急性骨髄性白血病における化学療法耐性のシグネチャーを特定するための骨髄サンプルのトランスクリプトミックプロファイリングおよびバイオインフォマティクス解析

サマリー

本プロトコルは、急性骨髄性白血病(AML)におけるトランスクリプトミック変異を解析するための標準化されたバイオインフォマティクスワークフローを提供します。目的は、新たに診断された骨髄サンプルと再発した骨髄サンプルを比較し、化学療法耐性や疾患進行に関連する分子の特徴を優先的に調査することです。

要約

急性骨髄性白血病(AML)は非常に異質な血液悪性腫瘍であり、再発や獲得性化学療法耐性が治療失敗の主な原因となっています。本記事では、骨髄吸引液のトランスクリプトミック解析のためのバイオインフォマティクスプロトコルを提示します。本プロトコルの主な目的は、再発したAMLにおける疾患進行および治療抵抗性に関連する分子シグネチャーを特定するための標準化されたワークフローを提供することです。このパイプラインは、5件の新たに診断された症例と4件の再発症例のシーケンスデータを用いて、未対の骨髄サンプルを比較する計算手順を詳細に示しています。この手法は、RNAシーケンシングデータの処理、差分遺伝子発現解析の実施、そして下流の機能評価を行うための重要なステップを示しています。このワークフローを適用した結果、FOXC1、HOXA11、HOXA11-AS、AXLを含む2,025の差異発現遺伝子(DEG)が、この代表的なデータセットで再発に関連する候補転写産物として同定されました。機能解析およびネットワーク解析では、小GTPaseシグナル伝達、炎症シグナル伝達、細胞外マトリックス相互作用、RNA生合成プロセスに関連する遺伝子セットおよび相互作用ハブがさらに優先されました。全体として、この手法は再発したAMLに関連するトランスクリプトムシグネチャーのマッピングや、その後の実験検証を必要とする仮説の生成のための再現可能な計算パイプラインを提供します。

概要

急性骨髄性白血病(AML)は、造血幹細胞/前駆細胞に由来するクローン悪性腫瘍の一群であり、骨髄内の未成熟骨髄細胞の異常な増殖と造血分化の抑制を特徴と^します。現在の標準的な誘導化学療法(シタラビンとアントラサイクリンの組み合わせなど)はほとんどの患者で完全寛解を誘導できますが、再発率は50%〜70%と高く、再発患者の予後は著しく低下^{しています。}後天性化学療法耐性はAML治療の失敗と関連しており、治療戦略と患者^{生存率を改善する}ために、この過程に関連する分子の特徴を深く分析する必要があります^7,8。

より広範な文献では、既存の研究によれば、AMLにおける化学療法耐性は薬物排出ポンプのアップレギュレーションや異常な代謝に限らず、白血病幹細胞(LSC)の生存維持、血液学的ニッチ内での上皮間葉転換(EMT)様表現型の形成、骨髄微小環境との相互作用とも関連していることが示^{されています。10、11}。例えば、LSC集団は高い自己更新能力と静止性を示し、細胞周期特異的化学療法薬に対する固有の耐性と関連しています¹²。さらに、AXLなどの受容体チロシンキナーゼのアップレギュレーションは、FLT3-ITD+ AMLにおける耐性と関連しており、PI3K/AKTおよびMAPK経路の活性化や抗アポトーシス能力の向上と並行して起こっています^13,14。代謝再プログラミングやエピジェネティックなリモデリングも耐性形成における重要な調節軸として認識されています。証拠は、再発期のAML細胞が酸化リン酸化(OXPHOS)活性の強化、調節されたNAD/NADH比率、ヒストン修飾の変化を通じて化学療法誘発性の酸化ストレスやDNA損傷に適応する可能性があることを示唆しています(15,16,17)。骨髄微小環境の炎症因子、例えばIL-6やCXCL8もLSCの生存率や化学療法耐性と関連しており、しばしばSTAT3/NF-κBシグナル伝達経路の活性化と連動して現れます^11,18。

これらの認識されたメカニズムにもかかわらず、AMLの再発や化学療法耐性に関連するトランスクリプトム変化は、代謝的、エピジェネティック、骨髄微小環境関連シグナルを臨床サンプルで同時に評価した場合に、依然として完全には解明されていません。このワークフローは、初期診断から臨床再発への移行に関連する候補DEGs、経路、規制ネットワークを優先順位付けすることで、このニーズに対応しています。このアプローチは、差異発現解析、遺伝子セットリッチメント解析(GSEA)、およびタンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク構築を統合し、システム全体の転写再プログラミングをマッピングし、その後の機構検証のための候補を指名します。

