研究記事

コーティングされたフィルターおよびプレフィルターがエアロゾル化したPhi6ウイルスの感染力および濃度に与える影響の評価

DOI：

10.3791/70877

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2026年5月29日

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1Atmospheric Composition Research, Finnish Meteorological Institute, 2Department of Environmental Sciences, Faculty of Biological and Environmental Sciences, University of Helsinki, 3Department of Microbiology, Faculty of Agriculture and Forestry, University of Helsinki, 4Department of Otorhinolaryngology and Phoniatrics-Head and Neck Surgery, Helsinki University Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、空気フィルターの銅および銀ベースの表面コーティングの抗ウイルス効果を評価する研究を紹介します。バイオエアロゾルチャンバーとPhi6バクテリオファージを用いて、この方法は自己消毒室内空気技術におけるウイルス不活化および機械的ろ過効率を定量化します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

新型コロナウイルス感染症(COVID-19)パンデミック以降、効率的な屋内空気ろ過技術の開発が注目を集めています。本研究の目的は、標準化されたバイオエアロゾルチャンバーと呼吸器ウイルスの代替として包絡状バクテリオファージPhi6を用いて、さまざまな銅および銀系表面コーティングの抗ウイルス効果を評価することです。表面試験により、すべてのコーティングが抗ウイルス活性を示し、特定の銅系コーティング配合(B4)はPhi6ウイルスを10分以内に完全不活化、A6は25分、VS-Bは60分で不活化しました。初期の感染力低下は主に飛沫乾燥によるものでした。エアロゾル実験では、高効率の微粒子空気(HEPA)フィルターおよびプレフィルターがコーティングなしでもウイルス感染性を大幅に低減し、機械的ろ過により1.0〜2.0のログ減少、高効率グレードのGF-2ガラス繊維フィルターが検出可能な感染性ウイルスを除去することが示されました。コーティングはろ過効率を有意に向上させませんでした。おそらく、コーティングされた表面へのウイルス接触が限られていたためです。GF-2フィルターの使用は、粒子の蓄積とフィルターの密度化に起因するウイルス除去の向上を示し、コーティングは通過するウイルスのコピー数を変えませんでした。VS-Bコーティングされたフィルターは脂溶性特性を示し、追加の機能的利点を示唆しています。この手法は、フィルター効率は主に機械的な捕捉と粒子の蓄積によって左右される一方で、統合された表面コーティングは捕捉されたウイルス粒子を不活化することで自己殺菌機構を提供することを示しています。紫外線(UV)光の統合は、システムの有効性をさらに向上させる将来の研究方向として提案されています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

COVID-19パンデミックの間に、空気感染ウイルスの伝播に関する理解は大きく進展しました。屋内環境は屋外よりも感染リスクが著しく高いため、より効果的な防護戦略の開発が強く求められています 1,2.この文脈において、高性能な空調および空気浄化システムは密閉空間でのウイルス感染を軽減するための不可欠な構成要素です。

空気ろ過は空気浄化システムで最も一般的に用いられる方法の一つであり、本質的な物理的ろ過特性と多層のろ過に依存しています。これには、大きな粒子を捕捉する粗いフィルターであるプレフィルターが含まれることが多いです。中効率のフィルター、例えばカーボンフィルター、および最も浸透性が0.3μmの粒子径の少なくとも99.97%を除去する高効率粒子(HEPA)フィルター(6,7)。フィルターの物理的特性には多くの抗菌効果が含まれています。以前から、多孔質の材料がウイルスを捕捉・乾燥させることで不活化できることが示されています。疎水性や親水性も対応して利用可能です。疎水性被覆を持つウイルスは吸着のために疎水性の表面を好み、親水性の表面は親水性ウイルスを引き寄せます11,12。さらに、抗ウイルス表面コーティングを用いてさらに精製を高めることができます。フィルターのコーティングは、病原体がフィルターに触れた瞬間に即座に不活化することを目的としています。これらの機能は、特に病院での運用安全性を高めるだけでなく、疫病やパンデミック時の公共環境でも効果的です。

実用的な用途では、フィルターコーティングの不活化効果が流れ込み空気で利用できるほど速くなければなりません。したがって、コーティングとウイルス粒子の直接接触の表面積は十分であり、コーティングは与えられた接触時間内にウイルスを不活化させることができるはずです。銅や銀などの重金属は抗ウイルス効果を持つことが知られています(15,16,17)。この抗ウイルス効果は、ポリオウイルス、ウキシニアウイルス、単純ヘルペス1型、Phi6、パポウイルスSV-40、アデノウイルス、小胞性口内炎ウイルス、SARS-コロナウイルス、バキュロウイルス、猫感染性腹膜炎ウイルス18、19、20、21、22などのウイルスで観察されています。そのメカニズムには銅イオンや銀イオンの放出、活性酸素種(ROS)の生成が含まれ、ROSはウイルスタンパク質と反応して核酸23,24,25,26,27,28,29,30を酸化します。

本研究のために、Sofievaら(2022)が提示した以前のチャンバーセットアップに基づき、エアロゾルおよびウイルスサンプリング特性を調整可能なエアロゾルフィルター試験チャンバーが開発されました(図1および補足図1参照)31。適応されたチャンバーは閉鎖システムとして設計されており、病原性呼吸器疾患を引き起こすウイルスのモデルウイルスをフィルターで影響し、コーティング済みおよび非コーティング型フィルターの抗ウイルス効率を評価します。包膜状バクテリオファージPhi6は、ウイルスエアロゾル研究に適したよく研究され広く使われているモデルであるため、呼吸器ウイルスの代理として選ばれました。Phi6は人間に病原性がなく、バイオセーフティレベル1(BSL-1)に分類されているため、機関の安全ガイドラインに従い、バイオセーフティレベル2(BSL-2)実験室環境内で抗ウイルスコーティングの安全かつ実用的な評価を可能にします。さらに、Phi6は重症急性呼吸器症候群コロナウイルス1型および2型(SARS-CoV-1およびSARS-CoV-2)などの呼吸器疾患を引き起こす包膜ウイルスと構造的類似性を共有しています。また、その脂質エンベロープは乾燥や化学的不活化に対する特異的な感度を付与し、抗菌表面コーティングやろ過システムの効果をエンベロープ病原体に対する評価の代表的なモデルとして提供しています。

