この研究では、C57BL/6マウスにメチルニトロスリアを投与して網膜損傷を誘発し、その後ALDH2活性化剤および阻害剤をSIRT1および内質網体ストレス(ERS)調節剤と併用して治療しました。このプロトコルは、これらの治療が網膜変性に与える保護効果と、アルデヒド代謝への影響を調査することを目的としていました。
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研究記事
* These authors contributed equally
この研究では、C57BL/6マウスにメチルニトロスリアを投与して網膜損傷を誘発し、その後ALDH2活性化剤および阻害剤をSIRT1および内質網体ストレス(ERS)調節剤と併用して治療しました。このプロトコルは、これらの治療が網膜変性に与える保護効果と、アルデヒド代謝への影響を調査することを目的としていました。
本研究では、C57BL/6マウスにおけるメチルニトロソレア(MNU)誘発網膜損傷に対するアルデヒド脱水素酵素2(ALDH2)活性化、ダイジンによるALDH2阻害、およびシルトゥイン1(SIRT1)および小胞体ストレス(ERS)の調節効果を調査しました。72匹のマウスが8つのグループに無作為に割り当てられ、対照群、MNU単独グループ、各種治療併用グループが含まれていました。マウスには、ALDH2-SIRT1-ERS軸をそれぞれ標的とした作動薬および阻害剤の腹膜内注射を投与しました。治療後2日目と4日目に体重、網膜層の厚さ、アルデヒド代謝バイオマーカーを評価しました。MNU投与は網膜変性を引き起こし、対照群を除くすべてのグループで有意な体重減少を遂げました。アルダ-1による治療で網膜損傷は軽減されましたが、ダイジンはそれを悪化させました。SIRT1の薬理学的阻害(EX-527経由)はAlda-1の保護効果を低下させ、ERS誘導(TUN経由)はその効果をほぼ無効化しました。逆に、SIRT1活性化(SRT1720による)はダイジンの副作用を軽減し、ERS阻害(4-PBAによる)はダイジンの影響を部分的に緩和しました。さらに、MNUはアルデヒド代謝マーカー(マロンジアルデヒド[MDA]および4-ヒドロキシ-2-ノネナール[4-HNE])のレベルを増加させ、アルダ-1はこれらの値を減少させ、ダイジンはこれらを高めました。さらに、SIRT1/ERS経路の薬理学的調節がアルダ-1およびダイジンのアルデヒド代謝に対する調節効果に介入しました。全体として、ALDH2の活性化は網膜構造を保護し、アルデヒド代謝を調節し、ALDH2-SIRT1/ERSシグナル伝達軸が網膜変性を緩和する上で重要な役割を果たすことを強調しました。
網膜変性症は世界的に失明の主な原因であり、網膜色素変性症(RP)、加齢黄斑変性症(AMD)、糖尿病網膜症(DR)などの疾患を含みます。これらは何百万人もの個人に影響を及ぼし、社会経済的にも大きな負担を強います1,2,3。しかし、臨床現場でこれらの盲目化網膜疾患の進行を止めるための非常に効果的な薬理学的治療法は現在不足しています。網膜変性の病因は多因子的であり、酸化ストレス、慢性炎症、網膜細胞の恒常性を乱す内質網体ストレス(ERS)が関与します。これらのストレス要因はしばしば内部代謝調節障害(例:ミトコンドリア機能障害)によって引き起こされ、最終的にはアポトーシスや不可逆的な網膜損傷につながります4.強力なDNAアルキル化剤であるメチルニトロスレア(MNU)は、網膜変性のモデル化に広く利用されている化学誘導剤として注目されています。MNU誘発性網膜疾患モデルは、疾患のメカニズムを調査し、治療介入の可能性を評価するための貴重なツールとなります。機構的には、MNUは活性酸素種(ROS)を生成し酸化還元バランスを乱すことで酸化ストレスを誘発し、その結果、光受容体の膜や細胞小器官を損傷します。また、アルデヒド代謝にも影響を及ぼし、脂質過酸化の解毒を妨げる可能性があります。その後の有毒アルデヒドの蓄積は酸化的損傷を悪化させ、光受容体のアポトーシスを増幅させる可能性があります。
