エイズ患者の ノカルジア・コンカバ による額膿瘍の症例報告

サマリー

ここでは、免疫抑制患者のノカルジア感染に対する、膿培養とMALDI-TOF多発性硬化症を統合したプロトコルを提示します。この複合的なアプローチにより、迅速かつ正確な種の同定が可能になり、標的型抗菌治療が可能になり、最終的にはこの高リスク患者集団の臨床結果が向上します。

要約

ノカルディア属は義務好気性放線菌です。ヒトのノカルジア症は通常、免疫抑制を受けた宿主に発症し、最も一般的には一次化膿性肺感染症として現れます。血源性の転移は肺外浸潤を引き起こすことがあり、中枢神経系が最も頻繁に二次部位となり、次いで皮膚や皮下軟部組織が続きます。心膜、リンパ節、関節はまれにしか影響を受けません。50歳のHIV陽性男性が、口内の血ぶくれと四肢の湿疹の既往歴が1か月で入院しました。入院中に発生した右額膿瘍から膿が出ており、マトリックス支援レーザー脱着/イオン化飛行時間質量分析(MALDI-TOF MS)によりノ カルディア・コンカバ と特定され、16S rRNA遺伝子配列解析で確認されました。初期管理には抗レトロウイルス療法、全身性グルココルチコイド、静脈内免疫グロブリンが含まれ、その後、微生物学的確認に基づきリネゾリドとトリメトプリム-スルファメトキサゾールを組み合わせた標的抗菌治療を実施し、臨床的改善と退院を得ました。私たちの知る限り、これは後天性免疫不不全症候群(AIDS)患者における N. concava による額の膿瘍感染の初の症例報告です。この病原体による人間の感染は非常に稀です。さらに、この症例の感染部位は、ノカルジウム症に通常関与する一般的な肺や中枢神経系ではなく、これにより診断見逃や誤診が起こりやすい非典型的な臨床症状が見られました。この場合、正確な病因の特定により早期の確定診断と良好な臨床結果が得られました。この症例は、重度免疫不全患者における稀なノカルジア感染に対する警戒強化の重要性を強調しています。原因不明の皮膚および軟部組織膿瘍の場合、早期の病因検査が重要であり、薬剤感受性に基づく標的型抗菌療法は予後を大幅に改善します。

概要

ノカルディア属は好気性放線菌で、自然環境に広く分布し、土壌や腐敗する有機物に多く生息しています。自然界では至る所に存在しますが、通常は人体には存在せず、機会主義的な病原体として機能します。ほとんどの感染症は吸入によって起こります^。1.ノカルジオシスは主に免疫抑制のある個人、特に悪性腫瘍、糖尿病、HIV/AIDS、自己免疫疾患、臓器移植受容者、長期にわたるコルチコステロイド療法を受ける患者など、細胞介在性免疫が低下している人々に影響を及ぼします²。しかしながら、免疫不全が見られない個人でも感染が起こることがあります^。ノカルジアは主に呼吸器を経由して侵入し、肺疾患を引き起こし、その後血源性に広がって肺外臓器の病積を引き起こすことがあります。脳が最も一般的な転播部位であり、次いで皮膚や皮下軟組織が続きます。まれに、心膜、リンパ節、関節に影響が及ぶこともあります。臨床的には、ノカルジアは肺、皮膚、中枢神経系に関与する急性または慢性、局所性または広在性の化膿性肉芽腫性炎症を引き起こす可能性があります⁴.

