研究記事

ヒトの二次的から肛門卵胞の発生を体外で支える三次元培養モデル

DOI：

10.3791/70713

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2026年6月16日

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1State Key Laboratory of Female Fertility Promotion, Center for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 2National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 3Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), Ministry of Education, 4Beijing Key Laboratory of Collaborative Innovation in Frontier Technologies for Population Quality, 5Department of Surgical Oncology, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, National Center for Children's Health, 6The University of Hong Kong- Shenzhen Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究は、二次期から鼻体内期までのヒト卵胞発生を維持する三次元(3D)培養モデルを 確立しました。このシステムは体細胞の分子特徴を保持しつつ、卵胞の成長と小薔節形成を可能にし、ヒト卵胞形成研究にとって重要なモデルを提供します。

要約

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ヒト卵巣卵胞形成は複雑で厳密に制御されたプロセスであり、直接生 体内で研究するのは難しいです。 in vitro モデルは機構研究に不可欠ですが、既存のシステムは卵胞発生の時空間的ダイナミクスを再現できないため、依然として最適とは言えません。本研究は、二次期から苋月期までのヒト卵胞の発達を支援する3D培養モデルを提示します。このモデルは、持続的な濾胞成長、10日目からの明確な直径拡大期、そして20日目頃の窦腔形成など、重要な 生体内 形態学的イベントを成功裏に再現しています。重要なのは、この発生過程が生殖小胞(GV)段階での生存可能な卵母細胞の成功した採取に結実したことです。さらに、免疫蛍光解析により、体細胞におけるゴナドトロピン受容体の明確な発現パターンが明らかになり、顆粒状体およびテカ細胞の同一性と一致することが示されました。内側肉芽腫様細胞は高い卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)を示し、外側のテーカ様細胞は黄体形成ホルモン受容体(LHR)の発現が高いを示しました。このモデルはヒト卵胞形成および生殖毒性学の研究に貴重なプラットフォームを提供し、二次期からアントラル期への発育における in vitro 濾胞培養システムの最適化の参考文献となります。

概要

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卵巣卵胞の発生は、初期段階から排卵前期に至る生理学的過程が女性の生殖能力に不可欠です。この過程には、卵母細胞の成長・成熟や顆粒細胞の増殖・分化など、高度に調整された一連の出来事が含まれます。これらの複雑なメカニズムの乱れは不妊や卵巣機能障害の主な原因となっています。したがって、濾胞形成の基盤となる調節ネットワーク、すなわちパラクリンシグナル伝達、卵母細胞-体細胞相互作用、細胞外マトリックスの動態を含む詳細な理解は、病態生理学的に極めて重要です。しかし、生 体内 でのヒト卵胞形成の直接的な研究は倫理的および実務的な制約に縛られており、これらのメカニズムを解明するために信頼性の高い in vitro モデルの必要性が高まっています。進歩はあるものの、特に二次期から竇房期にかけての人間の卵胞の発達を支える長期的な培養モデルは依然として深刻に欠如しています。

二次元(2D)または3次元(3D)行列におけるヒト卵胞培養は、初期卵胞発生の理解を進めていますが、これらのシステムは後期段階への進行を支援する上で限られています。特に、卵胞の大きさと成熟までの長い期間のために、ヒトの卵胞形成を後期の発達段階で体外で達成することは特に困難であることは注目に値します5。MII卵母細胞を成功裏に取得した限られたヒトin in vitro卵胞培養システムの中でも、成熟率は低く(最大で約20%)6,7,8,9。より根本的な課題は、二次的かつ構造的に複雑な段階である二次的からantralへの移行の再現であり、これはまだ体外で十分にモデル化されていない重要かつ構造的に複雑な段階です。

本研究は、ヒトの二次濾胞を独自の空洞構造を持つ薙薙胞へとin vitro で発達させることを支援する3D培養モデルを確立しました。このモデルは、ヒト卵胞発生の制御メカニズムをさらに研究するための基盤を提供し、二次発生からantral発生を対象とした卵胞培養システムの将来の最適化の参考文献となります。

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プロトコル

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この研究プロトコルは北京大学第三病院の倫理委員会によって審査・承認されました(承認番号M2024151)。研究に参加する未成年者の法定後見人全員がインフォームドコンセントフォームに署名しています。

組織源
本プロトコルで使用されたヒト卵巣髄質組織は、卵巣奇形腫と診断された4名の小児患者(2歳、6歳、13歳、16歳)から取得され、研究目的で卵巣組織を提供しました (表1)。卵巣皮質は卵巣組織の凍結保存研究に用いられ、残りの髄質組織は本研究でin vitro 卵胞培養に用いられました。合計33個の二次卵胞が分離され、そのうち16個が対照群に、17個が3D培養群に割り当てられました。

