用されます。技術の進歩により、CHC研究は現象学的観察から分子、機構、化合物レベルの研究へと移行^し、プロテオミクスやメタボロミクス技術を用いて活性成分を特定し、TCMグローバリゼーションの科学的基盤を築きました。したがって、HXZQの化学成分および薬理力学の厳密な分析は、CHCの標準化を推進するだけでなく、革新的な創薬の促進にも寄与^します。

HXZQは複合植物成分¹¹から化学的複雑さを得たマルチハーブ配合です。揮発性油、クマリン、リグナン、多糖類、アルカロイドなど多様な植物化学クラスを特徴とするHXZQは、よく特徴づけられた生物活性化合物と構造的に注釈のない構成要素の豊富なプールの両方を含^{んでいます。}主要成分(例:揮発性油、フラボノイド、アルカロイド)の動的な変動は抽出プロトコルや保管条件の違いにより起こり得るため、体系的な化学プロ^{ファイリングの}重要性を強調しています。伝統中国医学(TCM)の近代化の枠組みの中で、HXZQのような古典的な処方の詳細な組成分析は、その治療効果の根底にある物質的基盤を明らかにするだけでなく、品質管理、標準化された製造、有害事^{象モニタリングに対する}実証的支援も提供します。HXZQに含まれる高存在比化合物は広く記録されていますが、その化学成分のかなりの部分は未解明のままです¹³。その構成要素の構造的多様性と、多くの潜在的に生体活性分子の存在量が低いことは、クロマトグラフィーや分光法などの従来の分析技術だけで包括的な同定を困難にしています¹⁴。特筆すべきは、HXZQではクマリン、リグナン、多糖類など複数の植物化学クラスに異性体が存在し、構造的分化をさらに複雑に^{しています。}正確な複合注釈の妨げには、分析物の存在比の低さやマトリックス干渉効果があります。これらの要因を総合して、HXZQ研究における重要なフロンティアである、その全化学的補体を正確かつ高カバレッジで同定するための堅牢な分析戦略の開発を浮き彫りにしています。

現代の質量分析(MS)プラットフォームは、複雑な行列の特徴付けにおいてイオン共溶出アーティファクトや不完全なスペクトルデータベースカバレッジなど、固有の制約に直面し^{ています。}この文脈では、タンデム質量分析法(MS/MS)および多段階質量分析法(MSⁿ)が、未知化合物の 新規 構造解析に不可欠な分析戦略として浮上しています¹⁷。従来の高解像度MSシステムであるクアドルーポール飛行時間(Q-TOF)MSやOrbitrap MSは高品質なMS/MS断片データを生成しますが、その有用性は単一段階の断片化イベントに限定されます。この制約にもかかわらず、これらのプラットフォームは特に複雑な混合物の解析において、卓越した感度と解像度を持つ豊かな構造的洞察^{を提供します。}これに対し、リニアイオントラップ(LIT)MSは多段階衝突誘起解離(CID)モードを用い、分子イオンの逐次的かつ反復的な断片化を可能にします。この独自の能力により、複合骨格や官能基の段階的解剖が可能となり、構造的に多様な未知分析物の明確な定的同定を可能に^します。複雑なCHCマトリックスの包括的な特性評価の未解決ニーズに対応するため、本研究は未知の化合物同定に特化したLIT-MSベースの分析ワークフローを提示します。LITの高いイオン捕捉効率と高速なスキャン速度を活用し、このアプローチは 新規 構造注釈のスループットと精度を向上させます。このワークフローをHXZQに適用する目的は、(1) HXZQにおける未特徴化化学成分のプロファイリングにおける既存の手法を補完すること;(2) 他のCHC処方の標準化研究を支援する技術的枠組みを確立すること;(3)実証的実践からエビデンスに基づく精密医療へのTCMの転換を加速させること。

Protocol

1. サンプル前処理

1. 商用HXZQのパッケージを開けてください。HXZQを正確に0.1mLを2mLのサンプルボトルに移し、その後0.9mLの水を加えます。溶液をよく混ざるまで振ってください。
2. 注射シリンジ(1 mL)と微多孔膜フィルター(0.22 μm)を準備します。溶液を新しい2mLのサンプルボトルに濾過します。
   注意:実験的な処置中は適切な個人的注意を必ず行ってください。

