生活習慣加速による老化病態生理の調査のための概日リズム乱と食事ストレスの結合マウスモデル

サマリー

ここでは、乱れた概日リズムと高脂肪・高糖(HFHS)食事を組み合わせたマウスモデルを確立するプロトコルを提示します。これは不健康な生活習慣を模倣し、代謝障害や加齢表現型を誘発します。

要約

このプロトコルの目的は、現代の不健康な生活習慣によって引き起こされる多因子的損傷を再現する標準化されたマウスモデルを確立することです。この目的のために、ランダム化概日リズムの乱れと高脂肪・高糖(HFHS)食事を組み合わせた新しいC57BL/6Jモデルを開発し、単一因子HFHS群と概日リズム乱群を対照群とした。対照群と比較して、複合モデルでは体重増加、空腹時血糖および脂質の上昇、著しい肝脂肪症、さらに明らかな認知および運動障害など、より重度の代謝障害が認められました。複合モデルでは、フレイルティ指数やヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色によって、より有意な加速老化が示されました。この統合モデルは、ライフスタイルに関連する代謝認知機能の低下や早期老化を確実に模倣しています。この段階的に再現可能なプロトコルは、生活習慣による老化に関するメカニズム的研究や標的治療戦略の評価を支援します。

概要

加速した現代の生活様式は、リズムを乱す行動や肥満性食生活にますます多くの集団をさらし、これらの要因が全身機能の低下や慢性疾患の病因と関連しているという説得力のある証拠^{があります。}疫学的データは顕著な併存症を示しています。シフトワーカーは代謝症候群マーカーの有病率が高い一方、高脂肪・高糖質の長期摂取は認知症のリスク増加と強く関連^{しています。}これらの侮辱は多臓器病理を引き起こし、代謝機能障害は認知機能の加速や心血管再構築としばしば同時進行し、末梢と中枢の悪化が双方向で交差していることを示します。臨床的な相乗効果が認められているにもかかわらず、生活習慣による臓器衰退の統合的な病態生理を捉えた標準化された前臨床モデルは依然として十分に発展していません。

分子レベルでは、慢性的な概日リズムのずれが視交叉上核に起源を持つ病理的なカスケードを引き起こし、視床傍室へのグルタミン作動性シグナル伝達を妨げ、コルチコトロピン放出ホルモンのパルサリティを鈍らせます。これにより視床下部-下垂体-副腎(HPA)軸の負のフィードバック⁴が損なわれ、グルココルチコイド受容体の脱感作と持続的なコルチゾール上昇を引き起こします。その結果、肝臓の糖腫瘍形成の活性化と骨格筋インスリン受容体基質1によるリン酸化抑制が結合して末梢インスリン抵抗性を促進し、高血糖および脂質異常の代謝基盤を築きます^5,6。同時に、食事中の飽和脂肪酸は、内皮タイトジャンクションタンパク質^7,8のダウンレギュレーションを通じて、損傷した血液脳関門に浸透し、ミクログリアTLR4/NF-κBシグナルを活性化します。これによりTNF-α/IL-1β介在性神経炎症が引き^{起こされます}。重要なのは、これら二つの不健康な生活習慣要因が独立して作用するのではなく、相乗効果を持つということです。しかし、現在の文献では、両者の複合曝露に関する体系的な研究が依然として著しく不足しています。したがって、概日リズムの乱れと高脂肪・高糖分の食事を複合要因として統合したモデリング研究を行うことは重要です。