この手法の全体的な目的は、新たに診断されたAML骨髄サンプルと再発した骨髄サンプルのバルクトランスクリプトームを比較するための標準化され再現可能なバイオインフォマティクスパイプラインを提示することです。このインシリコ技術の根拠は、単一経路解析の限界を超えて複雑で多次元的な調節ネットワークを優先的に捉え、偏りのないゲノム全体の転写イベントを捉えることができる点にあります。この技術は、マイクロアレイやターゲットマルチプレックスqPCRパネルなどの代替手法に比べて、高いダイナミックレンジ、新規転写産物の検出能力、そして事前設計プローブの制限なしに遺伝子発現の正確な定量を可能にするという大きな利点があります^19,20。この方法が適用に適しているかどうかを判断するために、このパイプラインは組織吸引液などのペアまたは非ペアの臨床コホートからのRNAシーケンスデータのバルク処理のために特別に設計されていることに注意してください。この方法は、広範な耐性関連シグネチャーや候補的な調節ネットワークの同定に適していますが、細胞型特異的または空間分解能を必要とする研究者は、補完的な単一細胞または空間シーケンスのワークフローを用いる必要があります。最終的に、この計算プロトコルにより、候補遺伝子、経路、調節ネットワークの優先順位付けが可能となり、その後の実験的調査が可能になります。

プロトコル

ヒト組織サンプリングを含むすべての方法は、機関のガイドラインおよびヘルシンキ宣言(2013年改訂)に準拠して実施されました。臨床骨髄サンプルは、機関倫理委員会(承認番号TY-ZKY2024-116-01およびTY-ZKY2024-116-02)の承認を得て取得されました。

1. 臨床検体採取と患者分類

1. 世界保健機関(WHO)の分類基準に基づき、急性骨髄性白血病(AML)と正式診断された患者の骨髄吸引標本を選択。
2. 患者選択時に特定の包含・除外基準を適用し、コホートの均質性と再現性を確保します。原発性AMLの成人患者を含め、二次性AML、急性プロ髄血球性白血病、または他の悪性腫瘍の既往歴がある患者は除外します(表1)。
3. 初回臨床診断時に未治療のAMLを提示された場合、採取したサンプルを新たに診断されたグループに割り当てます。
4. 完全寛解が記録された後、末梢血で白血性芽球が再発したり、骨髄で5%を超える放胞が見られた場合は、採取したサンプルを再発グループに割り当てます。
5. 通常の臨床骨髄吸引手術の直後に、識別解除された残留骨髄サンプルを採取します。
   注:この特定のプロトコルの実証では、2024年9月から2025年9月にかけて9件の連続検体(新たに診断された5件、再発した4件)が採取されました。この調査は非識別化された残留臨床サンプルのみを使用していたため、倫理委員会は書面によるインフォームド・コンセントの要件を免除しました。
6. 収集した骨髄を標準的なフェノール-グアニジニウム^溶解法を用いて直ちにRNA保存のために処理します。
   1. 新たに採取した骨髄吸引液を抗凝固剤を含む採取管に移します。チューブを振って吸引液と抗凝固剤をしっかり混ぜます。
   2. 抗凝固試料の測定体積を抽出し、市販のフェノール-グアニジニウム溶解試薬に加えます。溶解試薬3成分に対してサンプル1成分の体積比を維持してください。
      注意:フェノール・グアニジニウム溶解試薬には、重度の火傷や組織損傷を引き起こす有毒かつ腐食性の化学物質が含まれています。すべての試薬取り扱いは、適切な個人用防護具を着用しながら化学煙幕内で行ってください。
   3. 試料と溶解試薬を完全に均質化するためにチューブを激しく振ってください。混合物が完全に混ざっていることを確認し、目に見える血栓が溶液中に残っていないか確認してください。
   4. 均質化したサンプルはすぐに液体窒素に浸してスナップ冷凍します。
      注意:液体窒素は非常に冷たく、接触すると重度の凍傷を引き起こす可能性があります。液体窒素を扱う際は、低温手袋とフルフェイスシールドを着用してください。
7. スナップフローズされたサンプルを-80°Cの冷凍庫に移し、下流のRNA分離およびトランスクリプトームシーケンスパイプラインの前に長期保存します。これは実験を一時停止し、後で再開できる安全なポイントを示します。
   注:このプロトコルで示されるワークフローは、計算抵抗シグネチャの生成に完全に焦点を当てています。この特定のパイプラインを通じて特定された主要な差異発現遺伝子については、リアルタイム定量PCR(RT-qPCR)などの独立した実験的検証は行われていません。