本研究の目的は、選定された銅および銀を含むフィルターコーティング材料の抗ウイルス効果を、空気ろ過で使用する前にPhi6バクテリオファージを用いた表面試験を通じて分析することでした。その後、これらの銅および銀を基にした表面処理材料を空気前ろ過器で評価し、空気感染ウイルスに対するろ過および除去性能の向上能力を評価しました。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ウイルス、株、培養土、感染性ウイルスの数
バクテリオファージPhi6は、もともとアン・K・ヴィダバー博士によって研究グループに提供され、Pseudomonas syringae pvを使って増殖されました。フェーズオリコラHB10Yを宿主細菌として扱います。宿主は22°Cのルリア・ベルターニ(LB)培地で培養されました。 Phi6寒天ストックは、Bamfordら(1995)41のプロトコルに従い、冷凍材料から連続希釈によって製製され、表面生存可能性測定およびウイルス精製の両方に使用されました。

Phi6の精製および濃縮は、Bamfordら(1995)によって開発されたプロトコルに従って行われました。得られた懸濁液は、1 mM塩化マグネシウム(MgCl₂)を含む20 mMリン酸カリウム(K₃PO₄)バッファーで希釈され、pH 7.2に調整され、最終的な抗体価は1ミリリットルあたり5 ×10–1011 プラーク形成単位(PFU/mL)となりました。この準備されたサスペンションはその後、エアロゾル生成実験に使用されました。

感染性ウイルス粒子の列挙は、バクテリオファージPhi6に最適化された標準的な二層寒天上層プラークアッセイを用いて行われました。簡単に言えば、各ウイルスまたは対照サンプルに対してLB培地で最初の連続希釈を準備し、その後各希釈液100μL、宿主細菌懸濁液200μL、軟質寒天3mLを加えました。軟らかい寒天混合物はLB寒天プレートの上に重ねられ、プレートは22°Cで一晩培養されました。その後、プラークをカウントし、PFU/mLの数(プラーク×希釈係数)÷プレート体積として計算しました。

qRT-PCR解析
定量的逆転写リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)のサンプル調製は、Gregorova ら(2022)43 のプロトコルに従って行われました。P2およびP8 RNAの標準曲線は、102分子から10 9分子/5 μLの範囲の10倍希釈系列を用いて生成されました。各希釈は実験サンプルと同一の方法で処理され、クロロホルム添加、渦巻き、10000 × gで22°Cで1分間遠心分離、サイクル(サイクルおよびプライマー情報は補足表1および補足表2参照)が含まれます。RNAテンプレートの代わりに5μLの超純水を代替して陰性対照を作成した。qRT-PCRデータは特定の設計・解析ソフトウェア(材料表参照)を用いて解析されました。

エアロゾルチャンバーのセットアップ
ウイルスのエアロゾル化およびフィルター試験用に、先に記述されたシステム31をモデルにしたカスタム製作のオートクレーブ可能なエアロゾルチャンバーが開発されました。実験室は、同じ蓋を備えた円筒形のガラスボディ、内部の金属足場、そして気密性を確保するための絶縁ガスケットで構成されていました(材料 表 および 補足図1参照)。

チャンバーを含む全体の研究環境は 図1に示されています。ウイルスエアロゾルの安定かつ再現性を確保するために、ネブライザーとエアポンプを組み合わせて使用しました(材料 表参照)。

チャンバー内でネブライザーは8L/minのエアロゾル流量を発生させました。この流量の約4分の3はHEPAフィルターを通じて排気に送られ、残りの4分の1(2 L/min)はチャンバーに流入しました。この分割は長時間の測定時に湿度を下げるために設計されました。エアロゾルは金属の漏斗を通じてチャンバーに導入され、その流れをフィルターまたはプレフィルター表面に導きました。

エアロゾル実験は生物安全キャビネット内で行われました。チャンバーを通過した後、HEPAフィルターと流量計を過剰な湿気から保護するために、空気の流れは乾燥器で除湿されました。外部ポンプがさらに空気の流れを支え、システム内に負圧を作り出し、排出ポートからの効率的な排気を確保しました。

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図1:実験用エアロゾルチャンバーおよびサンプル収集の回路図。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

研究デザイン
本研究は、 表1、 補足表3、 補足表4 (材料 表も参照)に記載されたコーティングおよびフィルター/プレフィルター材料の抗ウイルス特性を評価しました。調査は表面試験とエアロゾルチャンバーでのプレフィルター試験の2段階で実施されました。

表面試験では、すべてのコーティング材料がまず平らな試験板上で評価され、抗ウイルス活性が評価されました。コーティングされた試験部品はClean Touch Medical LTD(表1 および 材料表)から提供されました。すべてのコーティングは、独自のマトリックスに埋め込まれた銅および/または銀の有効成分に基づいています。配合の違いは主に金属組成、濃度、表面適合性(例:平面と多孔質フィルター)に関係しています(補足表3)。

エアロゾルチャンバーでのプレフィルター試験:利用可能なコーティングの中で、研究中にプリフィルターに適用可能だったのは銅および銀系コーティングのVS-Bのみでした。VS-Bで処理されたプレフィルターはエアロゾルチャンバー内で検査され、エアロゾル曝露条件下での抗ウイルス性能が評価されました。研究で使用されたすべてのフィルターおよびプレフィルターの写真は 補足図2に掲載されています。

