本プロトコルは、新たに分離された豚の頬上皮組織粘膜を用いてペプチド浸透を評価するスクリーニングプラットフォームを説明しています。この手法は、溶液、ヒルトップチャンバー、フィルムの浸透強化剤をフランツ拡散セルおよび3DプリントインサートのもとでGLP-1RAの浸透を統合し、組織学的粘膜評価を伴います。
この記事について
サマリー
要約
膜、錠剤、トローチ、その他の用剤形態によるオロムコサル投与は、小児や高齢者、カプセルや錠剤を飲み込めない患者にとって便利な全身投与ルートを提供します。口腔および舌下ペプチド製剤の開発には、人間の非角化した口膜上皮構造に適合した前臨床モデルが必要であり、その中で豚や犬が最も適しています。私たちは屠殺場から捨てられた新鮮な豚の口粘組織を調達しました。粘膜は制御された加熱を用いて基部の平滑筋から剥離され、フランツ拡散セルまたは新規の低容量3Dプリント樹脂硬化インサートに埋め込まれました。ドナー側にはペプチドと浸透性増強剤の組み合わせが追加され、受容器側から浸透分子を採取し、超高性能液体クロマトグラフィー(uHPLC)で定量化しました。挿入物については、装着粘膜の経上皮電気抵抗(TEER)値をEVOMチョップスティック電極を用いて測定しました。フランツ拡散細胞および3D挿入物の両方でインキュベーション後の組織組織学が調査されました。浸透増剤の最適な濃度は、ペプチドと増強剤の水溶液混合物が浸透度を増加させることで選ばれました。ペプチド浸透率は、3次元(3D)挿入物で3時間で4.3%に達し、ヒルトップチャンバーモデルでは1.7%に達しました。後者は口腔膜からの直接曝露を模擬しています。ペプチド-増強剤の組み合わせを含む層別ポリマー粘着膜が開発され、拡散チャンバーを用いた浸透研究のために粘膜組織に適用されました。豚の頬粘膜を最適に組み合わせたグリコデオキシコール酸(GDC)に曝露した 際、エクスビブ ペプチド浸透率は2%に達しました。これらの 生外 スクリーニング研究は、豚および人間におけるオロムコーサール経路を通じて投与されたペプチド充填フィルム製剤の薬物動態評価への道筋を提供します。
概要
頬側および舌下口粘膜は、直接アクセス可能な部位を提供し、肝の一次代謝を回避できるため、経口投与の魅力的な経口投与経路です。これにより、経口投与を含む他の経路と比べて生体利用能や患者の受容性が向上する可能性があります。ペプチドは、分子量が高く親水性が高く、酵素分解に感受性が高いため、腸上皮を通じる浸透が困難であるため、経口投与よりも注射で投与されることが一般的です。FDAは治療用途で102種類のペプチドを承認しており、そのうち約450点が前臨床または臨床試験で評価中です。これには、透過強化剤(例:セマグルチド、リベルサス)5を配合した経口錠剤や、CatalentのZydis経口分解錠剤(ODT)技術を用いて開発された口腔粘剤プラットフォーム(Minirin MeltおよびNocdurna舌下デスモプレシン酢酸酸)が含まれます。口腔内薬の透過性研究に関する広範な調査にもかかわらず、分子の透過率値は再現性が低く、研究間での比較可能性も限られていることが示されています。これらの不整合は主に、使用された実験動物モデルの差異や、分離された口腔粘膜9の取り扱いや調製の違いに起因しています。
分離された口腔粘膜および舌下組織粘膜を用いたエクスビブ透過性アッセイは、in vivoの口粘膜小分子透過性の予測や、10,11,12型に関連する製剤成分の前臨床スクリーニングに有用なツールです。しかし、基礎の透過性がほとんどないため、ペプチドスクリーニングでの利用は限定的です。近年、豚の口腔粘膜は、その角化されていない構造と生理学的・生化学的特徴が人間に非常に似ているため、好まれるモデルとなっています。犬の口腔サンプルは、屠殺場の豚組織よりもさらに入手困難ですが、どちらも角質化されていないものです。上皮層の厚さや処理方法には大きなばらつきが残っています。口腔および舌下口腔の準備の標準化が不可欠です。短期および長期の貯蔵条件、組織の厚さ、実験中の生存率維持などの変数が、すべて体外透過性の結果に影響を与えます。組織保存は極めて重要であり、粘膜の構造的完全性と代謝活動の両方が拡散プロファイルに直接影響します(12,15)。バリア機能の喪失は、人工的に薬物浸透率を上昇させることがあります16,17。