孤立した老化メカニズムの研究に有用であるにもかかわらず、現在のマウスモデルは生活習慣による悪化の統合的な病態生理を再現できていません。自然老化は個体間で顕著な変動を示し、実験効率と両立しない長期的な時間軸を必要とします。ドキソルビシンのような薬理学的薬剤は、慢性代謝異常を再現せずに主にDNA損傷や急性老化を誘発します。¹⁰。遺伝子組み換えモデルは単一分子経路を標的とし、全身神経内分泌-代謝のクロストークは見落としています^11,12。D-ガラクトースの投与は酸化ストレスを引き起こすものの、概日リズムの乱れがグルココルチコイドリズムや食事中の脂質介在性神経炎症に与える影響を十分に模倣できません¹³。重要なのは、単一因子介入では臨床的に観察される多臓器の相乗減少パターンを捉えられないことです。この翻訳ギャップは、慢性的な概日リズムの乱れと肥満性の食事ストレスを同時に組み込む高度な組み合わせプラットフォームを必要とし、相互依存的な神経変性、心機能障害、代謝障害を忠実に加速させる必要があります。

この問題に対処するため、私たちは確率的な概日リズムの乱れと高脂肪・高糖分の食事を統合し、相乗効果のある現代のライフスタイルの悪化を再現するC57BL/6Jマウスモデルを開発しました。マウスに回転光スケジュールを強い、持続的な肥満性摂食を組み合わせることで、脂肪増加、空腹時高血糖、脂質異常などの代謝異常が著しく悪化しました。認知評価では空間記憶と認識記憶に顕著な欠損が認められ、運動検査では持久力の低下が示されました。特に、虚弱指数の縦断的量化は、加齢に伴う欠損の蓄積が加速していることを示しました。この二重課題パラダイムは、多面的な加速老化を力強く再現し、ライフスタイル駆動の病態生理を研究するための検証済みの新しいプラットフォームを提供します。

プロトコル

すべての実験手順は河北宜陵製薬研究所動物研究倫理委員会(承認番号:N2024043)によって承認されました。8か月齢のC57BL/6Jオスマウス32頭( 資料表参照)が、河北夷陵製薬研究所新薬評価センターに所属する特定の病原体フリー(SPF)動物施設に収容されました。飼育環境は標準化された条件下で維持され、周囲の気温は20〜26°Cの範囲、相対湿度は40%〜70%に制御され、12時間の明暗・12時間の暗いサイクルが実施されました。マウスは標準的な実験室用齧歯類の食事と滅菌された飲料水を自由に提供していました。

1. 概日リズムの乱れと食事ストレスの結合マウスモデルの確立(図1)

注:実験中に予期せず死亡した動物、重度の体重減少を示した動物、またはモデリング手順を完了しなかった動物は最終解析から除外されました。最初の動物数は1グループあたり8頭で、最終的な有効なサンプル数は1グループあたり5頭でした。

1. 実験前に高脂肪・高糖(HFHS)食事(材料 表参照)と、柔軟な明暗サイクル制御のためのプログラム可能なタイマーを備えた独立した部屋を準備してください。
   注意:酸化を防ぐために4°Cまたは-20°Cで保存してください。結露が成分に影響を与えるのを避けるため、使用前に室温にしてください。
2. 動物の適応とランダムなグループ分け
   1. 実験開始前に、8ヶ月のマウス全員を標準的な条件下で7日間の適応給餌期間内に収容してください。
   2. 適応期間後、体重に基づいてマウスをランダムに4つのグループに割り当てます(グループあたりn=8匹)、コントロール群、複合ストレスモデル(モデル)群、HFHS群、概日リズム乱(CR)ストレス群。
3. 複合ストレスモデル群に対して、8か月間の介入と概日リズムの乱れを組み合わせて実施します。HFHS群には同じ期間HFHS単独の食事を与えます。
4. CRグループは概日リズムの乱れだけを経験させてください。実験全体を通じて、対照群には標準的な維持食を与えてください。すべての動物に飲料水の無料アクセスを提供しましょう。
   注:8か月間の介入は一時的に一時停止しても(例:マウスの定期的な健康チェックのため)、実験結果に影響を与えず、検査終了後に介入を再開できます。
5. 概日リズムの乱れプロトコル(図2A,B)
   1. プログラム可能なタイマー( 材料表参照)を使って、週ごとの明暗サイクルを柔軟にコントロールしましょう。4つの異なる光の領域を適用します:急速な明暗切り替え(1日2時間連続で7分ごとに明暗が交互に切り替える)、逆光暗サイクル(毎日8時に消灯、20時に点灯)、常に光(24時間照明)、そして常時暗闇(24時間暗闇)。
   2. 毎週の初めに統計ソフトウェア(R言語、固定ランダムシード)を使ってランダムシーケンスを作成します。4つの光モードを週の各日にランダムに割り当て、それぞれのモードが1〜2日間連続して適用されるようにします。
6. マウスには自由にHFHSの食事を与え、毎週食事量を監視してください。HFHSの食事の詳細な構成は表1に示されています。
   注意:食料供給の点検は、給餌不足や食糧不足を防ぐために必要です。
7. 8か月間の介入期間中は、固定時間(木曜日の午前9時)に電子天秤を使ってマウスを週に一度体重測定します。すべての体重データを詳細に記録してください。
   注意:ストレスや概日リズムの乱れを最小限に抑えるため、体重測定は迅速に行い(各セッションは30秒以内に完了してください)。