試薬調製
輸送培地は、ライボヴィッツのL-15培地に10%の血清代替物補足剤を補足し、4°Cで保存されました。 完全な消化液は、MEMαに0.04 mg/mLのリベラーゼDH、10 IU/mLのDNase I、100 IU/mLのペニシリン・ストレプトマイシンを補足し、-20°Cで保存することで調製されました。 消化停止液はDPBSに10%血清代替品補足剤を補足し、4°Cで保存しました。 完全な培地は、MEMαに10%血清代替物補足剤、1%インスリン-トランスフェリン-セレン、50μg/mLのL-アスコルビン酸、2mMのピルビン酸ナトリウム、100IU/mLのペニシリン-ストレプトマイシンを補足して調製しました。培地は4°Cで保存されていました。 培養開始時に組換えヒト卵胞刺激ホルモン(FSH)を最終濃度100 mIU/mLに加えたと、以前の研究で説明されています。早期の蝋蝋形成を視覚的に検出した際(約20日目)、組換えヒト黄体形成ホルモン(LH)を培地交換中に最終濃度10 mIU/mLまで補足しました。固体培養マトリックスは、70%(v/v)の基底膜マトリックスと30%(v/v)の氷冷完全成長培地を混合し、すべての取り扱い工程で氷を保持して調製しました。

組織消化と二次卵胞の分離
卵巣組織は輸送培地に置かれ、4°Cで実験室へ運ばれました。 無菌条件下で、卵巣延髄はメスで剥離されました。組織は薄い塊(~3 × 3 × 1 mm)に切片され、さらに組織チョッパーで小さな断片(~0.5 × 0.5 × 1 mm)に細かく刻まれ、組織全体を湿った状態に保ちました。挽いた組織は35mmの皿に移され、予め温められた完全な消化液を100mg組織あたり2mLに加えました。37°Cで45〜80分(平均60分±15分)の孵化が行われ、10分ごとに穏やかに混温されました。顕微鏡検査で間質マトリックスの緩みと個々の卵胞の放出が確認され、消化は終了しました(図1)。健康な二次卵胞(直径100–200 μm、2層の顆粒状細胞層と目に見える卵母細胞≥)は、ガラス口制御ピペット(内径200 μm)を用いて立体顕微鏡下で選抜し、予温化された完全成長培地で2回洗浄しました。

3D埋め込みと長期文化
細胞培養挿入を35mmの皿に置き、2mLの完全成長培地で湿らせ、インキュベーター(37°C、5% CO₂)で2時間平衡状態にしました。選ばれた二次卵胞を挿入本に移植し、同じ条件下で一晩前培養しました。前培養終了時に、対照群の卵胞は挿入物内で直接培養(2次元培養)されました。対照的に、3D培養群に指定された卵胞は、成長因子還元基底膜マトリックス(総タンパク質8~12 mg/mL)への埋め込み用に準備されました。マトリックスは氷の上で解凍され、30%(v/v)の氷冷完全成長培地と混合されました。40μLの混合物の液滴を35mmの皿(1皿あたり最大6滴)に置き、約1.5mmの高さの均一なゲル層を形成しました。その後、ガラス口で制御されたピペットを使い、1つの二次卵胞を各液滴に移植し、液滴の沈みを防ぐために中上部から上部に慎重に配置しました。皿はインキュベーター(37°C、5% CO₂)に30分間入れられ、ゲル化を促しました。固化後、2mLの完全成長培地を優しく皿に加え、長期培養を開始しました。

培養維持とモニタリング
フレッシュを含む新鮮な完全培養培地で48時間ごとに50%の培地交換を行いました。卵胞は毎日立体顕微鏡で観察され、その直径や形態的特徴が記録されました。早期の人柄形成を視覚的に検出した際(約20日目)、その後の変化で組換えヒトLHが培地に加えられました。培養は最大30日間、または卵胞が模様化段階(>直径400μm、明確に液体充填された空洞)に達するまで維持されました。

培養後細胞解離
培養終了時に、鼻卵胞を新鮮なDPBSを含む皿に移し、無菌の29ゲージ注射器で機械的に解離しました。分離された積雲卵母細胞複合体(COC)はさらなる解析のために別の皿に移されました。残った顆粒状およびテカ細胞の懸濁液は、2mLの予温された完全成長培地を含む新しい35mm皿に移され、均一分布のために優しく渦巻き、48時間(37°C、5% CO₂)培養されました。