抗ウイルス効果は、感染性ウイルス粒子の数を測定するプラークアッセイ(「ウイルス、株、培地、感染性ウイルス数」セクション参照)と、ウイルスゲノムコピー数を決定する定量PCR(qPCR)の2つの補完的な方法で定量化されました(「qRT-PCR分析」セクション参照)。

フィルターとプリフィルターフィルターは以下の通りですコーティング
(すべてクリーンタッチ・メディカル提供)
ポリエステルプレフィルター FMR-5、コーティングなし(FMR-5)MフィルターLTD実験的な銅ベースの表面剤A6(A6)
実験用銅系表面剤B4(B4)
銅と銀の表面剤 ウイルスセーフ(VS)
銅と銀の表面剤 ウイルスセーフB(VS B)
ポリエステルプレフィルター FMR-5、VS B(FMR-5 VS B)コーティング
ポリエステルプリフィルターS-11、コーティングなし(S-11)
ポリエステルプリフィルターS-11、VS Bコーティング(S-11 VS B)
二層ガラス繊維フィルターGF-2、コーティングなし(HEPAタイプフィルター)(GF-2)
ブルプレンプリフィルターBP-6、6mm、コーティングなし(BP-6)クリーンタッチ・メディカルLTD
BulprenプリフィルターBP-6、6mm、VSBコーティング(BP-6VS B)

表1:本研究で使用されるフィルターおよび表面コーティング。

抗ウイルス表面コーティングの効率
異なるコーティング材料におけるウイルス感染性の持続性を評価する表面生存性アッセイが開発されました。簡単に、20μLのPhi6ストック(「ウイルス、株、培地、感染ウイルスカウント」の節参照)をコーティングされたテストピースにピペットで送り込み、滅菌ガラスの三角形を使って2cm×2cmの範囲に均等に広げました。サンプルは22°Cのバイオセーフティキャビネットで1分、5分、1時間、または3時間にわたりインキュベートされました。

ウイルスは、表面に新鮮なLBブロス180μLを加え、繰り返しピペットで洗浄することで回収されました。プラスチック製のペトリ皿が操作面として使われていました。すべての実験は22°Cで行われました。 感染性ウイルス粒子の数はプラークアッセイ41を用いて定量化されました。

抗ウイルスコーティングVS-Bがフィルター/プレフィルター効果に与える影響
ウイルスの収集およびろ過効率試験は、20 mM HEPESバッファー(pH 7.2)を含むペトリ皿を使ったインパクション法または、全ガラスの渦巻きインピンガー(以下「インピンガー」と呼びます; 材料表参照)を用いて行われました44。インパクションサンプリングでは、粒子の堆積を最大化するためにペトリ皿をフィルターの真下に配置しました(図1)。3か月間使用されていたGF-2フィルターの実験では、感度を高めるためにペトリ皿の代わりにインピンガーが使用されました。インピンガーは3つのノズルを備えたガラス製の装置で、空気を液体に取るための外部ポンプが必要です。ノズルを通る空気の流れは、集水液を内壁に沿って渦巻きながら動きさせ、穏やかな粒子除去を促進します。この構成では、フィルター内の空気流量は2L/minで維持され、チャンバーを出る際に追加のバルブが追加され、総空気流入量が10L/minに増加しました。エアロゾルは5mLの20 mM HEPESバッファー(pH 7.2)に捕捉され、蒸発バッファーは30分ごとに補充されました。インピンガー実験では、ペトリ皿とブルプレンプリフィルター(気流均等化に使用)、 補足図1 および 補足図2B)は削除されました。

詳細なサンプリングプロトコルは 表2に示されています。ウイルスエアロゾルは、20 mLの20 mM HEPESバッファー(pH 7.2)を含むペトリ皿から1 mLの懸濁液を回収して採取しました。そのうち、qRT-PCR解析には800μL、ウイルス滴定には200μLが使用されました。各フィルターまたはプリフィルターは三回ずつテストされ、各チャンバー実験の前後15分間、フィルター/プリフィルターなしでのコントロールランが行われました。事前実験コントロールの後、対象のフィルターまたはプレフィルターがチャンバーに挿入され、3時間運転された後、フィルター/プレフィルターを取り外し、実験後のコントロールランが実施されました。qRT-PCRおよびウイルス滴定サンプルは30分ごとに採取され、1実験あたり8枚のqRT-PCRおよび8枚の滴定サンプルが得られました。インピンガー実験では、滴定サンプルは3時間のラン終了時に一度だけ採取されました。各qRT-PCRサンプルは液体窒素でスナップ冷凍され、-80°Cで保存され、その後使用されるまで使用され、ウイルス滴定サンプルは実験直後にプラークアッセイで処理されました。ネブライザーに使用されたウイルス溶液は、各実験の前後に安定性を監視するために調整されました。

BP-6、S-11、FMR-5の3種類のプリフィルターとGF-2フィルター(表1 および 補足図2、 補足表4)がVS-Bでコーティングされました。プレフィルターは構造密度の異なる合成繊維材料で構成され、主に粗粒子除去と気流安定化を目的としていましたが、GF-2フィルターはHEPA型の高性能ガラス繊維フィルターです。コーティングされていないプレフィルターとフィルターなしのセットアップがエアロゾルチャンバーで比較のために試験されました。