2. 新しい物体認識

1. トレーニングの前日に60cm×60cm×40cmのテストボックスに入れ、5分間自由に探索させて環境に慣れさせてください。
   注意:各試行終了後は糞便と尿を箱から取り除いてください。残留臭いを取り除くために、75%のエタノールで箱を拭きましょう。
2. テストボックスの左下隅と右下隅に、それぞれ同じシリンダー(AとB)を置きます。各マウスをオブジェクトから反対側を向いてボックスに入れ、5分間自由に探索させてください。
   1. 2つの円筒の左右位置を被験者間でランダムに交互に配置し、位置バイアスを防ぎます。
   2. 5分間の探索訓練後、最大23時間まで実験を一時停止し、訓練後24時間以内に新しい物体の置換ステップ(ステップ2.3)を完了して認識テストの妥当性を確保してください。
3. トレーニングの24時間後に左下のオブジェクトAを新しいキューブ(オブジェクトC)に置き換えます。オーバーヘッドカメラを起動しろ。マウスを箱に入れて5分間行動を記録します。
   注意:馴染みのある物と似た大きさで、素材、色、質感が明確に異なる新しいオブジェクトを使い、マウスがその新奇さを認識できるようにしてください。
4. ビデオトラッキングシステム(材料 表参照)を使って動画を分析してください。
   1. 探索とは、ネズミが鼻先を物体から2cm以内に向かって向けることを指します。馴染みのある物体(TB)と新しい物体(TC)を探索した時間を記録してください。
   2. 認識指数を次の式に従って計算します:認識指数 = TC / (TB + TC) × 100%。
      注意:主観的なバイアスを避けるために、分析者は実験群を盲目に見せてください。探査記録からは、登攀やかじりなどの非探索的行動を体系的に除外します。

3. 握力テスト

1. 握力^{メーター14} ( 材料表参照)を使ってマウスの前肢の握力を測定します。各テストセッションの前にフォースゲージを垂直に90度回転させ、金属製のスタンドにしっかりと固定してシステムの完全な固定を確保します。
2. 尾の根元を優しく握りながら握ります。前足が自然にバーをしっかり掴むようにしましょう。計測値を安定させたらゼロにし、尾を一定のゆっくりな速度で水平に引っ張り、マウスがグリップを離すまで続けます。
3. 離れた瞬間の最大ピーク力(kgf)を握力として記録します。マウス1匹あたり1日3回連続試験を行います。後回の分析には3つの測定値の平均を用いてください。
   注意:引く速度は均一に保ち、マウスが引っ張りに対して十分な抵抗を生み出せるように十分に遅く保つこと。
4. 以下のいずれかの条件が起こる場合は、試験を分析から除外してください:ネズミが前足を片方だけ使う、後肢がバーに接触している、またはグリップに寄与している、引っ張る際に体をねじる、またはバーが抵抗なく放たれる場合。
   注意:曖昧または異常な試行はレビューのためにフラグを立ててください。必要に応じて測定を繰り返してください。

4. 虚弱指数(FI)