これまでに、N. concavaによる人間の感染はほとんど報告されていません。ここでは、N. concavaに起因するHIV陽性患者の額膿瘍の初の記録例を提示し、ノカルジア症の診断と管理に貴重な洞察を提供します。

ケースプレゼンテーション:
50歳の男性患者が、口腔の血ぶくれと四肢の紫斑性病変を1か月間患病的に患って入院しました。彼は10年以上前にHIV感染と診断されていましたが、抗レトロウイルス療法を一貫して続けていなかったのです。入院約1か月前に、原因不明の口腔血腫と四肢紫斑を発症し、当初は地元の病院でビクターヴィ(ビクテグラビル/エムトリチタビン/テノフォビル・アラフェナミド)で抗レトロウイルス治療を受けました。さらなる検査の結果、免疫性血小板減少症(ITP)が疑われ、メチルプレドニゾロンと静脈内免疫グロブリン(IVIG)によるパルス療法、胃保護およびカルシウム補給を受けました。

持続的な血小板減少症のため、患者は当院に紹介され、さらなる管理が行われました。入院時の体温は37.9°Cで、彼は意識がはっきりしていて、方向感覚も良く、全体的な体調も良好でした。皮膚や強膜に黄疸は観察されなかった。全身に広範囲に点状出血と赤皮状出血が認められ、右前頭部には触感できる腫瘤が見られました。造影なしの胸部CTでは、両側の下葉に間質性変化、上葉のパラセプタル肺気腫が認められました。腹部超音波では有意な異常は認められませんでした。

翌日の検査では血小板数が12×10⁹/L(83–303 × 10⁹/L)、プロカルシトニンレベルは0.11 ng/mL(<0.50 ng/mL)、高感度C反応性タンパク質(CRP)は1.11 mg/L(<6.00 mg/L)でした。補助・誘導リンパ球(CD3+、CD4+)の絶対数は15細胞/μL(550–1440細胞/μL)でした。定量ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイでは、エプスタイン・バーウイルス(EBV)DNAを1.21 ×^{10 4} IU/mL(0–200 IU/mL)で検出し、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)DNAは4.53 ×⁵ IU/mL(0–200 IU/mL)で検出され、いずれも陽性でした。その他の定期血液検査は特に異常なしでした。

HCMVウイルス血症が確認されたため、患者はガンシクロビルとフォスカルネットの併用抗ウイルス療法を開始し、HIV抑制のためのビクターヴィを継続しました。ITPにはパルス用量メチルプレドニゾロンおよびIVIGが維持されました。持続的な低熱のため、入院6日目にリツキシマブを投与し、口咽カンジダ症の予防として7日目にボリコナゾールを開始しました。

入院時の身体検査で右前頭部に腫瘤が見つかりました(図1)。入院6日目には、この病変から膿性物質を吸引して微生物学的評価を行いました。膿の直接グラム染色により、豊富な分岐状の糸状グラム陽性菌が認められました(図2)。標本の一部はコロンビア産天プレートに接種され、5〜10%のCO₂濃縮大気中で35°Cで培養されました。24時間の潜伏後、白く、膨らみ、乾燥しわがあり、粒状で溶血性のないコロニーが観察されました。潜伏5日目までに、群落は淡い黄色の色素を帯びていきました(図3)。分離株の修飾酸難性染色により、部分的に酸に長く、部分的に非酸に長性の生物が得られました(図4)。

Autobio MS2000システムを用いたMALDI-TOFのMSでは、この生物がN. concavaと特定されました(図5)。この同定は後に16S rRNA遺伝子配列解析によって確認され、分離株もN. concavaとして分類されました。抗菌薬感受性検査が行われ、その結果は表1にまとめられています。CLSI M24ガイドラインに基づくノカルディア属の感受性結果は、すべての検査薬剤に対する感受性を示しました。

8日目にグラム陽性菌が豊富な検査結果を受けて、ボリコナゾールは中止され、リネゾリドおよびトリメトプリム–スルファメトキサゾールとの併用抗菌療法を開始しました。患者の体温は徐々に正常化し、臨床的な改善が見られました。入院18日目に患者は容態改善で退院し、経口リネゾリドとメチルプレドニゾロンの処方を受けて外来治療を継続しました。