タイムポイントセットアップサンプル
制御0-15分フィルターやプレフィルターなし、20mLのHEPESを入れたペトリ皿滴定用200μl、qRT-PCR用凍結800μL。
実験0-30分興味のあるフィルター/プレフィルター、20mLのHEPES入り新しいペトリ皿
30〜60分興味のあるフィルター/プレフィルター、同じペトリ皿に19mLのHEPESを使ったものです
60〜90分興味のあるフィルター/プリフィルター、同じペトリ皿に18mLのHEPESを入れたものです
90〜120分興味のあるフィルター/プリフィルター、同じペトリ皿に17mLのHEPESを入れたものです
120〜150分興味のあるフィルター/プレフィルター、同じペトリ皿に16mLのHEPESを入れたもの
150〜180分興味のあるフィルター/プレフィルター、同じペトリ皿に15mLのHEPESを使ったものです
制御0-15分フィルターやプレフィルターなし、新しいペトリ皿に20 mLのHEPESを入れました

表2:サンプル採取のタイムライン。

抗ウイルスコーティングが使用済みフィルターに与える影響
銅銀表面剤Viral Safe(VS)を塗布したHEPA型GF-2フィルターに対する抗ウイルス効果の耐久性は、感染ウイルス数とウイルスゲノムコピー数の両方に基づき、3か月間使用されたフィルターのろ過効率を測定することで評価されました。これらの実験では、HEPAフィルターと活性炭層を備えた4台の空気清浄機(材料 表参照)が使用されました。これらのフィルターは、収集と分析の前に2つのレストランで3か月間運用されていました。1つは高級レストラン、もう1つは工場のスタッフカフェテリアでした(詳細は 補足図3 および補 足図4参照)。これらの使用されたフィルターの性能は、クリーンでコーティングされていないGF-2フィルターと比較しています。

チャンバー試験前に、使用済みフィルターは空気清浄機の金属製ケージから取り出され、展開され、適切なサイズのパーツに切り分けられ、層流フード内のエアロゾルチャンバーに設置され、バイオセーフティを確保し交差汚染を最小限に抑えました。高級レストランやスタッフカフェテリアから採取したGF-2フィルターは、「研究デザイン」で説明された実験装置で試験され、エアロゾル採取には改良された5mLインピンガーが用いられました。

抗ウイルス効率に加え、フィルターの物理的表面特性も評価されました。脂溶性は50μLの菜種油液滴を散布して評価し、疎水性は50μLの脱イオン水液滴を切り抜いたフィルターストリップに適用して測定しました。接触角はXiaoとWiesner(2012)45の手順に従って写真で記録されました。水はLichnerら(2006)によって記述された水滴浸透時間(WDPT)測定を用いて定量化され、すべての値は7200秒46を超えました。

統計解析
標準化された統計ソフトウェア(材料 表参照)を用いて統計解析を行い、テストされたコーティング材料とフィルター間の観察された差異の有意性を評価しました。すべての実験で統計解析は2段階で行われました:Kruskal-Wallis H検定とGames-Howellのpost-hoc検定です。Kruskal-Wallis H検定を用いて有意な差が観察されたかどうかを評価し、サンプルタイプ間の特異的変動はGames-Howellのポストホック検定との多重平均比較を用いて決定しました。

コーティング効率試験は、開始濃度と比較して1分および5分時の感染ウイルス濃度の減少を比較して統計的に解析されました。フィルターにコーティングを用いる目的から、テスト開始数分以内に対照群と比較してウイルスの生存率に統計的に有意な偏差があるかどうかを調べました。

30分、60分、90分、120分、150分、180分の各時点で、コーティング有無のプレフィルター効率に感染者数とqPCR結果の有意な差を統計解析で行いました。データはプレフィルターの種類とプレフィルター表面のコーティングの有無でグループ化されました。同様に、使用されたGF-2フィルターの効果は、フィルター表面の位置やコーティングの有無でデータをグループ化することで、ウイルスの不活化およびろ過効率を評価しました。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

抗ウイルス表面コーティングの効率
表面の生存可能性アッセイでは、試験されたすべてのコーティング材料が抗ウイルス特性を持ち、VSコーティングが最もウイルス不活化速度が最も遅いことが確認されました(図2A)。統計解析により、各コーティングおよび対照群の開始濃度に比べて1分および5分の感染ウイルス濃度が有意に減少していることが確認されました(p < 0.001、 図2B、 補足表5)。実験的な銅系表面コーティングB4は最も速い減少を実現し、5分以内に感染ウイルスの数を最大3桁減少させ、15分後にはウイルスが検出不能となりました(検出限界:100 PFU/mL)。他のコーティングであるA6およびVS-Bも、それぞれ25分以内にPhi6を完全に不活化させました(図2A)。

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図2:表面コーティングの抗ウイルス効果がウイルス感染力に与える影響。(A) 感染粒子の時間の減少。(B) 感染性ウイルス粒子損失の比率と0分時点の比較。コーティング仕様は表1および補足表3に記載されています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

対照群と比較して、最初の5分間でウイルス不活化はA6コーティングで最も効率的でなかった(p = 0.006 1分、p = 0.012 5分時、 補足表6)、次いでコーティングVS(p = 0.001 p = 0.001 / 5分 p = 0.017、 補足表6)が続きました。コーティングB4は1分時点で対照群に比べて不活化が減少しました(p = 0.001、 補足表6)が、5分時点では対照群と有意な差はありませんでした(p > 0.05、 補足表6)。より長期的に、VS-BはB4やA6と同様にウイルスの不活化が増加しました。統計分析の詳細な結果は 補足表6に記載されています。

抗ウイルスコーティングVS-Bがフィルター/プレフィルター効果に与える影響
実験により、研究対象の3つのプレフィルターであるBP-6、S-11、FMR-5はいずれも、フィルターなしセットアップと比較して通過する感染ウイルスの数を1.5〜2.0桁も有意に減少させる効果が同じくらいであることが示されました(図3A、 補足表7)。GF-2フィルターはウイルス量を少なくとも6桁に低下させ、検出限界内で感染性のPhi6ウイルスプラークは検出されませんでした( 図3Aでは未検出データ(*)として示されています)。