2. RNA品質管理およびライブラリー調製

1. マイクロ流体キャピラリー電気泳動システムを用いてRNAの完全性を評価します。この代表的なワークフローでは、RNA完全性数値(RIN≥)が6.0、A260/280比が1.8から2.1の間、目に見える劣化ピークがないRNAサンプルを含めます。ライブラリー調製前に各サンプルの測定されたRINおよび純度比を記録してください。
2. ライブラリー調製のために、サンプルあたり総RNA1μgを入力。ポリTオリゴ結合磁気ビーズを用いて全RNAからmRNAを精製し、ポリA尾の転写産物を濃縮します。
3. 二価陽イオンを用いて濃縮したmRNAを断片化します。混合物を94°Cで15分間、5本の第一鎖合成反応バッファーで培養します。
4. ランダムなヘキマープライマーとRNase H活性を欠く逆転写酵素を用いて、第一鎖cDNAを合成します。
5. RNase Hを用いてRNA型鎖を分解。20μL反応系でDNAポリメラーゼIとdNTPを用いて2本鎖cDNAを合成します。
6. 第二鎖合成反応を16°Cで1時間培養します。反応混合物を2,000 x g で短時間遠心分離し、チューブの底に液体を回収します。
7. 残りの張り出しをエクソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ活性を用いて鈍い端に変換します。DNA断片の3'端をアデニル化し、ヘアピンループ構造でアダプターを結紮してハイブリダイゼーションの準備を行います。
8. 磁気固体相可逆固定ビーズを用いてライブラリー断片を精製し、370〜420 bpのcDNA断片を優先的に選択します。
9. ビーズ浄化中にエタノール洗浄を行います。チューブを2,000 x g で30秒遠心分離し、最終溶出前に残留エタノールを完全に除去します。
10. 高忠実度DNAポリメラーゼ、汎用PCRプライマー、サンプル特異的インデックスプライマーを用いてPCR増幅を行います。
11. PCR熱プロファイルを98°Cで30秒間変性させて実行します。続いて、98°Cで10秒、60°Cで30秒、72°Cで30秒、最後に72°Cで5分間延長する12サイクルを行います。
12. 磁気ビーズを使って再度PCR産物を精製します。ステップ2.9と同じ遠心分離パラメータを適用して最終ライブラリを得ます。
13. 初期ライブラリー濃度をフルオロメーターで定量します。最終ライブラリを1.5 ng/μLの濃度に希釈します。
14. 薄めたライブラリをしっかり混ぜてください。最終分析前に、混合物を10,000 x g で4°Cで1分間遠心分離し、残留物を除去します。
15. マイクロ流体キャピラリー電気泳動システムを用いてライブラリーの挿入サイズを評価します。
16. インサートサイズが期待通りであることを確認した後、リアルタイム定量PCR(qRT-PCR)を用いてライブラリーの有効濃度を正確に定量します。ライブラリーの安定性とシーケンス品質を保証するために、濃度が1.5 nM以上であることを確認しましょう。
    注意:これは実験を一時停止できる安全なポイントを表しています。調製されたライブラリはクラスタリングとシーケンスが行われるまで-20°Cで保存可能です。

3. クラスタリングとトランスクリプトームシーケンス

1. インデックス符号化サンプルのクラスタリングを自動クラスタ生成システムで実行します。メーカーの指示に従って市販のペアエンドクラスタキットを使用してください。
2. クラスタ生成に成功した後、高スループットシーケンスプラットフォーム上でライブラリの調製をシーケンスします。150塩基対(bp)のペアエンドリードを生成します。

4. データ品質管理と読み取りマッピング

1. 生データの品質評価(FASTQ 形式)は、fastp v0.23.2 を用いて生読みの品質管理とフィルタリングを行います。コマンドラインのパラメータを解析ログに記録します。このワークフローでは、サンプル間で同一のフィルタリング設定を用いて、アダプターを含むリード、ポリ-N配列を含むリード、低品質リードを除去してクリーンリードを生成しました。代表的なペアエンドコマンドは 補足ファイル1に提供されています。
2. 生読み込みを自動前処理ソフトウェアで処理します。アダプターを含むリード、ポリ-N配列を含むリード、低品質リードを除去することでクリーンリードを得ることができます。すべてのサンプルに同一のフィルタリングパラメータを使用し、フィルタリング後に保持された読み取り数、Q20、Q30、GC成分を記録します。
3. クリーンデータのQ20、Q30、GC成分を計算します。下流解析前に、サンプル採取日、RNA抽出日、ライブラリ調製バッチ、シーケンスレーン、シーケンスランなどの潜在的なバッチ変数を定義します。
4. 正規化された表現値を用いてPCAおよびサンプル間相関解析を用いてバッチ効果を評価します。サンプルが主に技術的変数でクラスタリングされる場合は、影響を受けた変数を文書化し、差異表現設計の公式に共変量として含めるか、確立されたバッチ調整手法を適用して後行の可視化を行います。
5. 参照ゲノム(ホモ・サピエンス、GRCh38)および対応するEnsemblリリース109の遺伝子注釈ファイルを取得し、リードアライメントを行います。
6. HISAT2 v2.0.5を使って参照ゲノムのインデックスを作成します。
7. HISAT2 v2.0.5を用いてペアエンドクリーンリードを参照ゲノムにアラインメントします。このスプライス認識アラインメント手法を用いて、遺伝子モデル注釈ファイルに基づいてスプライス接続のデータベースを生成します。