2. 超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)製剤

1. Xcaliburソフトウェアをダブルクリックしてください。「ダウンロード準備」をクリックし、その後「ダイレクトコントロール」ボタンをクリックしてください。ポップアップウィンドウのポンプモジュール列をクリックし、%Bを50、%Cを0、%Dを0に設定します(図1)。
2. モーターボタンをクリックするとオン状態に切り替えられます。「More Options」ボタンをクリックし、ポップアップウィンドウで流量を5 [mL/min]、時間を180 [s]に設定してください。パージボタンをクリックし、ポップアップウィンドウのOKボタンをクリックしてください。
   注:クロマトグラフィーカラムがない場合、移動相は50%A(0.1%甲酸溶液)と50%B(アセトニトリル)を含み、カラム温度なしで0.3 mL/minで一定です。標準的な注入量は通常1μLです。

3. MS準備

1. ソフトウェアのメインウィンドウに戻り、「 シーケンスセットアップビュー 」ボタンをクリックしてください。「 Open 」ボタンをクリックして、すでに編集済みのテンプレートをインポートし、「 メソッド名 」を右クリックして「 Open File 」ボタンをクリックしてメソッドファイルを開きます。
2. ポップアップの「インストゥルメントセットアップ」ウィンドウで、最初の質量(m/z)を100、 最後の質量 (m/z)を1200に設定します。保存 ボタンをクリックして 方法を保存してください。
   注:デフォルトのMS条件はイオン源温度350°C、初期MS範囲80〜1200 Da、衝突誘導解離(CID)時の衝突モード、衝突エネルギー35°Cでした。

4. 全MS試験

1. 「 実行 シーケンス」ボタンをクリックし、ポップアップウィンドウの 「OK 」ボタンをクリックしてください。サンプル注入が完了するまで待ちます(図2)。
   注意:検査前に、2mLのサンプルボトルを器具のサンプルトレイに入れてください。
2. ロードマップビューボタンをクリックし、QualブラウザのアイコンをクリックするとQualブラウザウィンドウを開きます。「開く」ボタンをクリックし、フォルダ内の.rawフォーマットのデータファイルを選択してダブルクリックでファイルを開きます。
3. クロマトグラムウィンドウを右クリックし、次に範囲ボタンをクリックします。スキャンフィルターセクションでESIフルMSを選択してください。プロットタイプセクションでTICを選択してください。OKボタンをクリックすると、サンプルの全イオンクロマトグラムが表示されます。
4. マススペクトラムウィンドウの右上にある プッシュピン ボタンをクリックしてください。
5. クロマトグラムウィンドウでクリックしてスライドさせ、相対的な存在比が最も強い タイムリージョン を選択します。質量スペクトルウィンドウは対応する質量スペクトルイオンを表示します。次の質量分析レベルのためにm/z値を記録します。

5. MS/MSテスト

1. 機器設定ウィンドウに戻る。n=2行の親質量列に、前のステップで記録した化合物のm/z値を入力します。保存 ボタンをクリックして 方法を保存してください。
2. ソフトウェアウィンドウに戻る。シーケンス セットアップビュー ボタンをクリックし、ファイル名を変更してから 保存 ボタンをクリックしてシーケンスを保存します。
3. 「 実行 シーケンス」ボタンをクリックし、ポップアップウィンドウの 「OK 」ボタンをクリックしてください。サンプル注入が完了するまで待ちましょう。
4. Qualブラウザのウィンドウに戻る。「 開く」 ボタンをクリックし、フォルダ内の形式.rawデータ ファイル を選択し、ダブルクリックでファイルを開きます
5. クロマトグラムウィンドウを右クリックし、次に範囲ボタンをクリックします。スキャンフィルターセクションでESIフルMSを選択してください。プロットタイプセクションでTICを選択してください。OKボタンをクリックすると、サンプルの全イオンクロマトグラムが表示されます。
6. マススペクトラムウィンドウの右上にある プッシュピン ボタンをクリックしてください。
7. クロマトグラムウィンドウでクリックしてスライドさせ、相対的な存在比が最も強い タイムリージョン を選択します。質量スペクトルウィンドウは対応する質量スペクトルイオンを表示します。次の質量分析レベルのためにm/z値を記録します。