VS-Bコーティングは感染性ウイルスのろ過効果に有意な影響を与えませんでした(図3B)。プレフィルターS-11およびFMR-5では、コーティングされた前フィルターと非コーティングされたプレフィルターを通過する感染性ウイルスの数の差が標準偏差(SD)以内であり、差の重要性が低いことを示しています(補足表8)。驚くべきことに、コーティングされていないプリフィルターBP-6は最初の90分間でコーティングされたBP-6プレフィルターよりも良好な性能を示しました。しかし、コーティングされた前フィルターと未コーティングのプリフィルターの違いは統計的に有意でないことが証明されました(p > 0.05、 補足表8)。

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図3:インプションプレート上のネブライズ化Phi6ウイルスの平均感染ウイルス濃度。(A) GF-2フィルター、フィルターなしセットアップ、プレフィルタープレフィルターの場合。(B)プレフィルター専用。誤差バーは標準偏差(SD)を表し、フィルターの種類は表1に記載されています。VS-Bはコーティングされたフィルターを示します。GF-2フィルタデータは検出限界を下回り、点線で示されています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

qRT-PCR実験結果では、プレフィルターは通過するウイルスのゲノムコピー数を最大2桁減少させ、GF-2フィルターはフィルターなしのセットアップと比べて最大4桁減少しました(図4A、 補足表9)。最初の30分間は、プリフィルターと無フィルターのセットアップの差は小さく、60分以降はプレフィルターの機械的フィルタ効率が向上しました(図4A、 補足表10)。VS-Bコーティングはフィルターを通過するウイルスのゲノムコピー数に影響を与えませんでした(図4B)。ゲノムコピー数の差は標準偏差内に収まりました(p > 0.05、 補足表10)。

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図4:インプションプレート上のネブライズ化Phi6ウイルスの平均ゲノムコピー数濃度。(A) GF-2フィルター、フィルターなしセットアップ、プレフィルターの場合。(B)プレフィルター専用。誤差バーは標準偏差(SD)を表し、フィルターの種類は表1に記載されています。VS-Bはコーティングされたフィルターを示します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3 と 図4 は、感染性ウイルス(PFU/mL)がフィルターを通過するウイルスの全ゲノムコピー数と比較して、前フィルターとGF-2フィルターで約2桁少なく、フィルターなしのウイルス数はわずか1桁小さいことを示しています。これは、穏やかな空気の流れであっても、ウイルス粒子に対して機械的に破壊的な効果を及ぼし、感染力の喪失につながることを示唆しています。

実験的な気流(2 L/min)と推定フィルター表面積(~20 cm²)に基づくと、面速度は約0.01〜0.02 m/sでした。繊維フィルターの典型的な孔隙率値は、材料や詰め込み密度によっておよそ0.7から0.98の範囲であり、ガラス繊維HEPAタイプのフィルターは一般的により開放的な合成プレフィルター(~0.85–0.98)に比べて低い孔隙率(~0.7–0.9)を示します47,48。フィルターの多孔率と内部流の条件を考慮すると、フィルターマトリックス内の間隙速度は表面速度よりやや高いと推定されました(0.02〜0.03 m/s)。フィルター厚さとトートルシティ係数(1.2–2.0)を用いると、フィルター構造内でエアロゾル粒子の有効滞在時間は約0.03から0.4秒49の範囲と推定されました。これらの数秒未満の相互作用時間は、ウイルスと表面の接触が非常に一時的であり、単一通過ろ過時の抗ウイルスコーティングの貢献を制限していることを示しています。

抗ウイルスコーティングが使用済みフィルターに与える影響
選ばれた2つのレストランで3か月間空気清浄機に使われたコーティング付きおよび未コーティングのGF-2フィルター(補足図3および補足図4)のろ過能力が調査されました。同じ実験条件下で、未使用でコーティングされていない(対照)フィルターは1.23 ×10 2 PFU/mLの感染性ウイルスを通過しました。高級レストランおよびスタッフカフェテリアから使用された未コーティングフィルターは、それぞれ感染性ウイルスのPFU/mLあたり~3%×11PFU/mLを排出しました。これに対し、高級レストランおよびスタッフカフェテリアで使用されたVSコーティングされたフィルターは、それぞれ5.3 ×1 PFU/mLおよび4.6 ×1 PFU/mLの感染性ウイルスを排出しました(図5)。感染ウイルスの個体数に統計的に有意な差が観察され、3か月使用された未コーティングGF-2フィルターが最も顕著な減少を示しました(図5;χ2(2) = 11.432、p = 0.022、補足表11)。コーティングされた3か月前のGF-2フィルターを用いた結果は、未使用の未コーティングGF-2フィルターとp > 0.05で同様の結果を示しました(補足表12)。

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図5:使用済みフィルター3か月後の感染性ウイルス濃度。各データポイントは、3回の実験の平均と3回の繰り返しにわたる計算標準偏差を表します。VS = 銅・銀表面剤 ウイルス安全;GF-2 = 二層ガラス繊維フィルター GF-2、コーティングなし(HEPAタイプフィルター);ボックスは平均の95%信頼区間を示しており、これは下信頼区間と上限信頼区間の黒線です。エラーバーは各フィルタータイプごとに標準偏差(SD)を表します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