5. 新規転写本予測および遺伝子発現定量化

1. StringTie v1.3.3bを用いて参照ベースのアプローチで各サンプルのマッピング済みリードを組み立てます。このツールを使って、各遺伝子座ごとに複数のスプライス変異を表す全長転写証明書を組み立て・定量化します。
2. featureCounts v1.5.0-p3を使って各遺伝子にマッピングされたリード数を数えます。得られた生の整数読み取りカウント行列を下流の微分式解析の入力として用いてください。
3. ペアリングエンドのシーケンスデータ用にfeatureCounts v1.5.0-p3を設定し、ペアリングエンドオプション(例:-p)を用いてください。ダウンロードしたGRCh38 GTF注釈ファイルを提供し、正しいゲノム特徴境界を定義します。
4. 各遺伝子のマッピングリードあたりの転写株フラグメント/キロベース(FPKM)を計算します。FPKM値は記述的可視化、PCA、ヒートマップ表示、探索的式の要約にのみ使用してください。DESeq2の差分式検定においてFPKM値を入力行列として使用しないでください。

6. 差異遺伝子発現解析

1. R v3.5.0およびDESeq2 R パッケージ v1.20.0 を用いて、新たに診断されたグループと再発したグループ間の差別発現解析を行います。ステップ5.2で生成された生のリードカウント行列をR環境にインポートし、FPKM値は可視化および探索解析のみに保持します。
2. 解析パッケージに必要な専門的なデータセットオブジェクトを構築します。特定のコマンド(例:DESeqDataSetFromMatrix())を実行し、カウントデータ行列を対応するサンプルメタデータテーブルにバインドします。
3. ソフトウェアオブジェクト内で実験デザインの公式を定義します。比較の主要変数として臨床状態(新たに診断されたか再発か)を指定します(例:デザイン=~状態)。ステップ4.3で技術的バッチ変数が特定され、臨床状態と完全に混同していない場合は、設計式に含めてください(例:design = ~ バッチ+状態)。
4. コアの微分式解析関数(例:DESeq())を実行します。ソフトウェアが自動的にサイズファクター推定、分散推定、負の二項ワルド検定フィ^{ッティングを}行えるようにします。
5. 結果抽出関数(例:results())を使って結果テーブルを抽出します。正確な比較(再発者と新たに診断された人)を定義するために造影剤の議論を指定してください。
6. 結果として得られたP値を誤検出率に調整します。ソフトウェアパッケージ²³によって自動的に適用される統合されたベンジャミニおよびホッホバーグ法を活用してください。
7. 抽出した結果表をフィルタリングし、有意な差異発現遺伝子(DEGs)を分離します。調整後P値が0.05<、絶対log₂ 倍変化>1の遺伝子を有意に発現差異があると割り当てます。

7. 遺伝子オントロジー(GO)エンリッチメント解析

1. clusterProfiler v3.8.1およびorg.を用いて、同定されたDEGの遺伝子オントロジー(GO)濃縮解析を行います。Hs.eg.db v3.6.0です。ステップ6.7で特定された有意DEGに対応するEntrez遺伝子IDのリストを入力します。
2. GOの濃縮関数(例:enrichGO())を実行します。必要なパラメータを指定し、適切な背景生物データベース(例:OrgDb = org)を指定します。Hs.eg.db)、特定の存在論領域(生物学的過程、細胞成分、または分子機能)、および調整されたP値カットオフ(0.05)です。
3. 濃縮計算時に必要な補正をアルゴリズムが適用していることを確認しましょう。ソフトウェアが内部で遺伝子長バイアスを補正し、BenjaminiおよびHochberg法を用いてP値を調整していることを確認しましょう^。
4. 修正済みP値が0.05未満のGO項を有意に濃縮したとみなします。パッケージの統合された可視化機能を活用して、上部の強化されたGO項を表示するドットプロットや棒グラフを生成します。

8. 京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)経路富集解析

1. 高レベルの生物学的システムの機能を理解するための包括的なデータベースリソースを活用し、調節不全の経路を特定しましょう。ステップ7.1で使用した重要なDEGエントレズIDのリストを作成しましょう。
2. 関数注釈Rパッケージ内でKEGGのエンリッチメント関数(例:enrichKEGG())を実行します。
3. 関数呼び出し内でクリティカルパラメータを定義します。生物コードを厳密に人間に設定し(例:生物 = '持つもの')、P値調整法(例:pAdjustMethod = 'BH')を定義します。
4. 統計的に有意なKEGG経路を抽出します。出力をフィルタして、補正P値が0.05未満の経路のみを保持します。
5. 最も濃縮されたKEGG経路を視覚化してください。統合プロット機能(例:dotplot())を活用して、各経路に関連する統計的有意性や遺伝子数をマッピングします。