注意:テスト前にすべての機器パラメータを標準化された設定に校正してください。疲労による表現型変化を避けるため、各マウスの総評価時間を30分未満に制限してください。すべての検査は、概日リズムの影響を最小限に抑えるため、午前9時から12時までの固定された午前中に実施してください。

1. マウスは12時間、水を自由に利用して断食し、生理的測定への急性影響を最小限に抑えようとします。
2. 評価の30分前にマウスをテスト環境に移動し、慣れさせてストレスによる干渉を減らしましょう。
3. 腫瘍、感染症、四肢変形などの重篤な病態を持つマウスは除外し、虚弱評価における交絡影響を防ぎます。
4. フレイルティ指数を、運動機能、栄養状態、感覚機能、自発活動と行動、生理的欠陥の5つの領域にわたる31の表現型欠損指標に基づいて評価します。^15,16。
   注:具体的な31項目の評価項目は5つの領域をカバーしており、以下の通りです:運動機能(握力の低下、異常な歩行、登攀能力の低下など7項目)、栄養状態(体重減少、体調スコアの低下、食事摂取の減少など6項目)、感覚機能(視覚障害、聴覚障害、触覚鈍感など5項目)、自発活動および行動(7項目:自発活動の減少など)。 グルーミング行動の減少と探索行動の減少)、および生理的欠陥(眼の欠陥、耳の欠陥、皮膚欠陥など6つの項目)。すべての品目は二値評価法を採用し(0=欠陥なし、1=欠陥あり)、最終的な脆弱指数=欠陥品の総数÷31。
5. 盲検された2人の研究者を実験グループに割り当て、すべての評価を独立して実施させます。
6. 各指標を、握力、歩行速度、体重変化、被毛の状態、感覚反応、自発活動能力、身体異常など、あらかじめ定められた基準に基づき、0(欠損なし)または1(欠損)と評価してください。

5. 空腹時血糖測定

注意:マウスは12時間断食し、水を自由に利用して急性の摂食による血糖値への影響を最小限に抑えてください。概日リズムの変動を減らすために、午前9時から正午まで測定を行います。実験前に標準的なグルコース溶液でバッチ間の整合性を調整してください。

1. ネズミを優しく拘束し、尾の先端を75%エタノールで消毒します。無菌の使い捨てランセットを使って尾の静脈に1〜2mmの切開を入れます。組織液の汚染を避けるために、最初の一滴の血液を捨ててください。
2. 少量の毛細血管血を採取し、対応テストストリップ付きの携帯型グルコメーター( 材料表参照)で直ちに分析します。各サンプルを二重にテストしてデータの正確性を確保しましょう。

6. 血中脂質検出には総コレステロール(TC)が含まれていました

注意:重度の溶血または濁度のあるサンプルは分析から除外してください。三重の変動係数が10%>重複測定。

1. 非抗凝固チューブに血液を採取した場所。室温で2時間自然に凝固させてください。1000 × g で4°Cで15分間遠心分離液を取って血清を分離します。
   注意:操作前に遠心分離機のバランスが適切に整い、安全内蓋をしっかり閉じてください。
2. 上部血清を慎重に吸引し、アリクオート(分液)してすぐに-80°Cで保存し、脂質酸化を防ぎます。
   注:血清の分離と-80°Cでの保存後、実験は数日から数週間中断可能です。その後の総コレステロール検出(ステップ6.3)は、検査キットと機器が準備できたときに実施でき、血清が繰り返し凍結・解凍されることはありません。
3. 製造元の指示に従い、市販のGreissのTCテストキット(材料表参照)を使用して血清総コレステロール値を測定してください。各試料を三重に検査し、標準参照試料を同時に走査して校正します。

7. ヘマトキシリン・エオシン染色(HE染色)