使用済み、未使用、コーティング済み、未コーティングフィルターのqRT-PCR結果は図6に示されています。未使用でコーティングされていない(対照)フィルターのqRT-PCRデータは、ウイルスゲノムコピーが2.7×103コピー/mLで検出されました。ファインダイニングレストランおよびスタッフカフェテリアの未コーティングフィルターでは、それぞれ3.6 ×10 2コピー/mL、2.4 ×103 コピー/mLが検出されました。一方、ファインダイニングレストランおよびスタッフカフェテリアのVSコーティングフィルターは、それぞれ2.8 ×10 3コピー/mL、4.6 × 103コピー/mLでウイルスコピーを示しました(図6).高級レストランの未コーティングGF-2フィルターは、スタッフカフェテリアの未コーティングフィルター(p = 0.012)、高級レストランのコーティング済みVSフィルター(p < 0.001)、スタッフカフェテリアのVSコーティングフィルター(p = 0.005)と比べてウイルスゲノムコピー数の減少に有意に効率的でした(補足表13および補足表14).しかし、未使用でコーティングされていないGF-2フィルターと比較して、高級レストランで使用された未コーティングのGF-2フィルターは統計的に有意な差は見られませんでした(p>0.05)。詳細な統計分析結果は補足表14に示されています。

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図6:3か月前の使用済みフィルターを検査した後のウイルスゲノムコピー数の濃度。 各データポイントは3つの実験の平均値と計算された標準偏差を表しています。VS = 銅・銀表面剤 ウイルス安全;GF-2 = 二層ガラス繊維フィルター GF-2、コーティングなし(HEPAタイプフィルター);ボックスは平均の95%信頼区間を示しており、これは下信頼区間と上限信頼区間の黒線です。エラーバーは各フィルタータイプごとに標準偏差(SD)を表します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

フィルター性能の違いを明確にするために、疎水性と脂溶性試験が実施されました。高級レストランおよびスタッフカフェテリアで使用されるすべてのフィルターは、両面(内側—入気流面、外側—外側—外気流面)で高い疎水性を示し、水滴の初期接触角は常に120度を超えていました(写真には表示されていません)。水滴浸透時間(WDPT)測定では、すべての値が7200秒を超える強力な撥水性を示しました。繰り返し試験間のばらつきはフィルターの種類間よりも大きく、使用されたフィルターの機械的な乱れが原因と考えられています。その結果、これらの方法を用いたフィルター間で有意な違いは検出されませんでした。

脂溶性は、菜種油滴をフィルター表面に散布することで評価されました。コーティングされていないフィルターは一貫して低い脂溶性を示し、検査中ずっと液滴の接触角が120度以上に保たれていました。対照的に、Viral Safeコーティングされたフィルターは、適用から60秒後に約30度未満の角度を記録し、飛沫の拡散が急速に見られました(補足図5)。この脂溶性の向上がコーティング自体によるものか、塗布過程によるものかは依然として不明です。

データの利用可能性
本研究の調査結果を裏付ける生データは補 足ファイル1で入手可能です。

補足図1:特注のエアロゾルチャンバーとその構成要素。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図2:フィルター、プレフィルター、コーティングの写真。 (A)ポリエステルFMR-5プレフィルター、(B)ブルプレンBP-6プレフィルター、(C)ポリエステルS-11プレフィルター、(D)二層ガラス繊維GF-2フィルター。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図3:空気清浄機が使用された高級レストランルームのレイアウト(材料表参照)。青い長方形で示されています。 黄色い長方形がテーブルを示し、暗灰色の長方形がドアを示している。グリッドの1マスは1 m2を表します。部屋の広さ ~60m 2.1日に約30人のゲストが訪れます。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図4:菓子工場、スタッフカフェテリアのレイアウト、空気清浄機(材料表参照)が青い長方形で示されています。 黄色の長方形はテーブルのマーク、暗い灰色の長方形はドア、灰色の長方形はセルフサービステーブル、黒の長方形は支持列を示します。グリッドの1マスは1 m2を表します。部屋の大きさ ~160 m²。1日に約20〜50人のゲストが訪れます。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図5:レストラン試験で使用された葉菜種油滴(50 μL)がGF-2フィルター表面に 残っている。ウイルス安全(VS)コーティングが施されたフィルター(1–5)は、コーティングされていないフィルター(1, 6–7)よりも脂質忌避性が著しく低かった。画像は、液滴の投射から60秒後に40倍倍の倍率で準備顕微鏡の眼で撮影されました。「イン」は気流が入るフィルターの側面を示します。「アウト」は空気の排出側を示します。VS-Bコーティングは外側にあります。1は高級レストランの古い中古フィルターを指します。2番と3番は高級レストランで使われていたVS-Bコーティングフィルターでした。4番と5番はスタッフカフェテリアで使用されていたVS-Bコーティングフィルターでした。6番と7番はスタッフカフェテリアで使用されていたコーティングされていないフィルターでした。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表1:qRT-PCRサイクル情報。 蓋の温度105°C、45サイクル、データ取得は62°Cステップで行われます。グレゴロヴァらより43ページより引用。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表2:qRT-PCRプライマー情報。 グレゴロヴァらより43ページより引用。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表3:本研究で使用されたコーティング材料の詳細な記述。 コーティングの正確な化学組成は製造元(Clean Touch Medical Ltd.)に固有のものです。説明は機能分類と既知の有効成分(銅および/または銀)に基づいています。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表4:本研究で使用されたフィルター材料の詳細な説明。 市販プリフィルターの正確な材料組成はメーカーによって完全には公開されていません。説明はHVACろ過システムで使用される典型的な材料と観察された構造特性に基づいています。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表5:テスト統計:抗ウイルス表面コーティングにおけるウイルス感染性のクルスカル–ウォリス解析。 グルーピング変数はコーティングタイプです。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表6:Games-Howellによる1分および5分の時間点におけるウイルス感染率の統計的に有意な差 多重比較のポストホックテスト結果。 統計的有意性は表の最初の2パネル、1分と5分のタイミングで「はい」と示されています。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表7:検査統計:フィルタータイプおよびノーフィルター条件におけるウイルス感染率のクルスカル–ウォリス解析。 グルーピング変数はフィルタータイプです。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表8:Games-Howellによるマルチ比較後の多重比較による、30分、60分、90分、90分、120分、150分、180分の各時間点におけるプレフィルターとノーフィルターセットアップ間のウイルス感染率検査結果。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表9:テスト統計:プレフィルタータイプ、GF-2フィルター、ノーフィルターセットアップ間のウイルスコピー数の違いを評価するKruskal–Wallisテスト結果。 グルーピング変数はフィルタータイプです。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表10:Games-Howellによる複数回比較による、30分、60分、90分、120分、150分、180分の時間点におけるプレフィルター、GF-2フィルター、ノーフィルターセットアップ間のウイルスコピー数検査結果。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表11:検査統計:未使用のGF-2フィルターとレストランで使用されるフィルター間のウイルス感染力を比較したKruskal–Wallis検査結果。 グルーピング変数はフィルタータイプです。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表12:Games-Howellによるプレフィルターとノーフィルターセットアップ間のウイルス感染性の多重比較テストの結果。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表13:プレフィルタータイプ、GF-2フィルター、ノーフィルターセットアップ間のウイルスコピー数を比較したKruskal–Wallisテスト結果。 グルーピング変数はフィルタータイプです。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表14:Games-Howellによるプレフィルター、GF-2フィルター、ノーフィルターセットアップ間のウイルスコピー数の多重比較テスト結果。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル1:本研究の生データ。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究では、微生物用エアロゾルチャンバーにおける抗ウイルスフィルターおよびプレフィルター表面コーティングの効率を評価するプロトコルを提示します。製造されたチャンバーは、オートクレーブ可能で携帯可能、透明性が高く、かつ小規模(3L)であるため、無菌微生物分析に適した制御された密閉システムを提供します。これは、以前に記載されたチャンバー31、50、51と比べて非常に大きいです。