診断、評価、計画:
患者は絶対的なCD4+ Tヘルパー/誘導細胞数が低いエイズを患っており、日和見感染症の素因があります。検出可能なCMVおよびEBV DNAは、活性細胞メガロウイルスおよびエプスタイン・バーウイルスの複製の可能性を示しています。身体検査で右額に膿瘍と散在する点状・紫斑が見つかりました。額膿瘍から吸引された膿により、MALDI-TOF MS.によって N. concava と識別されたコロニーが見つかりました。

胸部CTでは両側の下葉間質変化が認められました。肺ノカージア症やHIV/CMV関連間質性肺疾患を除外するためにフォローアップが必要です。膿瘍は切開・排膿され、血小板減少症が管理され、患者はノカルジア症のために経口リネゾリドとトリメトプリム–スルファメトキサゾールを投与されて退院しました。

退院後のモニタリングには、骨髄抑制や免疫再建炎症症候群の有無を監視するための週1回のCBCおよび肝・腎臓プロファイルの検査が含まれます。発熱、新たな結節、出血、神経症状がある場合は直ちに再入院が必要です。

プロトコル

研究プロトコルは浙江大学医学院第一附属病院の医療倫理委員会によって承認されました。(参照番号:IIT20240874A)

1. 患者評価と初期評価

1. 詳細な病歴が収集されました。
   1. 受診の1か月前、患者は特定可能な誘発因子なしに四肢に口腔内血疱や湿疹を発症しました。
   2. その後、患者は地元の病院で治療を受け、ビクターヴィが抗レトロウイルス療法として開始され、血栓形成薬が投与されました。それでも、血液学的な改善は見られませんでした。
2. 身体検査では、患者は低度の発熱状態であることが確認されました。全身に散在する点状出血や赤状状が観察され、右前頭部には明確に限定された腫瘤が見られました。
3. 実験室での調査
   1. 全血球計数(血小板計数):全血(3 mL)をエチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)を含むチューブに採取し、8〜10回優しく逆さまにして、採血後4時間以内に分析しました。
   2. 血清C反応性タンパク質およびプロカルシトニンアッセイ:血液(2〜3 mL)を血清分離管に抽出し、20〜30分間凝固させ、1,500〜2,000 × g で10分間遠心分離し、採取当日に分析しました。
   3. リンパ球サブセットのフローサイトメトリー列挙(CD3/4/8/16/19/45/56):全血(3 mL)をEDTAチューブに採取し、適切な抗凝固を確保するために8〜10回優しく逆にし、採取後24時間以内に解析しました。
   4. エプスタイン–バーウイルスおよびサイトメガロウイルスDNAの定量的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR):全血(3 mL)をEDTAチューブに抽出し、8〜10回優しく逆にし、2–8°Cで維持し、採取後4時間以内に輸送しました。血漿は採血後2〜4時間以内に遠心分離で分離され、分析を待つ間4°Cで保存されました。