1. 行動検査後にマウスにナトリウムペントバルビタール(20 mg/kg)を麻酔します。
2. 後眼窩静脈叢から血液を採取してください。組織を解剖し、4%のパラホルムアルデヒドで48時間固定します。
   注:4%パラホルムアルデヒドで組織固定を48時間後、実験は一時停止できます。固定組織は4%のパラホルマルデヒドに4°Cで最大1週間保存でき、その後脱水段階(ステップ7.3)に進みます。
3. 脱水は、段階化されたエタノール系列(1時間ごとに60%、70%、90%エタノール、2時間あたり95%、100%エタノール)を用いた自動処理機による固定組織です。
   注意:エタノールは可燃性で発火点が低い液体です。保管や運用中は、外炎や熱源、火花から距離を置きましょう。換気の良い場所で使用し、静止防止手袋と白衣を着用してください。実験エリアでの大量貯蔵は避けてください。専用の可燃性液体キャビネットに保管してください。
4. キシレンで脱水組織を2時間クリアし、その後60°Cでパラフィンを浸潤して3時間浸潤します( 材料表参照)。標準的な解剖学的平面に組織を埋め込む。
   注意:組織の脆さを防ぐためにクリアリング時間は過度に長く設定してはいけません。結晶化を防ぐため、浸透時には一定のパラフィン温度を保つこと。パラフィン埋め込み後、埋め込まれた組織ブロックは室温で数ヶ月間保存でき、必要に応じて切片工程(ステップ7.5)を行うことができます。
5. パラフィンブロックが完全に固まったら、パラフィンスライサーで4μmの連続断片を切断し(材料表参照)、ポリLリジンコーティングされたスライドに移し、室温で自然乾燥させてから密封して保管します。
   注意:セクションマウントと自然乾燥後、スライドは室温で最大1か月間、埃のない環境で保管し、その後ステイン工程(ステップ7.6)に進みます。
6. 自動染色システムを備えたステインセクション( 材料表参照)。
   1. キシレンIおよびキシレンIIで脱硫(各10分)を行います。
   2. 降下エタノール系列(100%、95%、80%、各2分)で再水和し、蒸留水ですすぎます。
   3. ヘマトキシリンで3〜8分間染色し、核がはっきり見えるまで塗り、流水で洗浄して青化を促進し、エオシンで1〜3分間カウンターステインして適切な細胞質ピンク色を得ます。
7. 脱水染色した断片は絶対アルコールで、透明なキシレンで、中性バルサムでマウントしてスライドスキャナー解析を行います(材料 表参照)。

8. オイルレッドO染色

1. 採取後30分以内に新鮮な肝臓組織を最適切断温度(OTC)化合物(材料 表参照)に埋め込むこと。
   注:新しい肝組織をOTC化合物に埋め込んだ後、埋め込み組織は切片(ステップ8.3)前に最大1か月間-80°Cで保存でき、冷凍解凍の繰り返しを避けられます。
2. 埋め込まれた組織をクライオスタットに入れ、完全に冷凍してから切開します。
3. クライオスタットの温度を-22°Cに設定し、完全に凍結した組織ブロックを連続した厚さ8μmの断片に切ります。
4. セクションを直接コーティングされていないガラススライドに移し、優しく平らにしてセクションとスライド間の密着を確保します。
5. スライドを中性ホルマリンで室温で10分間固定します。固定直後、切片を60%イソプロパノールで5秒洗い流します。
6. 事前に処理された断片を湿度チャンバーに入れ、オイルレッドO染色液( 材料表参照)を加え、20分間培養します。
7. 染色後、60%イソプロパノールで切片を分離し、脂質滴と間質組織の境界が明確に区別されるまで続けます。
   注意:分化中は過剰な分化を防ぐために切片を注意深く観察してください。過度の分化による薄色の原因となります。
8. 分化した染色切片を光学顕微鏡で調べ、肝脂質沈着に関連する組織病理学的変化を観察します。
   注意:染色と分化後は、切片を4°Cで最大3日間保存して顕微鏡検査を行うため、染色効果が影響を受けないようにしてください。