9. 遺伝子セット富裕分析(GSEA)

1. 分析に必要な事前ランク付けされた遺伝子リストを準備してください。差分発現解析から導出されたlog₂ 重変化の符号を符号付き-log10(P値)に掛けて、すべての発現遺伝子のランキング指標を計算します。
2. Broad InstituteのGSEAソフトウェアv4.2.3のローカルインストールを起動してください。新たに生成された事前ランク付けされた遺伝子リストをソフトウェアインターフェース²⁵に入力します。
3. 必要なあらかじめ定義された遺伝子セットをダウンロードしてください。分子署名データベース(MSigDB、バージョン7.5.1^)からGene Ontology(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)データセットを取得してください。
4. ソフトウェアパラメータを設定して統計的濃縮テストを実施します。置換の数を1,000に設定し、置換タイプを「gene_set」として選択します。
5. 解析アルゴリズムを実行し、あらかじめ定義された遺伝子セットが新たに診断された生物学的状態と再発した生物学的状態の間に統計的に有意かつ一致した差異を示しているかどうかを判断します。
6. 生成された濃縮プロファイルの統計的有意性を評価してください。有意遺伝子セットを厳格な閾値で定義します:正規化エンリッチメントスコア(NES)の絶対値>1.0、名目P値<0.05、偽発見率(FDR)q値<0.25。

10. タンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク解析

1. 既知および予測されたタンパク質間相互作用についてSTRINGデータベースにアクセスしましょう。このワークフローでは、PPI解析はSTRING v11.5²⁷で実施されました。
2. Entrez遺伝子IDまたは有意差発性遺伝子の公式遺伝子記号(ステップ6.7で特定)をデータベース検索インターフェースに入力します。ホモ・サピエンスを標的生物として選びましょう。
3. 高品質な相互作用が取得されるようにネットワーク構築パラメータを設定してください。最低必要相互作用スコアを高い信頼度(スコア>0.700)に設定します。
4. 得られたインタラクションネットワークデータをローカルディレクトリにエクスポートします。インタラクションマップは標準の表形式ファイル(例:TSV形式)として保存してください。
5. エクスポートしたインタラクションデータをCytoscape v3.9.1にインポートし、ネットワークの可視化^{と解析を行います}。
6. 構築されたネットワークをフィルタリングして可視化の明瞭さを向上させ、主要な規制ハブを強調しましょう。確立された信頼閾値を満たす連続的な相互作用を示しない断絶したノードや孤児遺伝子は除去します。

結果

臨床コホートおよびシーケンシング検証

上流RNA抽出およびライブラリー調製プロトコル(図1)の成功は、シーケンス収量および品質指標によって確認されました。この代表的なデータセットでは、新たに診断された5名のAML患者と再発した4名のAML患者の骨髄サンプルを用いて、サンプルあたり平均約6.0GBの生データを得ました。品質管理評価(表2)により、基底品質およびリード深度が下流バイオインフォマティック解析に必要な閾値を満たしていることが確認されました9。低いRNA完全性(例:RIN < 6.0)、低いマッピング率、または高い転写本分解バイアスは、最適でない入力品質を示し、下流の差分発現解析の信頼性を損なう。

グローバルトランスクリプトミック分散とPCA

グローバルなトランスクリプトームの分散を評価し臨床的グルーピングを検証するために、正規化された発現データに対してPCAが実施されました。この代表的なデータセットでは、新たに診断されたグループと再発したグループは二次元空間で分離を示しました(図2A)²⁰、PC1とPC2はそれぞれ総分散の23.82%と18.75%を占めました。図2B,Cのベン図は、新たに診断されたグループおよび再発群内で検出された遺伝子の詳細な要約を提供し、下流の差異発現解析前のサンプルレベルの再現性チェックを支援します。コホートが小規模かつペアがなかったため、PCA分離は疾患状態特異的な生物学の決定的な証拠というよりも、例示的なワークフローの成果として解釈されました。

差異発現遺伝子(DEG)解析

確立されたプロトコル閾値(|log₂FC| ≥ 1および調整P値≤0.05)をDESeq2の出力に適用すると、再発群で772のアップレギュレーション遺伝子と1,253のダウンレギュレーション遺伝子を含む2,025のDEGが特定されました(図3A)。高い変動の候補トランスクリプトには、FOXC1(log₂FC = 7.55、P = 4.92 x ^10-5)、HOXA11(log₂FC = 7.76)、HOXA11-AS(log₂FC = 7.23)、AXL(log₂FC = 3.50)が含まれ、さらにダウンレギュレーションされたRHOB、PTX3、CXCL8も含まれます。既存の文献では、これらの遺伝子のいくつかがAML幹性、シグナル伝達、または治療反応に関連していることが示されています^13,29;しかし、現在のワークフローでは、これらを再発に関連する候補トランスクリプトとしてのみ識別しています。臨床耐性における決定的な機構的役割は、その後独立した機能的検証を必要とします。