保存以外にも、ブタの頬粘膜を透過室に設置するために解剖する方法はさらなる多様性をもたらします。粘膜下結合組織の除去方法の違いは、機械的、化学的、または熱的手段によるものであり、透過性を変化させる可能性があります。一部の報告では、上皮を平滑筋から隔離するための熱分離によって透過性19が維持されると示唆されていますが、合意は見られません。現在、分離された頬粘膜20の完全性を解剖・評価する普遍的に認められた方法は存在しません。親水性糖の蛍光素イソチオシアネート-デキストラン(FITC dextran 4000, FD-4)は、500 Da未満の小分子のみが受動的に組織に浸透できるため、豚の頬粘膜の整合性マーカーとして一般的に用いられます。対照的に、粘膜が完全な場合はFD-4輸送を制限し、ドナーからレシピエントへの移動が0.6%未満であれば、2〜4時間21,22時間で一般的に許容されると考えられます。さらに、ヘマトキシリンおよびエオシンの組織染色は、上皮形態の簡単な評価を提供します。
本研究では、一定期間内に粘膜の完全性と透過性を最適化するために、分離された豚の頬粘膜の粘膜処理に関する標準化されたプロトコルを確立しました。私たちの目的は、豚の頬上皮組織を解剖するための実験的枠組みを提供し、拡散チャンバーや挿入体に装着されたオロムコースを横断したペプチドの 外 域透過性評価の信頼性を高めることでした。まず、屠殺場から損傷のない口腔粘膜を特定するために目視解析を行いました。実験中に組織処理技術、粘膜の厚さ、組織の完全性を維持する方法を最適化しました。安定した低濃度グルカゴン様ペプチド1受容体作動薬(GLP-1 RA)類似体をツール分子として用い、胆汁塩浸透促進剤であるグリコデオキシコレートナトリウム(GDC)の有無にかかわらず、フランツ拡散セルに取り付けられた頬粘膜およびカスタム製3Dプリントのトランスウェルタイプインサートに対してペプチド浸透研究を実施しました。GDCおよびGLP-1 RAは、溶液、ヒルトップチャンバー、粘着性ポリマー二層膜から口腔粘膜に提示されました。主要な評価評価項目として、透過性マーカー、組織組織学、および経上皮/内皮電気抵抗(TEER)値を用いました。
プロトコル
本研究で使用された豚のほっ歯は、地元の屠殺場から採取されました。したがって、倫理的な承認は必要ありませんでした。
1. 豚の頬上皮の分離、調製、貯蔵
- 地元の屠殺場から豚の頬組織を採取し、90分以内に氷のように冷たいリン酸バッファー生理食塩水(PBS、pH 7.4)で検査室へ輸送します。次の60分以内に、先に説明した方法に従って組織を準備し、図1に示すように異なるオロムコーサ部位にわずかな修正を加えます。
- メスを使い、頬粘膜を下層組織から分離し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で組織を3回洗い流します。視覚的な表面損傷がある粘膜は捨ててください。
- 65°CのPBSに3分間浸け、サイズ5の時計職人用鉗子を使って上皮と残存する結合組織を平滑筋から分離します。この方法は舌下粘膜や舌上皮粘膜の分離にも応用可能です。
- 解剖したオロムコースはセルロースフィルターペーパーで優しく乾燥させ、浸透検査(望ましい方法)または最大4週間冷凍します。
- 分離後の冷凍処理には、オロムコーサを85%グリセロール25のクライオプロテクタントに2時間浸し、優しく振る。高粘度グリセロールは細胞間水の代わりに機能し、組織構造を損傷する可能性のある水結晶の形成を防ぎます。
- この期間が終わったら、グリセロールを新鮮なPBSと10%グリセロールに置き換えます。粘膜サンプルは保存期間に応じて-20°Cまたは-70°Cで凍結します。凍結手順は~-1°C·min-1の制御された速度で行います。
注:すべての実験は、異なる動物の頬から採取した少なくとも3つの組織標本を用いて実施されます。
2. フランツ拡散細胞に埋め込まれた粘膜における エクスビブ 浸透研究と、GLP-1 RAおよびGDCを提示するためのヒルトップチャンバーの使用
注: エクスビブ 透過性研究は、まず新鮮に分離された豚の頬粘膜をフランツ拡散細胞(FDC)を用いて行われます。