2. 診断手順

1. 右額膿瘍の超音波誘導誤嚥:
   1. 標準的な皮膚消毒と無菌ドレープの後、局所浸潤麻酔を2%リドカインで投与しました。リアルタイム超音波指導のもと、20mLの注射器に針を取り付けて額膿瘍に挿入し、膿性液体4mLを吸引しました。
   2. 患者は血行動態が安定しており、手術中ずっと不快感は報告されませんでした。処置後の期間中に即時の合併症は認められませんでした。
2. 膿性吸引液は微生物学の研究室に送られ、即時グラム染色と5〜10%のCO₂、35°Cでの培養が行われました。
   1. グラム染色の場合は、まずきれいなガラススライドで細菌の塗抹を準備し、炎で固定し、その後1分間クリスタルバイオレットの染色を施し、その後水ですすぎます。
   2. 次に、ヨウ素溶液を媒染剤として1分間加え、水ですすいでください。その後、95%エタノールで約20〜30秒間脱色し、流出水が無色になるまで続け、すぐに水で洗い流して脱色を止めます。
   3. 最後に、サフラニン溶液で30秒から1分間カウンターステインを塗り、水ですすぎて乾かし、顕微鏡で観察します。
3. 血液寒天プレートからループいっぱいのコロニーを選び、修正酸ファスト染色を施しました。
   1. 修正酸性ステインのために、まずきれいなガラススライドで細菌塗りを準備し、炎で固定し、カーボルフクシン染色で塗り、蒸気が沸騰せずに上がるまで加熱し、3〜5分間維持し、その後水ですすぎます。
   2. その後、1%硫酸水溶液で30秒から1分間、薄いピンク色になるまで弱い脱色を行い、水ですすいでください。
   3. 最後に、メチレンブルー溶液でカウンターステインを30秒から1分かけて塗り、水ですすいでから乾かし、顕微鏡で観察します。
4. 自動質量分析の微生物同定システムを用いて同定を行い、分離株は N. concavaと特定されました。
   1. 試料の調製
      1. ターゲットプレートの準備:竹の棒で純粋な単一のコロニーを摘み取り、MALDIターゲットプレートのターゲットスポットに均一に塗り付けました。
      2. 蟻酸添加:塗布状を空気乾燥させた後、細胞溶解のために各標的部位に1μLの蟻酸を加えました。
      3. マトリックス追加:スポットが完全に自然乾燥した後、1μLのマトリックス溶液(α-シアノ-4-ヒドロキシシンナミン酸、HCCA)をすぐに重ね、プレートを再び自然乾燥させました。
   2. 電源を入れてソフトウェアをセットアップします。
      1. 機器の電源、真空ポンプ、コンピューターをオンにし、真空が正常に動作するまで待ちます。ワークステーションのソフトウェアを起動してログインしてください。
      2. ソフトウェアと機器間の通信が正常であることを確認し、真空、温度、レーザーの状態がすべて正常であることを確認してください。
   3. ソフトウェアに情報を入力します。
      1. ターゲットプレート管理モジュールの登場です。ターゲットプレートタイプを選択し、新しいバッチを作成し、サンプルID、種類、供給源、コメントなどのサンプル情報を入力します。
      2. ターゲットプレート情報を保存し、対応する識別データベースを選択して比較します。
   4. 機器を操作し、データを取得してください。
      1. 乾燥したターゲットプレートを器具室に入れ、室の扉を閉めます。ソフトウェアで 「ターゲットプレートを実行 」を選択し、ターゲットプレートのIDと位置を確認してください。
         注:このソフトウェアはレーザー励起、イオン飛行、信号取得、スペクトル生成を自動的に完了します。取得進捗とスペクトラム品質のリアルタイム監視が可能です。
   5. データ解析と識別
      1. スペクトル処理:ソフトウェアは生スペクトルに対して自動的に平滑化、ベースライン補正、ピーク抽出を行います。
      2. データベース比較:処理済みの特徴ピークスペクトルを、機器に組み込まれた既知細菌の標準スペクトルデータベースと比較します。
      3. 結果解釈:ソフトウェアは比較類似度に基づく識別結果とスコアを提供します。一般的に、スコア9.0≥種レベルでの信頼できる同定を示します。6.0から8.9のスコアは属レベルに同定されていることを示します。6.0未満のスコアは信頼性に欠けるとみなされます。
      4. 報告およびデータ管理:生スペクトル、識別結果、ログが自動的に保存されます。データはエクスポートされ、統計的に分析され、LISと連携できます。
   6. シャットダウン手順
      1. すべてのタスクを完了したら、操作インターフェースを終了します。ソフトウェアでスタンバイモードに入り、計器が安全に減圧するのを待ち、ソフトウェアとコンピューターを閉じ、最後に計器と真空ポンプの電源を切ります。
5. 抗菌感受性検査
   1. コロニーを摘み取り、研磨棒やガラスビーズで滅菌水で均一な懸濁液を準備し、濁度0.5に調整します。 ノカルディア は塊を形成しやすいため、均一な懸浮液を確保するために徹底的な研ぎ込みが必要です。
   2. 次に、陽イオン調整ミューラー・ヒントンブロス(CAMHB)を含むマイクロ希釈プレートの各ウェルに細菌懸濁液を加え、1ウェルあたり10μLを接種して最終接種量を約1 × 10 5–5 ×^{10 5} CFU/mLにし、同時に抗生物質なしの増殖コントロール井戸と陰性対照井戸を設置します。
   3. マイクロプレートを35±±2°Cの常温空気で3〜5日間培養し、培養中はプレート蓋を密閉して乾燥を防ぎます。
   4. 培養後、肉眼で各ウェル内の細菌増殖を観察し、成長を完全に抑制する最低薬剤濃度(MIC)を記録します。