機能的および経路強化(GO、KEGG、GSEA)

機能注釈プロトコルにより、DEGをより広範な生物学的システムにマッピングしました。GO解析により、小型GTPアーゼ介有シグナル伝達、金属イオン輸送、クロマチンアセンブリに関連する用語の濃縮が確認されました(図4A–C)。KEGG経路マッピングにより、ECM受容体相互作用およびサイトカイン-サイトカイン受容体相互作用との関連が確認されました(図4D)。GSEAでは再発群でRNA生合成プロセスの濃縮が認められ、新たに診断されたグループではエネルギー代謝経路の濃縮が認められました(図5A)。これらの濃縮結果は、変性遺伝子セットの記述的なロードマップを提供し、再発の証明された要因ではなく、仮説生成の関連として解釈されるべきです。

タンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク構築

初期のSTRINGネットワークは56ノードと193のインタラクションを含んでいました。切断されたノードや孤児ノードを除去した後、表示されたCytoscapeサブネットワークには42ノードと136の相互作用が含まれていました(図5B)。ネットワークモジュラー解析では、TP53、CCL2、CXCL8、IL6が最も多くの相互作用を持つ中央数学的ハブとして優先されました。PPIネットワークはデータベースで予測された相互作用スコア(例:ATF3スコア:0.982)に依存しているため、ハブ同定はp53介在のアポトーシス回避や他の耐性機構の直接的な証拠ではなく、将来の実証研究におけるターゲット優先順位付けとして解釈されるべきです。

このプロトコルで生成された生のRNAシーケンスデータはFigshareリポジトリに保存されており、以下のDOI(https://doi.org/10.6084/m9.figshare.30655814)を通じて一般公開されています。処理済みデータおよび関連する分析ファイルは記事および補足資料に含まれています。計算ワークフローを再現するための代表的なコマンドラインパラメータおよび解析設定は 補足ファイル1として提供されています。本研究の成果を支持するすべてのデータは制限なく利用可能です。

患者ID	年齢(年)	セックス	分子変異	生存/フォローアップ(数ヶ月)	臨床状況
R_AML_1	70	男性	FLT3-ITD (+)	22	故人
R_AML_2	29	女性	NPM1 (+)	11	生きている
R_AML_3	40	男性	CEBPA (+)	17	生きている
R_AML_4	55	女性	トリプルネガティブ*	24	故人

表1:再発したAML(R_AML)群の患者の人口統計学的および臨床的特徴。 表1は、代表的な分析で用いられた再発したAMLコホートの人口統計学的および臨床的特徴をまとめており、トランスクリプトミックワークフローの解釈に関連する患者レベルの臨床的特徴も含まれます。

サンプル	図書館	Raw_reads	Raw_bases	Clean_reads	Clean_bases	Error_rate	Q20	Q30	GC_pct
AML_1	FRAS25 0244891-1r	48705066	7.31G	47807532	7.17G	0.01	99.35	97.48	47.48
AML_2	FRAS25 0244896-1r	42969940	6.45G	42237962	6.34G	0.01	99.35	97.44	46.74
AML_3	FRAS2502 44906-1r	48738386	7.31G	47744462	7.16G	0.01	99.36	97.48	47.28
AML_4	FRAS250 244915-1r	48723650	7.31G	47688240	7.15G	0.01	99.29	97.26	47.45
AML_5	FRAS2502 44920-1r	49508198	7.43G	47740308	7.16G	0.01	99.37	97.53	47.73
R_AML_1	FRAS2502 44892-1r	47879408	7.18G	46671584	7.0G	0.01	99.39	97.49	47.63
R_AML_2	FRAS2502 70005-1r	47657378	7.15G	46957882	7.04G	0.01	99.39	97.49	50.5
R_AML_3	FRAS250 405722-1r	58754766	8.81G	56867112	8.53G	0.01	99.38	97.42	46.52
R_AML_4	FRAS2502 44902-1r	48491122	7.27G	47469334	7.12G	0.01	99.23	97.21	46.43

表2:データ品質の概要。 表2は、各サンプルのシーケンシング品質指標を報告しており、リード収量、基質品質、GC含有量、およびサンプルが下流解析に適したかどうかを判断するためのマッピング関連品質管理情報が含まれます。