- 剥離した粘膜を図2に示すチャンバー(窓面積1.2 cm2)に取り付け、PBS(pH 6.8、ドナー側、1 mL)およびPBS(pH 7.4、受主側、10 mL 容積)で30分間平衡させます。
- 平衡30分後、ドナー溶液PBS(pH6.8)をGLP-1RA(25 mg/mL)とGDC(25 mg/mL)の比率1:1のPBSに置き換えます。
- 受信チャンバーを10mLのPBS pH 7.4で攪拌し続け、37°C、300rpmで維持してください。受信区画から1mLを60分ごとに180分間採取します。実験の開始時と終了時にドナー区画から三重サンプルを採取します。各サンプリング後は、チャンバーに1mLのPBSを補充します。
- 実験終了時に組織を10%ホルマリンに保存し組織学的にするか、均質化して組織内に残るGLP-1RAペプチドを定量します。
- 同様に、GLP-1RAの透水率はヒルトップチャンバー(HTC)を用いて測定します。
注:HTCを使用する目的は、GDCが溶液中のGLP-1 RAに対して口膜浸透を増強する効果を確認し、その後二層口腔膜を製剤することです。HTCは、生体適合性のスチレン-エチレン-ブチレン-スチレン(SEBS)ブロック共重合体であるKraton G-2705から作られたチャンバーで、外径19mm。100%不織綿繊維からなる直径12.7mmのWebrilパッドを含み、溶液塗布用の吸収性非粘着材料として機能します。 - 同様に、粘着剤二重層膜に充填されたGLP-1RAおよびGDC(1:1比率)の 体外 透過性を、HTCで説明されるFDCのドナーチャンバーや3Dインサートにフィルムを配置することで評価します。
- 豚の口腔上皮組織の完全性を確認するために、FD-4(0.05 mM)を蛍光フラックスマーカーとして使用し、ドナー側に追加して組織全体の漏れを評価します。
注:漏れを示す組織は透水率計算から除外されます。 - 3時間の実験後、基底外側区画から採取した200 μLサンプルの3回分のuHPLC分析により累積GLP-1 RAフラックスを定量化します。浸透実験を3回繰り返します。GLP-1RAの濃度を基準にした校正曲線からGLP-1RAの累積フラックスを定量化します。
3. GLP-1RAおよびGDCで閉じ込められた頬膜の準備
注:粘着剤と裏層を含む頬側二重層膜は、半自動コーター27を用いた溶剤鋳造を用いて製造されます。
- HPMCとPVP-K90を薄膜形成ポリマーとして、粘着剤Na-CMCを用いてGLP-1RAを捕捉するための二重層膜を準備します。
注:粘着剤および頬膜の裏地層の組成については 表1 を参照してください。GDCはGLP-1 RAペプチドと低mg量のモデルフィルムに組み込まれ、チャンバー内に取り付けられた豚の口腔粘膜を通じたペプチド浸透への影響を観察します。 - 粘着層を、膜形成ポリマー45mgのHPMC、10mgのNa-CMC、25mgのPVP-K90を、3%グリセロールを含む脱イオン水に磁気ホットプレート攪拌器を用いて400rpmで10分間溶かして準備します。
注意:HPMCは室温で溶解しますが、PVP-K90は40°Cで30分間加熱して溶解します。 - 攪拌中に200°Fのエアロシルを2mg追加し、その後GLP-1 RAを加えます。次にGDCを加え、600rpmで30分間分散します。
- 最終ポリマー溶液を超音波処理し、超音波浴で気泡を除去します。
- ポリエチレンテレフタレート(PET)ライナーにフィルムを鋳造し、2600μmで2mm/sのドクターブレードでコーティングします。フィルムを40°Cの熱いオーブンで~1時間乾燥させます。
- 裏層としては、5%のエチルセルロース(EC)と5%のプロピレングリセロール(PG)をアルコール水(エタノール:水)に溶かし、溶けたスラリーをPETライナーに鋳造します。最後に、乾燥したフィルムを1cm×1cmの正方形に切り、アルミ袋に詰めて4°Cで保存します。
4. カスタム3Dトランスウェル模倣インサートの印刷
注:3Dプリントされたカスタムインサートは、前述の方法でわずかな修正を加えて製造されています。
- 簡単に言うと、コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使って3Dモデルを設計します。