アルデヒド脱水素酵素2(ALDH2)は、ミトコンドリアのNAD+依存性酵素であり、4-ヒドロキシ-2-ノネナール(4-HNE)やマロンジアルデヒド(MDA)などの有毒アルデヒドを活性の低いカルボン酸に変換することで解毒する重要な役割を果たします。これにより酸化的損傷を防ぎます7。強力なALDH2活性は酸化還元恒常性維持に不可欠であり、ALDH2機能の低下は加速老化や神経変性病変と関連しています8。ALDH2の薬理学的活性化、特に小分子作動薬Alda-1を用いて、さまざまなモデルで細胞保護効果を発揮することが示されています(9,10)。シルトゥイン1(SIRT1)は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド+(NAD+)依存性脱アセチルラーゼであり、p53および核因子カッパB(NF-κB)を含む転写因子を調節することでストレス応答とエネルギー代謝を調節します11。SIRT1の活性化はミトコンドリア機能と細胞生存の促進に有望であることが示されており、そのアップレギュレーションが網膜変性における酸化損傷や炎症の減少と関連していることが研究されています12。誤った折りたたまれたタンパク質の蓄積によって引き起こされる小胞体ストレス(ERS)は、折りたたみたまれないタンパク質応答(UPR)を活性化し、慢性ストレスの下でアポトース促進カスケードとなることがあります。ERSは網膜変性に関与し、光受容体アポトーシスに寄与していることが示唆されています。これらの発見にもかかわらず、MNU誘発網膜変性モデルにおけるALDH2、SIRT1、ERSの具体的な相互作用は依然として十分に解明されていません。さらに、これらの相互に結びついた経路の協調的な役割については、さらなる体系的な調査が必要です。
したがって、本研究では、ALDH2-SIRT1-ERS軸の主要成分—ALDH2(Alda-1またはDaidzin経由)、SIRT1(SRT1720またはEX527経由)、およびERS(4-PBAまたはTUN経由)—がC57BL/6マウスにおけるMNU誘発網膜損傷に与える影響を調査することを目的としました。組織病理学的および生化学的解析を用いて、この軸を標的化することが光受容体の生存率およびアルデヒド代謝にどのように影響するかを調べました。ALDH2の活性化、SIRT1の強化、ERSの抑制がMNU誘発性網膜変性を相乗的に緩和し、網膜変性疾患におけるこの軸の標的化の根拠を提供すると仮説を立てました。
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倫理的声明
すべての実験プロトコルは福建医科大学福宗臨床医学院の実験動物ケア・利用委員会によって審査・承認され、視覚・視覚研究協会(ARVO)の眼科学・視覚研究における動物利用に関する声明に厳格に従って実施されました。
動物と群れの割り当て
認定された供給者から、72匹の雄C57BL/6マウス(生後8〜10週、体重20〜25g)が、実験動物繁殖の国家基準に準拠して取得されました。マウスは、12時間の明暗サイクル、温度管理(22 ± 2 °C)、相対湿度(50% ± 10%)を含む標準化された環境条件下で個別に換気されたケージに収容され、自由に餌や水を得られました。ALDH2、SIRT1、ERS経路がMNU誘発性網膜損傷に与える調節効果を調べるため、マウスは8つの実験群(n=9群、n=5群、n=4群)に無作為に割り当てられ、選択バイアスを最小化するためにコンピュータ生成のランダム化シーケンスを用いました。研究の図示要約は 図1に示されています。
試薬の調製および処理の手順
本研究で使用された実験試薬は 材料表に記載されており、調製方法と用量の詳細は以下の通りです。(1) MNU(50 mg/kg):100 mgのMNUを2 mLの生理食塩水に溶かし、50 mg/mLの溶液を準備しました。その後、この溶液1.4 mLを5.6 mLの生理食塩水で希釈し、最終濃度10 mg/mLにして動物投与しました。(2) アルダ-1(10 mg/kg):50 mgのアルダ-1粉末を1 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、50 mg/mLの溶液を製製し、24 mLの生理食塩水で希釈して最終濃度2 mg/mLにしました。(3) ダイジン(10 mg/kg):50 mgのダイジン粉末を1 mLのDMSOに溶けて50 mg/mL溶液を製製し、その後24 mLの生理食塩水で希釈して最終濃度2 mg/mLにしました。(4) EX-527(10 mg/kg):EX-527粉末5 mgを0.1 mLのDMSOに溶かし、50 mg/mL溶液を製製し、2.4 mLの生理食塩水で希釈して最終濃度2 mg/mLにしました。