図1:プロトコルのワークフロー。 このワークフローは、臨床サンプル採取、RNA品質管理、ライブラリーの調製と配列決定、リード処理とアラインメント、転写本定量化、差別発現解析、GO/KEGG濃縮、GSEA、PPIネットワーク構築など、主要な実験および計算段階を要約しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:サンプルの定量分析。 (A) 主成分分析(PCA)は、グループ間の違いおよびグループ内のサンプル再現性を評価するために実施されました。PCAは、すべてのサンプルにわたる正規化された遺伝子発現値に基づく線形代数的手法を用いて実施されました。(B、C)AML群とR_AML群のサンプル間で検出された遺伝子を示すベン図。サンプル制限領域は個々のサンプルで検出される遺伝子を示し、重複領域は2つ以上のサンプルで一般的に検出される遺伝子を表します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:差異遺伝子発現解析。 (A) 比較群間の差発現遺伝子(DEGs)の数を示す棒グラフ図。DESeq2で識別され、調整済みP値≤0.05および|log₂FoldChange|≥ 1.(B) DEGの火山プロット。x軸はlog₂FoldChange値を表し、y軸は-log10(P値)を表します。青い破線はDEG選択に使われるしきい値線を示します。(C) DEGの階層的クラスタリングヒートマップ。x軸はサンプル名を示し、y軸はDEGの正規化された式値を示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:差異発現遺伝子の機能豊か解析。 (A) GOエンリッチメントバーの区画。x軸はGO項を表し、y軸は濃縮重要性を示し、-log10(padj)で表されます。色はBP(生物学的プロセス)、CC(細胞成分)、MF(分子機能)を表しています。(B) GO エンリッチメントバブルプロット。x軸は各GO項に注釈されたDEGの比率とDEGの総数に対する比率を表し、y軸はGO項を示します。バブルサイズは注釈付き遺伝子の数に対応し、色のグラデーションは濃縮の重要性を表します。(C)ケッグのエンリッチメントバープロット。x軸はKEGG経路を表し、y軸は濃縮重要性を示します。(D) KEGGエンリッチメントバブルプロット。バブルサイズは注釈付き遺伝子の数を示し、色のグラデーションは濃縮の重要性を反映します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:GSEA濃縮およびタンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク解析。 (A) 選択された有意遺伝子セットの正規化濃縮スコア(NES)を示す棒グラフ。NES値が陽性であれば、新たに診断されたAML群では濃縮がR_AML群、NES値はNES値が増えていることを示します。(B) タンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク。各ノードはタンパク質を表し、各辺は連結したタンパク質間の相互作用を示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

プロトコルの重要なステップ

このバイオインフォマティックワークフローの成功裏の実行には、いくつかの重要なステップが不可欠です。まず、骨髄吸引液の即時凍結と適切な溶解(ステップ1.6)が極めて重要です。骨髄の微小環境はリボヌクレアーゼが豊富で、転写体の完全性を急速に劣化させる可能性があります³⁰。計算段階では、DESeq2パッケージ内で実験設計式の正しい構成(ステップ6.3)が正確な差異表現に不可欠です。特に臨床状態(新たに診断されたと再発したもの)を比較し、潜在的な交絡変数を考慮する場合に顕著です。最後に、遺伝子セット濃縮解析(GSEA)(ステップ9.6)における厳密な誤発見率(FDR)閾値を適用することは、偽陽性機能ネットワークの過剰解釈を防ぐための重要な統計的チェックポイントです。

改造とトラブルシューティング

この方法における一般的な課題は、臨床サンプルを長期間にわたって収集・配列決定する際に頻繁に発生するバッチ効果の存在です。分析前にバッチ変数を定義し、サンプル採取日、RNA抽出日、ライブラリ調製バッチ、シーケンスレーン、シーケンスランなどが含まれます。PCAやサンプル相関解析で、臨床表現型ではなくシーケンス日や他の技術的変数に基づくクラスタリングが判明した場合、ユーザーは統計的に可能な場合は差分表現設計の式にバッチ変数を含めるか、可視化³¹の前にComBatやSVAなどのバッチ補正アルゴリズムを適用してプロトコルを修正すべきです。.このプロトコルを骨髄吸引液ではなく全血に適用する場合、ライブラリー調製中にグロビンmRNA除去ステップを導入し、大量のグロビン転写がシーケンスリード深度を独占するのを防ぐことが重要な修正となります。ソフトウェアバージョンおよび代表的なワークフローの主要パラメータは以下のように補足されました:fastp v0.23.2、HISAT2 v2.0.5、StringTie v1.3.3b、featureCounts v1.5.0-p3、R v3.5.0、DESeq2 v1.20.0、clusterProfiler v3.8.1、org。Hs.eg.db v3.6.0、ペアエンド150 bpシーケンシング、1,000遺伝子セット置換を含むGSEA v4.2.3、MSigDB v7.5.1、高信頼度相互作用を持つSTRING v11.5、およびCytoscape v3.9.1です。代表的なコマンドラインパラメータと解析設定は 補足ファイル1に記載されています。

