方法論記事

Dioscorea bulbifera Lにおける潜在的に肝毒性を持つフラン含有化合物のスクリーニングのための統合UHPLC-MS/MSおよびHRMS戦略。

DOI：

10.3791/70865

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2026年5月19日

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1The First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Medicine and Health Management, Guizhou Medical University, 4Guizhou Provincial Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM, Guizhou Medical University

この記事について

サマリー

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本研究では、 Dioscorea bulbifera Lにおける潜在的に肝毒性のあるフラン含有化合物をスクリーニングするために、UHPLC–MS/MSとHRMSを統合した戦略を開発しました。

要約

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Dioscorea bulbifera L.(DBL)は、甲状腺疾患や腫瘍の治療に用いられる伝統的な漢方薬ですが、肝毒性の可能性から安全性が懸念されています。過去の研究では、この肝障害がDBLに含まれるフラン含有化合物(FCC)の代謝活性化と関連している可能性が示唆されています。本研究では、超高性能液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析(UHPLC-MS/MS)および超高性能液体クロマトグラフィーとタンデム高分解能質量分析法(UHPLC-HRMS)を組み合わせた統合解析手法を用いて、DBL抽出物中のFCCおよびその反応性代謝物を体系的に特徴付けました。標的および非標的質量分析の両方を用いて、DBLの水抽出物中に合計849成分を同定し、その中には10種類のフラノジテルペノイドと17種類の追加FCCが含まれていました。代謝活性化経路を明らかにするために、マウス肝微粒体(MLM)培養系内でグルタチオン(GSH)と4-ブロモベンジルアミン(BBA)を二重捕獲剤として用いました。P450媒介の代謝を通じて、ジオスブルビンB(DSB)、C(DSC)、D(DSD)、E(DSE)、L(DSL)、N(DSN)、および2-ペンチルフランから得られる7つの対応する付加物が成功裏に捕捉・特徴づけられました。本研究は、DBLにおける潜在的に肝毒性のあるフラン化合物の包括的なプロファイリングのための敏感かつ特異的なアプローチを確立し、フラン含有漢方薬に関連する反応性代謝物の形成や毒性機構に関する貴重な洞察を提供します。

概要

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伝統中国医学(TCM)、特に薬物誘発性肝障害(DILI)に関連する安全性の懸念が、その広範な臨床的利用と近代化を妨げています1,2,3。増え続ける証拠は、TCMのほとんどの成分が本質的に有毒ではないことを示唆しています。むしろ、肝毒性は1,4,5の代謝活性化による生体内での活性化によるものです。フラン含有化合物(FCCs)は肝毒性の前駆体としてよく知られており、P450媒介による代謝活性化を経て、特に肝毒性の開始に重要な高反応性求電子中間体、特にシスエネジアルを産生します。これらの求電性代謝物は、必須タンパク質のシステインチオールおよびアミノ基と共有結合付加物を形成し、毒性効果の進行を促進します。

中医学では、Dioscorea bulbifera L.(DBL)が甲状腺疾患、腫瘍、皮膚疾患の治療に広く用いられています 9,10。DBLから合計152の化学成分が分離・特徴付けられており、その中には41種類のフラノジテルペノイド11が含まれます。その中でも、主要な生物活性成分であるディオスブルビンB(DSB)は、マウスモデルにおいて肝損傷を誘発することが示されており、この効果はDSB由来のシス腺(DDE)12,13の形成と密接に関連しています。分析機器の進歩により、質量分析はTCM14,15の複雑な化学成分や代謝物を分析する重要なツールとなっています。従来、DSB代謝によって産生されるシスエネジアルは、N-アセチル-L-リシンをグルタチオンまたはN-アセチル-L-システインと組み合わせて求電子種を捕捉し、その後、化学的に安定なピロール誘導体をLC-MS/MS解析することで検出されます16,17。この手法を基に、我々は以前にGSHおよびBBAを含むフラン由来代謝中間体の同時トラップを用い、GSH付近の中性損失スキャン129 Daおよび前驅体イオンスキャンm/z272を用いたLC-MS/MS解析、さらにBBA部分由来のm/z 169および171の前駆体イオンスキャンを用いたピロール検出の改良戦略を開発しました(図1)18。19歳。既知のフラノイドには効果的ですが、この方法は複雑な混合物、特に構造情報が事前に欠如しているFCCに対して顕著な限界を示します。したがって、複雑なTCM行列の徹底的な化学的特徴付けを可能にしつつ、肝毒性前駆体の効率的なスクリーニングを支援できる包括的な分析戦略の緊急性が依然として求められています。