3. 抗生物質治療

1. 入院直後、抗ウイルス薬と免疫抑制薬の併用療法を開始しました。ガンシクロビルとフォスカルネットを併用し、HIV抑制のためのビクターヴィを継続し、メチルプレドニゾロンと静脈内免疫グロブリンを用いたパルス療法を同時に開始しました。
2. 6日目:再発性の微熱によりリツキシマブを治療に加えました。
3. 7日目:侵襲性真菌感染の可能性を未然に防ぐため、経験的ボリコナゾール投与を開始しました。
4. 8日目:顕微鏡検査でグラム陽性菌が豊富に検出されました。ボリコナゾールは中止され、抗菌療法はすぐにリネゾリドとトリメトプリム-スルファメトキサゾールに切り替えられました。その後、延期が行われ、患者の臨床状態は徐々に改善していきました。彼は18日目に安定した状態で退院しました。

結果

50歳のHIV陽性男性患者が全身性点状点状、赤血病、口腔ヘルペスを訴えました。入院後、彼は経験的な抗ウイルス薬および血栓形成療法を受けました。身体検査で右額に腫瘤が見つかった。超音波誘導吸引(図1)は膿を採取するために行われ、検査室での検査に用いられました。グラム染色の結果は 図2に示されており、酸速染の結果は 図4に示されています。

MALDI-TOFMSの同定後(図5)、コロンビアの血液寒天上のコロニー形態により N. concava 感染が確認されました(図3)。16S rRNAシーケンスのために、株は商業研究所(RuiBio BioTech)に送られました。株の16S rRNA配列はNCBIウェブサイトのBLASTを用いて比較され、NR_040996.1と≥99...

ディスカッション

ノカルディアは好気性のグラム陽性細菌で、アクティノバクテリア門、アクチノバクテリダエ亜綱、アクチノミセタレス目、コリネバクテリナ亜目、ノカルディア科、ノカルディア属¹⁵に分類されます。100種以上が同定されており、人間や動物で最も一般的な病原体はN.asteroides、N. brasiliensis、N. farcinica、N. cyriacigeorgica¹⁶です。ノカルジオシスの最初の報告例は1890年にエッピンガーによって記録^{され、肺炎}と脳膿瘍が関与していました。中国で最初に報告された症例は1980年に発生しました。近年では、特に免疫不全の患者で長期化学療法を受けているか、高用量の免疫抑制剤を受けている患者で、発症率が増加...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5–10% CO2 インキュベーター	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	20172416507
酸性断続ステイン	バソ	20170094
Autof MSシリーズ	Autobio Diagnostics	https://en.autobio.com.cn/Product/productDetail/fid/63/cid/2/id/145.html
Autof MS2000	Autobio Diagnostics	20182400196
蟻酸	Autobio Diagnostics	20140009
グラムステイン	バイオメアキュート;リュー	20171067
&α;-シアノ-4-ヒドロキシシンナミ酸	Autobio Diagnostics	20140009