手法の限界

包括的ではありますが、このプロトコルには方法論的な制約があります。まず、バルクRNAシーケンシングを用い、骨髄吸引液全体の平均トランスクリプトムプロファイルを捉え、単細胞空間分解能を持たない。したがって、ワークフローは再発関連の上位シグネチャーが白血病幹細胞、間質細胞、免疫細胞、または細胞型組成の変化に由来するものかを特定^{できません。}次に、代表的なデータセットは小規模(n = 9)かつペアリングされていないため、統計的な堅牢性が制限され、決定的な因果推論ができません。第三に、ワークフローは完全にサイコ形式です。候補調節ハブやシグナル伝達経路を生成しますが、直交するin vitroまたはin vivoでの実験検証なしには、化学抵抗性における機能的必要性を独立して検証することはできません。

最近の単細胞および単細胞ゲノム研究により、細胞状態の異質性、クローン構造、治療関連進化をより高い解像度で解明し、AML参照枠組みが拡張されました。33,34,35,36。これらの手法は、ここで述べるバルクRNA-seqワークフローを補完するものであり、バルクシーケンシングはコホートレベルのトランスクリプトミックシグネーションに対して実用的かつコスト効率の高いスクリーニング戦略を提供し、単一細胞およびマルチオミック法は追跡研究で特定の悪性細胞または微小環境細胞集団に候補シグナルを割り当てるために使用されます。

既存の手法に対する重要性

これらの制約にもかかわらず、このトランスクリプトミックパイプラインは代替の診断・分析技術に比べて利点を提供します。従来のAML再発の臨床評価は、標的型多重qPCRパネルや標準的なフローサイトメトリーに依存することが多いです。迅速な診断には有用ですが、これらの標的手法はあらかじめ定義されたプローブに制約されており、既知の抵抗マーカーのみを評価できます¹⁹。偏りのないゲノムワイドトランスクリプトームシーケンスとネットワーク解析を組み合わせることで、既存の標的手法で見落とされがちな新規転写体やシステム全体の関連をノミネートできます。

重要性と潜在的な応用

本プロトコルで示された方法論は、再発に関連するトランスクリプトミック署名を優先して追加研究にできるため、トランスレーショナル血液学および個別化医療に関連しています。潜在的な後継応用としては、再発時に現れる表面抗原や免疫回避経路の指名があります。これらの候補は将来の検証研究の設計に役立ち、実験的に確認されればCAR-TやCAR-NK細胞戦略を含む次世代免疫療法の開発に寄与する可能性があります³⁷。これらの翻訳応用は、本データセットから確立された結論ではなく、仮説生成の目的と考えるべきです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA	RRID:SCR_019389	G2939BA
AMPure XP system	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	RRID:SCR_008452	A63881
cBot Cluster Generation System	Illumina, San Diego, CA, USA	-	SY-301-2002 or institution-specific system ID
clusterProfiler (Software)	Bioconductor	RRID:SCR_016884	v3.8.1
Cytoscape (Software)	Cytoscape Consortium	RRID:SCR_003032	v3.9.1
DESeq2 (Software)	Bioconductor	RRID:SCR_015687	v1.20.0
DNA Polymerase I	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	M0209L
dNTP Solution Mix	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	N0447L
edgeR (Software)	Bioconductor	RRID:SCR_012802	v3.22.5
fastp (Software)	OpenGene	RRID:SCR_016962	v0.23.2
featureCounts / Subread (Software)	The Walter and Eliza Hall Institute	RRID:SCR_012919	featureCounts v1.5.0-p3
GRCh38 reference genome	Genome Reference Consortium / Ensembl	-	GRCh38; Ensembl release 109
GSEA software	Broad Institute	RRID:SCR_003199	v4.2.3
HISAT2 (Software)	Johns Hopkins University	RRID:SCR_015530	v2.0.5
M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H-)	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	M0253L
MSigDB gene sets	Broad Institute	RRID:SCR_016863	v7.5.1
NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	E7760L/E7765L or laboratory-specific kit
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	E7770L
NovaSeq sequencing platform	Illumina, San Diego, CA, USA	RRID:SCR_016387	NovaSeq system; service-provider instrument ID
org.Hs.eg.db (Annotation package)	Bioconductor	-	v3.6.0
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	RRID:AB_2756816	F530L
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	RRID:SCR_018095	Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	-	Q32851
R software	R Foundation for Statistical Computing	RRID:SCR_001905	v3.5.0
Random Hexamer Primer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	-	SO142
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA	-	5067-1511
RNase H	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	M0297L
RNA-seq Library Prep Kit / Sequencing Service	Novogene, Beijing, China	-	Project No. X101SC25054246-Z01-J003
STRING database	STRING Consortium	RRID:SCR_005223	v11.5
StringTie (Software)	Johns Hopkins University / Center for Computational Biology	RRID:SCR_016323	v1.3.3b
TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS	Illumina, San Diego, CA, USA	-	PE-401-3001