(5) SRT1720(10 mg/kg):5 mgのSRT1720粉末を0.1 mLのDMSOに溶かし、よく混合しました。その後、PEG300 400 μL、Tween-80 50 μL、生理食塩水450 μLを加え、2 mg/mLの作動溶液を合成しました。(6) TUN(10 mg/kg):5 mgのTUN粉末を0.1 mLのDMSOに溶けて50 mg/mL溶液を製造し、その後2.4 mLの生理食塩水で希釈して最終濃度2 mg/mLにしました。(7) 4-フェニルブチル酸(4-PBA;10 mg/kg):4-PBA粉末2 mgを1 mLの生理食塩水に溶かし、2 mg/mLの溶液を製製しました。上記の投与量はすべて5× Mミリリットル(M=動物体重kg)でした。その後、マウスは以下の処理プロトコルで8つのグループに分けられました。
対照群:生理食塩水の腹膜内注射を単回。
MNU群:MNUの腹腔内注射を単回。
MNU + Alda-1群:腹膜内注射のAlda-1を行い、その後2時間後に単回のMNU投与。その後、Alda-1は1日1回腹腔内に投与されました。
MNU + ダイジン群:腹膜内ダイジン注射、その後2時間後に単回投与MNU注射。その後、ダイジンは1日1回腹腔内投与されました。
MNU + Alda-1 + EX-527群:Alda-1腹腔内注射、1時間後にEX-527注射、さらに1時間後にMNU注射(単回投与)。その後、Alda-1は1日1回腹腔内に投与されました。
MNU + Alda-1 + TUN群:Alda-1の腹腔内注射、1時間後にTUN注射、さらに1時間後にMNU注射を行います。その後、Alda-1は1日1回腹腔内に投与されました。
MNU + ダイジン+SRT1720群:腹腔内注射ダイジン、その後1時間後にSRT1720注射、さらに1時間後にMNU注射を行います。その後、ダイジンは1日1回腹腔内投与されました。
MNU + ダイジン+4-PBA群:腹膜内注射ダイジン、その後1時間後に4-PBA注射、さらに1時間後にMNU注射を行います。その後、ダイジンは1日1回腹腔内投与されました。
体重管理
全身毒性および治療関連の生理的影響は、MNU投与後4日間、各マウスの体重を毎日記録することでモニタリングされました。体重は精密なデジタルスケールで測定され、精度は±0.1 gで、グループ間の体重減少または増加の傾向を追跡するデータが記録され、治療耐性および全身ストレスの間接的な指標となりました。
網膜組織病理検査
実験後2日目および4日目の時点で、マウスは麻酔後に子宮頸部脱臼により、50〜60 mg/kg体重の用量で腹腔内注射(ip)注射を行い、施設安楽死ガイドラインを厳守しました。目、特に左目はすぐに摘除されました。摘出前に、鼻の縁部に小さな切開をして向きを示しました。その後、球体は4%パラホルムアルデヒド(PFA)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)に4°Cで24時間浸けて固定しました。固定された眼はその後、段階化されたエタノール系列(70%、80%、95%、100%)で脱水され、キシレンでクリアされ、組織学的処理のためにパラフィンブロックに埋め込まれました。埋め込み時には、標識のある鼻側を下に配置することで向きが標準化されました。
中心網膜領域の代表的なサンプリングを確保するため、視神経頭(ONH)を通る回転マイクロトームを用いて、厚さ5μmの連続切片が製作されました。具体的には、上側から鼻端にかけて切断され、すべてのセクションがONHを通過するようにしました。その後、セクションは正に帯電したガラススライドに取り付けられました。ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色は標準プロトコルに従って行われました。網膜の形態は400×倍率の光学顕微鏡で評価されました。ONHからあらかじめ決められた距離(200、400、600、800、1000、1200μm)で側頭網膜から体系的に測定が行われました。各部位で網膜の総厚さ、内外節(IS/OS)長、外核層(ONL)、外層プレキシフォーム層(OPL)、内核層(INL)を測定しました。