免疫蛍光解析
培養後、細胞は4%パラホルムアルデヒドで室温で30分間固定されました。その後、試料をPBSで3回洗浄し、0.5%トリトンX-100で20分間透過し、さらにPBS中の1%BSAで4°Cで一晩ブロッキングしました。細胞は4°Cで一次抗体とともに一晩培養されました。使用された一次抗体は抗FSHR(ウサギ、1:200)および抗LHR(マウス、1:100)でした。インキュベーション後、細胞は1%BSAを含むPBSで3回、各15分間洗浄されました。その後、蛍光性二次抗体(抗ウサギ抗体および抗マウス抗体、1:200)を室温の暗い環境で2時間インキュベートしました。最後に、細胞は3回の最終洗浄を行い、それぞれ20分間続きました。核は室温で5分間DAPI染色を施しました。その後、1%BSAを含むPBSでサンプルを3回5分間洗浄しました。画像化は、オペレッタCLSの高濃度イメージングシステムを共焦点モードで使用して実施されました。蛍光信号は以下のチャネルでキャプチャされました:DAPI(405 nm)、Alexa Fluor 488(LHR)、Alexa Fluor 647(FSHR)で、すべてのサンプルで一貫した露光設定が適用されました。

統計解析
5日目、10日目、15日目における対照群と3D培養群の卵胞径の比較は、独立したサンプル t検定を用いて実施されました。 p値 <0.05は統計的に有意とされました。15日目以降の卵胞径の統計解析は行われず、対照群のほぼ全ての卵胞が15日目以降生存できなかったためです。その結果、サンプルサイズが不十分となり、信頼性と意味のあるグループ比較が困難となりました。すべての統計解析はGraphPad Prism(バージョン9.0)を用いて実施されました。

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結果

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人間の卵胞成長を支える3D培養モデルの開発
卵巣卵胞研究における大きな課題は、卵胞の完全な発達を支援する 体外 培養システムの開発であり、その主要な節目としてはアントラル腔形成が重要です。したがって、本研究はin vitro でヒト卵胞の3D培養モデルを確立しました(図2)。 合計33個の二次卵胞が4人のドナーから分離され、そのうち16個が対照群(2D挿入培養)、17個が3D培養群に割り当てられました (表1)。培養10日目に、対照群で9個の卵胞が生存し(生存率:56.3%)、3次元培養群で10個の卵胞が生存しました(生存率:58.8%) (表1)。20日目までに対照群では生存率0%の濾胞が残らず、3D培養群では6個の濾胞が生存可能でした (35.3%)(表1)。25日目および30日目までに、3D培養群...

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ディスカッション

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二次的転移から肛門への移行を通じてヒト卵巣卵胞をin vitroで成功裏に維持することは、重要な技術的進歩を示しています。本研究では、適切な生物物理的サポートとステージ特異的なホルモンの手がかりを提供する3D培養システムがこの進行を可能にしました。これらの結果は、組織生理を再現するために3D培養システムの必要性を強調する最近の証拠と一致しています。従来の2次元単分子層は運用上は単純ですが、細胞間および細胞間相互作用に必要な空間構造を欠いており、しばしば分化や機能の変化を引き起こします。本研究では、4人のドナーから派生した対照群の16個の卵胞が全患者サンプルで一貫した変性動態を示し、10日目に変性が始まり、15日目以降は生存可能な卵胞が残っておらず、培養期間中は窦嚢形成も認められませんでした。対照的に、3D培養システムは卵胞の生存率と発生効率が著しく優れており、培養10日目、20日目、30日目にそれぞれ58.8%、35.3%、5.9%に達...

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開示事項

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すべての著者は、競合する利害関係がないと宣言しています。

謝辞

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この研究は北京自然科学基金(Z230013)、中国国家自然科学基金(T2293764、82501980、82288102)、国家キーテクノロジー研究開発中国Dプログラム(2022YFC2703000)、北京大学の臨床医学プラスX(若手研究者プロジェクト、PKU2025PKULCXQ033年)、北京大学第三病院臨床重点プロジェクト(BYSYZD2021019年);ハイ・イノベーション・プラン(202504841089)、中国博士後科学基金(GZC20230145)などが含まれます。回路図は https://BioRender.com 年に作成されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Anti-FSHRHuaBioER1909-08
Anti-LHRSanta Cruzsc-293165
Anti-mouse(secondary)AbcamAB150113
Anti-rabbit(secondary)AbcamAB205718
Basement membrane matrix for organoid cultureMCEK6004 
BSASigmaA1933
Cell culture insert MilliporePICMORG50
Culture dishCorning430165
DAPIBeyotimeC1006
DNase I ThermoEN0525
DPBSGibco14190144
FSHMerckF4021
IncubatorThermoHeracell 3111
Insulin-Transferrin-SeleniumGibco41400045
L-Ascorbic acidMCEHY-B0166
Leibovitz's L-15 mediumGibco11415064
LHMerckL6420
Liberase DHRoche5401054001
McIlwain Tissue chopperMickle Laboratory Engineering Co. Ltd.MP10180-220
MEMαGibco41061029
ParaformaldehydeSolarbioP1110
PBSGibco10010023
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Serum substitute supplementFUJiFILM Irvine90194
Sodium pyruvateGibco11360070
StereomicroscopeNikonSMZ1270
The high-content imaging systemPerkinElmer Operetta CLS
Triton X-100SigmaX100

参考文献

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