ここでは、DBLにおける潜在的に肝毒性のあるFCCsの体系的な特性評価のための統合戦略を報告します(図2)。この戦略は3つの主要なステップから成り立っています:(i) UHPLC–MS/MSに基づく広範なターゲットメタボロミクス(WTM)を用いたDBL水抽出物の包括的な化学的プロファイリング;(ii) GFHおよびBBAを含むFCCから生成される反応中間体の捕捉;および(iii)HPLC–MS/MSおよびUHPLC–MS/MSを用いて潜在的に有毒な成分の代謝活性化によって形成されるGSH/BBA付加物の検出および構造解析。この統合的アプローチにより、複雑なTCMマトリックスからDBL誘発肝毒性の主要な前駆体を明確に特定でき、TCMの安全性評価において非常に高感度かつ特異的な枠組みを提供します。

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プロトコル

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注:本研究で使用される試薬および機器は 材料表に記載されています。

1. DBLテスト解の準備

  1. Dioscorea bulbifera Lの塊茎を3バッチ採取し、認証してください。国家中毒性加工仕様に従い、塊茎から繊維状の根を取り出し、洗って汚れを取り除き、新鮮な状態で厚さ1cmの円状にスライスし、60°Cの強制空気オーブンで乾燥させ、取り出して室温20度まで冷やします。
  2. 各バッチから200gのDBLを重さを取り、高速クラッシャーで粗粉(粒径250〜850μm)に粉砕します。
  3. 粗粉末20gを200 mLの脱イオン水(1:10、水/電圧)に30分間浸します。同時に、ステップ1.2で調製した3バッチの粗粉混合物(1:1:1、w/wの比率で混合)を処理します。
  4. 浸した物質は逆流加熱で60分間取り出します。不溶性の残留物を取り除くために、ガーゼやふるいでエキスをろ過します。残留物に200mLの脱イオン水を加え、逆流抽出を2回、それぞれ60分ずつ繰り返します。3種類のろ過液をすべて混合し、沸騰して抽出物を濃縮し、最終体積100mLにします。
  5. 濃縮抽出物を真空凍結乾燥機に移し、凍乾して粉末を得ます。
  6. エキスパウダーの各バッチを正確に18mg計量してください。それぞれを50%アセトニトリル1.5mLに溶かし、均一性を確保するために30秒間渦巻きます。
  7. 溶液を13,800 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清液をMLMの培養液として採取します。
  8. ピペットで20μLのストック溶液を取り、50%アセトニトリルで1:50に希釈し、30秒ほどボルテックスします。その後、溶液を0.22μmの微分孔膜に通して質量分析に適した試料溶液を得ます。

2. DBLの化学的特性評価

  1. クロマトグラフィー条件
    1. C18カラム(2.1 mm x 100 mm、1.8 μm)を使用し、カラムオーブンの温度を40°Cに設定します。 移動相Aは水中で0.1%(v/v)の蟻酸として、移動相Bはアセトニトリルとして準備します。
    2. 勾配のプログラムは以下の通りです:0–10分、2%–50% B;10〜11分、50%〜95%B;11〜13分、95%B。流量を0.4 mL/minに設定し、サンプルを2 μL注入します。
  2. 以下のパラメータを用いて質量分析を実施します:イオン源:IonDrive Turbo Vエレクトロスプレーイオン化(ESI);取得モード:正イオンモードと負イオンモードの同時取得を伴う多重反応モニタリング(MRM);イオンスプレー電圧:+5.5 kV(正)/ −4.5 kV(負);カーテンガス:35 psi;水源温度:400°C;イオン源ガス1:60 psi;イオン源ガス2:60 psi;デクラスターポテンシャル(DP):±100V。
  3. データ処理
    1. SCIEX Analyst Software(v1.6.3)を使用してMRMデータを取得・処理します。生データファイル(.wiff)をMSConvertを使ってTXT形式に変換します。検出された化合物には独自のBiotreeDB(V2.1)MSライブラリをクエリして注釈を付けます。注釈は、保持時間(RT)、質量対電荷比(m/z)、断片化パターンを本物の標準と照合することに基づいています。