- 3Dインサートの寸法は、主円筒形ボディ(ドナーチャンバー)と同じに保ち、最大表面積は1659.06 mm2、外部寸法はx軸25.20mm、y軸14.50 mm、z軸21.63 mmと保ちます。
- さらに、上皮組織を支えるための着脱可能な円形保持リングを設計してください。リングの外径は約19.90mm、内径は17.93mmで、主円筒形ボディの寸法に対応し、トランスウェル12ウェルプレートにも収まります(図3)。
- すべての部品は、UV硬化可能なクリア樹脂を用いたデスクトップステレオリソグラフィー(SLA)3Dプリンターで製造します。すべての寸法は概算であり、トランスウェルへの適切な適合性と実験的適合性を確保するために必要に応じて調整可能です。
注:未反応のモノマーおよび浸出可能な物質の除去を確保するため、すべての部品は標準化された後処理プロトコルを経ており、純粋な99%イソプロピルアルコール(IPA)で10分間洗浄した後、製造元の仕様に従いUV硬化(Form Cure 2で1分間)を実施されました。3Dモデル設計用のステレオリソグラフィーファイル(STL)は、https://doi.org/10.5281/zenodo.19368577 または補足ファイル(補足ファイル1 および 補足ファイル2)で入手可能です。
5. 粘膜を横断する3Dインサートに取り付けられた浸透
注:粘着性二重層頬膜に組み込まれたGLP-1RAおよびGDCの 体外 透水率は、FDCの代替として低容量でカスタム設計されたトランスウェル模倣3Dインサート(図2)を用いて評価することも可能です。これは、FDCの10mL受信側がペプチドを希釈し、uHPLCの検出感度に挑戦するためです。したがって、FDC設計はペプチドフラックスに対してコスト効率や実用性がなく、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)や放射免疫アッセイ(RIA)検出を継続的に必要とします。
- デスクトップ用のSLA 3Dプリンター28を使ってUV硬化樹脂でインサートを製造・印刷し、12ウェルの組織培養プレートに取り付けます。
- 豚の頬粘膜を頂端室と基底外側室の間の窓面積1.4 cm² に位置させ、STX2チョップスティック電極を挿入側に挿入したEVOM 2ボルトオームメーターを用いて基線経上皮電気抵抗(TEER)を測定します。TEERはオームの法則によって計算されます。
- 膜(1.0 × 1.0 cm2)を組織の表面に置いた後、ピペットで0.5 mLのPBS(pH 6.8)を頂端室に、1.5 mLのPBS(pH 7.4)を基底外側室に注入します。
- 受信側から3時間ごとに1時間間隔で0.2mLのサンプルを採取し、同じ量の新鮮バッファーに置き換えます。
- フラックス化されたGLP-1 RAペプチドをuHPLCで定量します。
注: 補足図1 および 補足ファイル3に示されているように、3時間経過後のGLP-1RAの吸着は観察されていません。 - STX2チョップスティック電極を用いたEVOM 2ボルトオームメーターを用いて、3時間間隔で1時間間隔で経上皮電気抵抗(TEER)を測定します。TEERはオームの法則で計算されます。
- 豚の口腔および舌下上皮組織の完全性を確認するために、蛍光マーカーとしてFD-4(0.05 mM)を使用します。
注:すべての実験は三重に行われ、報告された結果は3セットの平均的なSD±です。
6. GLP-1 RAのuHPLC検出
- uHPLCを用いて、CSH C18カラム(130 Å、1.7 μm、2.1 mm × 50 mm)を用いて、アセトニトリル(Eluent A)中で0.1% TFA、水中0.1% TFA(Eluent B)を用いて、FDCおよびインサートに装着されたオロムコーサエに浸透するGLP-1 RAの量を定量化します。 勾配洗脱は30°Cで8分間、注入容量20μL、流量0.7 mL/分、UV検出は214 nm(保持時間:~4.2分)。
- 線形性調査を行いましょう。
- GLP-1校正標準を用いて、2.5〜20.0 μg·mL⁻1の範囲で最適化されたuHPLC条件の解析応答を推定するための線形性研究を設計します。