9. 統計分析

1. すべての実験データを平均±±標準誤差(SEM)として表現します
2. シャピロ・ウィルク検定を適用して、データが正規分布に適合しているか確認します。正規性が確認された場合、グループ間の分散の均質性を評価するためにレヴェーン検定を実施します。
   注意:データが正規性仮定を満たさない場合は、直接ノンパラメトリック検定を適用してください。
3. 分散の一方向分析(ANOVA)を用いて複数グループ間の全体的な差の統計的有意性を検証し、フィッシャーの最低有意差(LSD)検定を用いてペアワイズ比較を行います。
   注意:分散が異質な場合はウェルチANOVAを用いてください。
4. 2つの独立したサンプル群間の比較には、両側の学生t検定を用いてください。
5. 統計的有意性を両側p値<0.05と定義します。すべての統計解析は統計解析ソフトウェアを使用して実施してください。

結果

二重曝露コホートにおける代謝病理の相乗的悪化
縦断的な体重モニタリングでは、コホート間で明確な成長軌跡が明らかになりました。モデル群とHFHS群は対照群およびCR群と比べて体重増加が加速しました。特筆すべきは、CRグループが対照群に対して控えめな加速を示したことである(図3A)。代謝機能障害のさらなる証拠として、空腹時血糖値および血脂濃度が対照群およびCR群に比べてモデル群およびHFHS群で有意に高いことが観察されました。空腹時血糖値はモデル群±9.26 0.67 mmol/L、HFHS±8.46 0.62 mmol/L、対照群±5.60 ± 0.71 mmol/L(CR)(モデル対対照群のP < 0.05、 HFHS対コントロールのP < 0.05);総コレステロール値は、モデル±5.12 0.29 mmol/L、HFHSで10.10± 1.08 mmol/L、コントロール±11.14 1.80 mmol/L、CRが5.00± 0.45 mmol/Lでした(モデル対...

ディスカッション

現代の研究は、概日リズムの乱れと高脂肪・高糖質の食事が、生物の全身機能低下の独立した二つの要因であることを明確に確認しています。私たちのデータは、これら二つの要因が結合して引き起こす病理的損傷が、単独のどちらかの単なる加算効果よりもはるかに深刻であることを示しています。単一因子介入群と比較して、複合モデル群はHFHS群と比較して脂肪増加に有意差は見られませんでしたが、CR群と比較すると著しい増加が見られました。空腹時血糖値はモデルコホートで最も高かった。血清総コレステロール(TC)濃度はモデル群とHFHS群の両方で有意に増加しました。肝臓組織のオイルレッドO染色は、モデル群で最も顕著な脂質蓄積と真空化を示しました。一方、モデルマウスは新しい物体認識テストで認知障害を示しました。注目すべきは、HFHS群およびCR群も認知機能障害への傾向を示したが、モデル群よりは軽度であり、これは神経炎症の悪化によって引き起こされるAMPA受容体の内部化と密接に関連して^{いる現象である}。さらに、31のパラメータを含む包括的脆弱性指数の解析により...

材料

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この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ANY-maze	Science	SA225
Accu-Chek Active 血糖モニター	スイス、ロシュ・ダイアグノスティクス	accu check active
C75BL/6J マウス	北京 HFK バイオサイエンス株式会社	No.110324241101250228
握力計	米国、コロンバス・インストゥルメンツ	1027CSM-E54
高脂肪・高糖質ダイエット	中国、Xietong バイオテクノロジー株式会社	XT303
HistoCore MULTICUT - 半自動ロータリー・マイクロトーム	ドイツ、ライカ	RM2245
Oil Red O 溶液	中国、武漢 Servicebio テクノロジー株式会社	G1260
最適切片温度化合物	日本、さくら	4583
プログラマブルタイマーソケット	中国、GONEO	GND-1
Tissue Tech Prisma Plus	日本、さくら	20B2X00014000034
Tissue-Tek TEC 6 埋め込みモジュール	日本、さくら	M01-021E-02
総コレステロール (TC) アッセイキット	中国、蘇州 Grace バイオテクノロジー株式会社	G0909W

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