3. MLMインキュベーションで生成されるGSH/BBA共役体の特性評価

  1. MLMのインキュベーション
    1. マウスの肝臓微小体懸濁液を氷の上でゆっくり溶かします。氷上では、2 mLのマイクロ遠心分離機チューブで以下の成分を順次加えて培養混合物を準備します。最後にNADPH再生システムを加えます。対照群では、NADPH再生システムを同量の氷のように冷たいPBSに置き換えます。一瞬の渦を混ぜてみる。
      1. 以下の成分からなる培養混合物を準備します:マウス肝微粒体懸濁液(MLM、4 mg/mLタンパク質):125 μL;塩化マグネシウム(MgCl₂)溶液(32 mM):10 μL;DBE(12 mg/mL)またはDSB標準溶液(35 mM):10 μL;グルタチオン(GSH)溶液(50 mM):100 μL;BBA溶液(250 mM):10 μL;PBSバッファー(pH 7.4、1.0 mol/L EDTAおよび0.1 mol/L K2HPO4を含む)は145 μL;NADPH再生系溶液(5.0 mM):100 μL。
    2. 孵化が終わったらすぐに、すべての管をインキュベーターから取り出してください。酵素反応を終了させるには、各チューブに氷冷アセトニトリル(-20°C)を1mL加えます。
    3. タンパク質を沈殿させるために3分間渦巻きます。遠心分離機は13,800 x g で4°Cで10分間加熱します。
    4. 上清液を採取し、0.22μmの膜を通してろ過し、その液をオートサンプラーバイアルに移します。
  2. HPLC-MS/MSによるDBL抽出物のMLM培養の予備スクリーニング
    1. クロマトグラフィー条件
      1. C18カラム(150 mm x 4.6 mm、3 μm)を使用し、カラム温度を25°Cに設定します。 移動相Aは水中で0.1%(v/v)の蟻酸として、移動相Bはアセトニトリルとして準備します。
      2. 勾配は以下の通りです:0–2分、10%B;2〜15分、10%から90%Bへの直線的な増加。流量を0.8 mL/minに設定し、準備済みのサンプル5 μLを注入します。
    2. 質量分析条件。フルスキャン範囲をm/z500〜1000に設定してください。前駆体イオン(PI)はm/z169および171でスキャンし、正イオンモードでは中性損失(NL)スキャンが129 Da、マイナスイオンモードではm/z 272でPIスキャンを行います。主要パラメータを以下のように設定します:イオン噴霧電圧(IS)、+5,500 V(正)、−4,500 V(負);デクラスタリングポテンシャル(DP)、±70 V;入口電位(EP)、±10 V;衝突エネルギー(CE)、+35 V(正)/−40 V(負);衝突セル出口電位(CXP)、±10 V;イオン源ガス1および2(GS1/GS2)、それぞれ50 psi;カーテンガス(CUR)、40 psi;そして源温度(TEM)は650°Cです。
    3. SCIEXアナリストソフトウェア(v1.6.3)を使用して、すべての質量分析データを取得・処理します。
  3. UHPLC-HRMSによるピロール誘導体およびFCCの同定
    1. クロマトグラフィー条件
      1. C18カラム(2.1 mm x 100 mm、1.9 μm)を使い、カラムオーブンを30°Cにセットします。 移動相Aは水中で0.1%(v/v)の蟻酸として、移動相Bはアセトニトリルとして準備します。
      2. 勾配のプログラムは以下の通りです:0-20分、5%-95% B;20〜21分、95%B。流量を0.3 mL/minに設定し、サンプルを2 μL注入します。
    2. 以下のパラメータで質量分析を行います: イオン源:ESI;イオン噴霧電圧:+3.5 KV(正イオン)/-2.5 KV(負イオン);毛細血管温度:320°C;プローブヒーター温度:350°C;シースガス:10 Arb;最大噴霧電流:100μA;SレンズRFレベル:50%;衝突エネルギー:35 V(正イオン)、40 V(負イオン);スキャン範囲:100-1000 m/z。
    3. データ前処理
      1. DBLで同定されたFCCとトラップ機構(図1)に基づき、ChemBioDraw Ultra 14.0(補足図1)を用いて予測されるGSH/BBA共役を抽出します。
      2. 取得したHRMSの生ファイル(.raw)をXcalibur(V4.1)のQual Browserモジュールにインポートします。ソフトウェア内でGSH/BBA共役をスクリーニングするための識別ワークフローを作成します。
      3. 実験的なMS1およびMS2スペクトルを、既知の還元機構に基づきFCC由来のGSH/BBA共役(ChemBioDraw Ultra 14.0を用いて予測)の構造を比較してください(図1および補足図1)。すべての監視イオンに対して、最小ピーク強度閾値を1 x 10 5、質量精度許容± 10 ppmを用いてください。MS1およびMS2スペクトルで観察される特徴的な臭素同位体パターン(約1:1)に基づいて共役体を確認し、m/z 169および171の診断イオンも含む。
      4. 観測された分子イオンからGSH/BBAタグの質量を差し引いて、親FCCの分子量を決定します。減算には472/474 Da(C17H21O5N4BrS)を使ってください。
      5. 上記の結果に基づき、UHPLC–HRMSによってDBLの親FCCを特徴付けます。