客観性を確保し測定バイアスを最小限に抑えるために、厳格な品質管理プロトコルが導入されました。具体的には、8つの実験グループそれぞれが5つまたは4つのサブグループ(例:サブグループ1、2、3、4、5)に細分化されていました。5人または4人の独立した観察者がグループ割り当てを盲検にされ、すべての実験グループで対応するサブグループを測定するよう割り当てられました(例:オブザーバーAは常にすべてのグループからサブグループ1を測定しました)。各測定点で、約5μmの範囲内で3回の測定値(例:200μm、195μm、205μm)を取得し、技術誤差を最小限に抑えるために平均化しました。定量測定はImageJソフトウェア(バージョン1.54g)を用いて行われ、各点の平均厚さ値を計算して再現性を確保しました。
アルデヒド代謝マーカー
酸化ストレスおよびアルデヒド代謝を評価するため、血清サンプルからMDAおよび4-HNEレベルが分析されました。これらは脂質過酸化およびアルデヒドストレスの重要なバイオマーカーです。具体的には、すべてのマウスに対して、体重50〜60 mg/kgの用量で腹膜内注射(iP.)ペントバルビタールナトリウムを麻酔しました。マウスが深く麻酔された後、頸椎脱臼による安楽死が行われました。安楽死直後、眼球を摘出し、迅速に後球内出血を採取しました。サンプルは室温で30分間凝固させ、その後3,000× g で10分間遠心分離しました。血清分数は酵素フリーのマイクロ遠心分離管に慎重に移され、-80°Cで保存され、その後の分析まで待った。血清MDAレベルは、製造元のプロトコルに従い、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キットを用いて測定されました。簡単に言うと、標準試験とサンプルはあらかじめコーティングされたマイクロプレートに加え、特異的一次抗体で培養され、未結合物質を除去するために洗浄され、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)結合した二次抗体と反応しました。次にテトラメチルベンジジン(TMB)基質を加え、反応を硫酸で終えました。マイクロプレートリーダーを用いて450 nmで光学密度(OD)値を読み取り、MDA/4-HNE濃度は既知の分析物濃度を用いた標準曲線とOD値を比較して決定しました。
統計解析
すべてのデータは平均±標準誤差(SE)として提示されました。サンプル数が小さいため(第2日グループはn = 5、第4日グループはn = 4)、ブートストラップ検定の統計手法が用いられました。具体的には、Bootstrap再サンプリング法(置換1,000回の反復)を用いて、グループ平均の95%信頼区間(CI)を推定し、グループ間の違いを比較しました。各アウトカム(例:重量、網膜厚、MDA/4-HNEレベル)ごとに、元のデータセットからブートストラップサンプルを抽出し、各再サンプルごとに平均を算出しました。95%信頼区間はブートストラップ分布の2.5パーセンタイルおよび97.5パーセンタイルから導出されました。有意性は信頼区間を検討して間接的に評価されました。ブートストラップ結果の信頼区間にゼロが含まれていなかった場合、これは通常、差が有意であることを示しました(2つ以上のグループ間の平均比較を仮定した場合)。図形はGraphpadソフトウェア(バージョン5.01)を使用して生成されました。
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体重の変化
実験前は、グループ間で体重に有意な差はありませんでした。実験の2日後、対照群を除き、対照群は体重が17.0 ± 0.5 gから17.4 ± 0.4 gに増加しましたが、他のすべてのグループのマウスの体重は有意に減少しました。具体的には、MNU群マウスは17.4 ± 0.3 gから16.2 ± 0.2 gに減少し、MNU + Alda-1群は17.3 ± 0.3 gから16.7 ± 0.4 g、MNU + Daidzin群は17.3 ± 0.3 gから16.2 ± 0.3 g、MNU + Alda-1 + EX-527 グループは17.3 ± 0.4 gから16.7 ± 0.2 g、MNU + Daidzin + SRT1720 グループは17.2 ± 0.4 gから16.2 ± 0.4 gに減少しました。 MNU + Alda-1 + TUN群は17.5 ± 0.3 gから16.1 ± 0.2 g、MNU + Daidzin + 4-PBA群は17.2 ± 0.2 gから16.4 ± 0.3 gにまで増加しました。体重...