本研究で試験されたすべてのコーティング材料は抗ウイルス活性を持つことが確認されており(図2A)、実験的な銅系表面コーティングB4が最も高い効果を示し、ウイルス感染力を検出限界以下に10分以内に低下させました。銅系コーティングA6も続いて、25分でウイルスを完全に不活化させました(図2A)。これらの発見は、銅と銀の抗ウイルス特性に関する以前の報告と一致しています 17,18,20,21,22,52。飛沫乾燥直前の最初の5分間はウイルスの不活化が観察されず、早期感染力の低下はコーティング自体ではなく乾燥によるものであることを示している(対照群、図2A、図2B)36。B4およびA6コーティングはVSおよびVS-Bコーティングに比べて不活化速度が速かったのに対し、VS-Bは検出限界に達するまでに最大60分かかりました(図2A)。B4およびA6コーティングのプリフィルターは利用できませんでした。そのため、VS-Bはその後のフィルターエアロゾル実験に選ばれました。

本研究の結果は、HEPAフィルターおよびプレフィルターが、抗ウイルスコーティングがなくても通過するウイルスの数を効果的に減少させることを強調しています。ろ過時にエアロゾル化したウイルスにかかる機械的ストレスにより、ウイルス感染率は1.0〜2.0ログ減少しました(~8 ×10 5 – 1 × 107 PFU/mLから~5 × 104 – 105、図3A)。この減少はすべてのプレフィルターテストで一貫して観察され、以前の結果を支持しています。GF-2 HEPA型フィルターでは、ウイルス感染力の喪失はさらに大きく、感度限界内に検出可能な感染粒子は存在しませんでした(図3A)。総ゲノムコピー数に比べて感染率が低いことは、ろ過がウイルス粒子に機械的損傷を与えることを示唆しており、特に包絡状のPhi6ウイルスで顕著です。包膜ウイルスは機械的破壊に敏感であるため、この差は包絡のないウイルスでは小さい可能性があります。

エアロゾル試験では、コーティングはプレフィルターのろ過性能に統計的に有意な影響を与えませんでした。これはコーティングとフィルターを通過するウイルスとの接触が限られていることを反映しており、コーティング済みおよび非コーティング型のプレフィルターでも同様の結果を生み出していると考えられます(図3B、 図4B)。計算されたサブ秒滞在時間は、現実的な気流条件下で効果を発揮するには抗ウイルス不活化の速度論が非常に短期間で行われなければならないことを示唆しています。さらに、我々の結果は、試験されたコーティングが銅イオンが負に帯電した生体分子に対して特徴的な静電親和性を示していないことを示唆しており、そうしないとウイルスをフィルターに引き寄せて通過を減少させる可能性があります56。したがって、プレフィルターコーティングの主な利点は、表面試験で示されたように、機械的ろ過効率の向上よりも、捕捉後の自己消毒特性にある可能性があります。重要なのは、本研究で行われた実験は単一通過ろ過条件を表しており、エアロゾル化した粒子がフィルターと一度だけ相互作用するというものです。これにより、非常に短い滞在時間とウイルスと表面の接触が限られ、抗ウイルスコーティングの観察可能な影響が軽減されると考えられます。これに対し、実際の空気清浄システムは循環条件下で動作し、繰り返しの空気通過によって累積接触が増え、コーティングの効果を高めることがあります。