6. MSⁿ 検定

1. インストゥルメントセットアップウィンドウに戻る。n=3行の親質量列に、前のステップで記録した化合物のm/z値を入力します。保存 ボタンをクリックして 方法を保存してください。
2. ステップ4.2から4.5を繰り返してサンプル注入とデータ閲覧を完了します。安定した断片イオンが観察されなかったらMSⁿ 解析を停止します。

7. パラメータ最適化

1. インストゥルメントセットアップウィンドウに戻る。actタイプの列で CID をクリックし、 PQDまたはETD を選択して衝突モードを変更します。
2. 正規化された衝突エネルギー欄で 35 をクリックし、20または50に設定すると衝突エネルギーを変更します。
   注意:すべての化学残留物と溶剤を有機廃棄物容器に混ぜてください。

8. 結果分析

1. 図面ソフトウェアで親イオンと断片イオンを手動で描画し、親イオン構造、化合物名、質量対電荷比(m/z)値を含みます。
2. 例えば、m/z=623.21の未知化合物の場合、その結果として得られる断片化を観察します。ここで断片中間体はMS/MSでm/z=461.15でした。質量差は162.06 Daで、ヘキソース構造に対応しました。
3. さらに分析すると、中間体断片(m/z=461.15)がMS³で再び断片化され、m/z=315.09のネオビヤカンジェリコル(neobyakangelicol)が形成されます。質量差は146.06 Daで、デオキシヘキサメタロース構造に対応しました。すなわち、m/z=461.15の中間体はネオビヤカンジェリコールよりも1単位多くデオキシヘキサメタロース単位を持っていました。
4. ネオビヤカンジェリコルの構造では、結合位置を分析します。ここで、露出したヒドロキシル基がデオキシヘキサメタロースと最も関連している位置でした。同様に、デオキシヘキサメタロース単位のC1のヒドロキシル基はヘキソースと最も結びついている可能性が高いです。最後に未知化合物の構造をm/z=623.21で求めます。

Results

まずすべてのm/z情報を集計し、その後親イオンと断片イオンの質量差値を計算する必要があると提案しました。データベースや文献に報告されている化合物を見つけ、その既知の構造に基づいて未知の化合物構造を逆に推論しました。

検出されたすべての化合物とその断片イオンはm/z値で示されました。これらの断片イオンの一部は認証済みリファレンス標準²⁰に照合可能でした。未知の標的化合物構造は、これらの構造的に診断可能な中間体を系統的に機能基修飾することで段階的に組み立てられました。

未知の化合物に対してm/z=623.21のMS/MS断片化を実施しました。1個のヘキソース単位を除去した後、m/z=461.15の中間体断片が得られました。三次質量分析(MS³)による断片化により、中間体はラムノーズ1単位を失い、m/z=315.09のネオビヤカンジェリコルを生成しました。その後の四重極質量分析(MS⁴)によ...

Discussion

LIT-MSとそのMSⁿ 断片化技術の組み合わせにより、CHC中の未知化合物を同定する方法が可能となります。従来のオービトラップやQ-TOFのMSモードとは異なり、リニアイオントラップは標的イオンを特異的に捕捉でき、共溶出イオン²³による干渉を効果的に回避します。この方法は分子レベルの精度を実現し、比較的正確な化学構造情報を提供し、データベースのギャップによる未知化合物の選別の課題を部分的に解決します。

グリコシド、多糖類、フラボノイド、その他の化合物は^CHCsに広く存在します。線形イオントラップにおけるこれらの成分の断片化パターンは注目に値します。多糖類のMSⁿ 切断の過程で、グリコシド結合切断が最も起こりやすい²⁵。単糖に断片化されると、分子内脱水がさらにラクトンを形成することがあります。炭水化物中にヒドロキシル基や多数の異性...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アセトニトリル	Thermo Scientific	CAS 75-05-8	液体状態
ギ酸	Thermo Scientific	CAS 64-18-6	液体状態
蒿芩清飲	重慶太極産業（集団）有限公司	国家医薬品標準コード Z50020409	研究対象
リニアイオントラップ質量分析計	Thermo Scientific	LTQ XL	IT-MS機器
液体クロマトグラフ	Thermo Scientific	U3000	UPLC機器
Xcalibur	Thermo Scientific	バージョン2.0	UPLC-IT-MS操作ソフトウェア