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以前の研究では、ALDH2作動薬がMNU誘発性網膜変性に対する保護効果をもたらす可能性が示唆されていました14。しかし、その阻害剤の介入効果やSIRT1やERSなどの潜在的な下流経路については、詳細に探求されていませんでした。SIRT1およびERSが網膜変性モデル、特に光誘発性網膜変性や網膜変性を持つ遺伝子組み換えマウスを含む研究に関与していることを示す研究があります15,16。本研究の主な発見は、MNUが網膜変性を誘発し、アルデヒドのレベルを有意に上昇させることでした。ALDH2作動薬およびそれに対応する阻害剤は、網膜変性やアルデヒドレベルを緩和または悪化させる可能性があります。さらに、SIRT1およびERSの調節がALDH2の効果に介入的な役割を果たしました。
網膜厚の介入に関しては、MNUの主な影響は外核層(ONL)に及んだ一方、外側の神経質層(...
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著者らは本論文の研究、著者、出版に関して潜在的な利益相反を一切認めていません。
この研究は、中国国家自然科学基金(No. 82301245)、福建省科学技術イノベーション共同基金(No. 2024Y9653)、福建省自然科学基金(No. 2024J011148)、および福州総合病院博士後科学基金(助成金番号:48678)からの助成金によって支援されました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 4HNEキット | Elabscience,中国 | E-EL-0128 | 血清4HNEレベル測定用 |
| 4-フェニル酪酸（4-PBA） | MCE、米国 | HY-A0281 | ERS阻害用試薬 |
| Alda-1 | MCE、米国 | HY-18936 | 研究用ALDH2活性化剤 |
| ダイジン | MCE、米国 | HY-N0018 | 研究用ALDH2阻害剤 |
| フルオレセインナトリウム | 広州 | N/A | フルオレセイン血管造影システムで取得した画像を用いて使用。血管造影画像は漏出、非灌流領域、または網膜血管形態の変化の有無について分析されました。 |
| ImageJソフトウェア | 米国国立衛生研究所 | バージョン1.53t | |
| MDAキット | Beyotime、中国 | S0131S | 血清MDAレベル測定用 |
| N-ニトロソ-N-メチルウレア（MNU） | MCE、米国 | HY-34758 | 網膜変性を誘発するためのDNAアルキル化剤 |
| パラホルムアルデヒド | Sigma-Aldrich、米国 | 30525-89-4 | 網膜組織の切片用 |
| 精密デジタルスケール | 電子計量、中国 | SF-400 | 容量：5000 g ± 1 g/177ozX0.10z、各マウスの体重記録用 |
| Prism | GraphPad | バージョン5.01 | 統計分析ソフトウェア |
| ロータリーミクロトーム | LEICA、ドイツ | RM2016 | 網膜切片調製用 |
| セリシスタット（EX-527） | MCE、米国 | HY-15452 | 研究用SIRT1阻害剤 |
| ペントバルビタールナトリウム | Sigma-Aldrich、米国 | 1.93248 | 後の研究のために腹腔内（IP）注射による麻酔用 |
| SRT1720 | MCE、米国 | HY-10532 | 研究用SIRT1活性化剤 |
| スミアンシン | 吉林省勝達動物薬業有限公司 | N/A | 後の研究のために腹腔内（IP）注射による麻酔用 |
| チュニカマイシン（TUN） | MCE、米国 | HY-A0098 | ERS誘導用試薬 |
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