私たちの結果は、GF-2フィルターが、未使用フィルター(図5)と比較して、高級レストランおよびスタッフカフェテリアの空気清浄機で3か月連続使用後、感染性ウイルスの除去効果が向上したことを示しています(補足図3および補足図4)。この改善はいくつかの要因に起因します。まず、粉塵やその他の粒子の蓄積がウイルスを不活化させると報告されています57。次に、室内の空気汚染物質の蓄積がフィルター構造を密にし、一時的にその効果を高める可能性があります。57,58,59。特筆すべきは、被膜の存在がウイルス感染率やqRT-PCR検出ゲノムコピー数に有意に影響を与えなかったことです。非感染性ウイルス粒子の通過もフィルターコーティングや使用に関わらず類似しており、GF-2 HEPA型フィルターおよびプレフィルターの観察されたろ過効率は主にその機械的特性を反映していることを示しています。それでも、GF-2フィルター表面にろ過された粒子が蓄積することで、通過する感染性ウイルスの数が減少する顕著な効果がありました(図5)。

図5と図6で観察されたフィルター性能の違いを理解するために、追加のテストが実施されました。すべてのフィルターは水滴にさらされると強い疎水性を示し、油滴のテストでは顕著な違いが認められ、VSコーティングされたフィルターは明らかな脂溶性を示しました。この変動の根本的なメカニズムは不明ですが、これらの結果はフィルターの年数や使用履歴が性能の主な決定要因ではない可能性を示唆しています。代わりに、表面の前処理の種類がフィルターの物理的特性を変え、その結果としてウイルスの保持や通過に影響を与える可能性があります。これらの結果は、抗ウイルスコーティングが機械的ろ過を超えた機能的利点、特に自己消毒効果を通じて機能的利点をもたらすことを示しています。これにより、使用済みフィルターを扱う人員の健康リスクを軽減する可能性があります。

このプロトコルは抗ウイルスろ過を評価するための堅牢な枠組みを提供しますが、いくつかの制限を考慮する必要があります。まず、包絡状バクテリオファージPhi6がヒト呼吸器病原体の代理として用いられました。Phi6はコロナウイルスと構造的・化学的類似性を持っていますが、環境安定性や表面タンパク質の違いが正確な不活化動力学に影響を与える可能性があります。第二に、一部のコーティングは有意な有効性を示しましたが、本研究は特定のエアロゾル条件下での限られた配合群を評価しました。今後の研究では、より広範な抗菌剤の対象範囲を広げるべきです。最後に、実験は空気流量と湿度が調整された管理されたエアロゾルチャンバー内で行われました。これらの条件は再現性を保証しますが、実際の屋内環境で見られる複雑で乱流の気流や変動する環境パラメータを完全に再現することはできません。

総じて、本研究はGF-2ガラス繊維フィルターおよびプレフィルターが、特に粒子の高密度化による長期使用後の感染性ウイルスを効率的に除去する一方で、銅および銀系コーティングの主な役割は直接接触後のウイルスの不活化であることを示しています。これらの発見は、機械的ろ過が空気感染ウイルスの制御において強靭であることを強調し、今後の研究では抗ウイルスコーティングとUV照射などの補完的な介入を組み合わせて、感染リスクをさらに低減することを示唆しています。プレフィルター60、61。また、これらのコーティングを既存の建物換気システムに統合する今後のフィールドスタディも、その性能を現 地で検証するために不可欠です。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者たちは利益相反を一切認めていない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

サリ・コルホネンには優れた技術支援に感謝されます。パヴリナ・グレゴロワはqRT-PCRプロトコルに関する助言で認められています。故デニス・H・バムフォード教授には、チャンバーの設計にかけがえのないご助言と実験全体を通じてのすべての支援をいただき感謝申し上げます。A.-P博士エアロゾル試験室の設置に協力してくれたヒュヴァリネン氏に感謝されています。ヘルシンキ大学のInstruct-HiLIFEバイオコンプレックスユニットの施設と専門知識、Instruct-ERIC Centre Finland、FINStruct、Biocenter Finlandのメンバーに感謝いたします。この研究はフィンランド研究評議会、COVID特別資金335681、そしてN.S.A.への368144資金によって資金提供されました。フィンランド研究評議会はACCCの旗艦資金(助成金番号337552)で認められています。実験の最終決定にはClean Touch Medical LTD、M-Filter LTD、UniqAir LTDからの資金提供を開示し、実験設計、実行、報告、原稿執筆には関与していません。

材料

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この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
エアロゾルチャンバーガラスシリンダーと蓋Laborexin OyN/Aエアロゾル封じ込め用のカスタムメイドのガラスシリンダーと蓋。
エアロゾルチャンバー内部金属足場Clean Touch Medical Ltd.N/Aフィルターの取り付け用にカスタムメイドされたステンレス製サポート構造。
エアロゾルチャンバー蓋の絶縁ガスケットEtra Oy (Etola Group)N/A気密シーリング用のカスタムメイドのゴムガスケット。
空気ポンプ、WI 53082Thomas Industries Inc.N/Aチャンバーを通る調整された気流を維持するために使用されるダイアフラムポンプ。
BioSamplerSKC Inc.https://international.skcinc.com/products/air/bioaerosol-samplers/biosampler空気中のウイルスを高効率で収集するために使用される全ガラスの渦巻きインピジャー。
コーティングされたテストピースClean Touch Medical Ltd.www.cleantouchmedical.com表面効力テスト用に抗菌製剤でコーティングされた光沢紙スライディング。
CompAir Pro NE-C900ネブライザーOmron HealthcareNE-C900 ウイルスエアロゾルの生成に使用される高出力圧縮機式ネブライザー。
SPSS StatisticsソフトウェアIBM Corp.https://www.ibm.com/products/spss統計分析ソフトウェア、バージョン28.0。
QuantStudio Design and AnalysisソフトウェアThermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/in/en/home/technical-resources/software-downloads.html#pcrqRT-PCRデータ分析に使用されるソフトウェア、バージョン1.3.1。
UniqAir PRO空気清浄機UniqAir Oyhttps://www.uniqair.fi/チャンバーのスカベンジングに使用される商業グレードの空気清浄ユニット。
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