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結果

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DBLで特定されたFCCs
DBLの化学プロファイルを特徴付けるために、三重四重磁極を用いたWTMとHRMSプロファイリングの組み合わせが用いられました。この二重アプローチにより、抽出されたイオンペアの包括的な解析が可能となり、非常に有益な抽出イオンクロマトグラム(EIC、図3A)および全イオンクロマトグラム(TIC、図3B)を生成しました。最適化されたクロマトグラフィーおよび検出条件下で、合計849種の化合物が20の化学クラスにまたがって同定されました(図3C)。特筆すべきは、DBL抽出物から27種類のフラノイドが検出され、その中には10種類のフラノイドジテルペノイドが含まれていました:ディオスブルビンB(DSB)、C(DSC)、D(DSD)、E(DSE)、G(DSG)、J(DSJ)、L(DSL)、N(DSN)、8-エピディオスブルビンE酢酸エステート...

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ディスカッション

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DBLの肝毒性に関するこれまでの研究は主に、標的捕捉戦略を用いた個々のFCCの代謝中間体に焦点を当ててきました 9,22。これらのアプローチは貴重な機構的洞察を提供しますが、複雑なハーブ行列での効果は、低存在量の生物活性化中間体による検出性の低さによってしばしば制限されています。本研究では、DBLにおける肝毒性FCCsの系統的同定のための高度な分析ワークフローを開発しました。この戦略の主な利点は、WTM、反応中間トラップ、HRMSの統合により、複雑な抽出物中の生体活性化フランの感度検出が可能になることです。具体的には、MRMモードで運用されたUHPLC–MS/MSプラットフォームを用いて、DBL抽出物で合計843化合物が特徴付けられ、そのうち21種類のFCCが同定され、その中には4つのフランジテルペノイドが含まれていました(表1)。補完的なUHPLC–HRMS解析により、さらに6つの追加のフランジテルペノイドの同定(

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開示事項

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著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

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この研究は、中国国家自然科学基金(第82360759号)、貴州省自然科学基金(第4号)の支援を受けました。ZK [2024]406、ZK [2024] 397、ポスドクステーション[2021]007、BSH[2024]005)、および貴州中医大学TD Hopes [2023]005。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4-ブロモベンジアミン九定化工(上海)テクノロジー有限公司X114214A
アセトニトリルシグマ・オルドリッチ(上海)貿易株式会社1000294000
遠心分離機無錫白徳生物技術有限公司CR3180
クロマトグラフィー サンプル ボトル浙江ALWSCIテクノロジー有限公司C0000008
ディオスブルビンB成都普飛徳バイオテック有限公司18022603
Dioscorea bulbifera L.-DBL-1;DBL-2;DBL-3植物材料は貴州中医薬大学の江偉克教授によって認証され、バウチャー標本は貴州省基礎薬理学重点研究所に寄贈されました。
電子天秤上海安亭電子計器工場FA1004B
蟻酸サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック 社195715
グルタチオンシグマ・オルドリッチ(上海)貿易株式会社SLBX5462
高速 クラッシャー永康彪金物製品有限公司XC-2000Y
昆明マウス肝微小体(オス)大連美倫バイオテクノロジー有限公司MB12496-1
塩化マグネシウム北京ソーラービオ科学・科学テクノロジー株式会社M8161
メタノールシグマ・オルドリッチ(上海)貿易株式会社646377
ミリポアフィルター天津金騰実験設備有限公司ナイロン66
NADPH Na4北京ソーラービオ科学・科学テクノロジー株式会社102X022
オーブン天津実験機器&イクイップメント株式会社GFL125
リン酸塩緩衝生理食塩水ビヨタイム・バイオテクノロジー 株式会社C0221B
サーモスタティック 水 Bath 発振器上海紫家計器有限公司THZ-82A
超冷凍庫サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック 社TDE60086FV-ULTS
超音波クリーナー上海紫家計器有限公司L10-250A
ボルテックスミキサー江蘇海門医療機器工場VM-D

参考文献

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