- 校正標準(n = 6–8レベル)を独立して準備し、三重にサンプルを注入します。ピーク面積(mAU)と名目濃度の最小二乗線形回帰を行い、決定係数(r2)、%y切片、残差分布(観測・予測応答)を用いて線形性を評価します。
注:校正プロットおよび残差プロットの目視検査では、最低感度レベル(2.5 μg·mL⁻1)で線形性からのわずかな逸脱が認められ、残差はあらかじめ定められた受け入れ限界(±3%)内に収まっていました。その後、較正範囲は2.5〜20.0μg·mL⁻1の範囲に制限され、回帰分析は許容される線形性(r2 ≥0.999、y切片率<2%、残差はすべて3%±3%)を示しました。
7. 頬組織に保持されるGLP-1RAの推定
- FDCや挿入物からGLP-1 RAおよびGDCに曝露された豚の頬上皮粘膜を除去します。
- 組織をPBSで3回洗い流し、吸着した薬物とフィルム状の賦形剤を除去します。
- 次に、テーブルトップホモジナイザーを用いてPBS5mLで組織を均質化し、完全に断片化します。
- 均質化された組織とPBS間のペプチド分配の平衡を図るために、サンプルを4°Cで一晩保存します。
- その後、混合物を5000 × g で遠心分離して5分間断片を沈殿させ、上清液を回収して定量します。
- uHPLC分析前に、残留粒子を除去するために0.22μm遠心分離機フィルターで上清液を滅菌します。
8. 口膜組織組織学
注:GLP-1 RAが混合物、HTC、または薄膜から3時間浸透した後、粘膜が損傷の評価のために処理されます。
- 組織を10%ホルマリンで48時間固定し、その後パラフィンに埋め込む。
- ミクロトームを用いて5μmサイズの組織を切開します。
- 次にヘマトキシリンとエオシン(HE)で組織を染色し、4×倍率の光学顕微鏡で組織学的な完全性を調べます。
- スライドは立立顕微鏡で画像化され、画像解析ソフトウェアで解析されます。
注:全体のワークフローは 図4にまとめられています。
結果
豚の頬上皮組織の単離と解剖
豚の頬粘膜は、解剖学的特徴や生理学的バリア特性が類似しているため、ヒトオロムコーサの代替組織として広く用いられています29。豚の頬上皮組織は、 図4に示すように外科的および加熱法の両方で分離されています。最初はメスを使って頬の筋肉やより深い結合組織を除去します。結合し、保存状態のない粘膜層と結合組織を持つ分離された組織断片を、65°Cで加熱した温かいPBSに3分間入れます。組織を緩衝液から取り出し、上皮とその下の固有層をサイズ5の鉗子で剥がします。加熱により、剥離された上皮の厚さが均一で均一に保たれます。
FDCおよび3Dプリントインサートに装着された豚の頬骨粘膜にGLP-1RAの体外浸透
GLP-1RAの体外浸透は、FDCおよび挿入物に埋め込まれた豚の口腔上皮組織粘膜を用いて評価しました。GLP-1 RA: GDCの最適濃度比を評価するため、面積12.7mmの綿パッドを含むHTCをFDCに取り付けた粘膜のドナー側に固定し、ペプチド強化剤混合物を綿パッドにピペットで送り込んだ。GDCを1:1比率で含めたとき(GLP-1RA 25mg:GDC 25mg)、GLP-1 RAの累積浸透率は3時間で約4.3%に達しました。対照的に、GDCがない場合、検出可能なGLP-1RAフラックスは観察されなかった27。定量的透過率パラメータ(Pアプリを含む)は以下の式で計算されます。
Papp = 
ここで:
Pアプリ:見かけ透水係数(cm/s)。
dQ/dt:GLP-1RAの定常状態での輸送速度で、単位時間あたり輸送されるペプチド量(μg/s)として計算されます。
A: 3Dインサートの面積(cm2)。
Co:ドナー(頂端)区画におけるペプチドの初期濃度(μg/mL)。
豚の頬粘膜におけるGLP-1RAの見かけの透過係数(Papp)は 補足図2 に示されています。GLP-1RA:GDC比が1:1の場合、HTCと同じ濃度が二層膜に組み込まれました。GLP-1RAが単離された豚の口腔組織を通じた浸透は、従来のFDCセットアップでは定量化できませんでした。なぜなら、GLP-1RAが膜から粘膜に提示される速度は、溶液中の混合物やHTCからの提示よりも遅いためです。この制約を克服するため、受信機の容積を1.5 mLに減らすために、カスタムの低容量3Dプリントインサートが開発され、検出感度が向上しました。3D挿入を用いて、3時間にわたる口腔膜からのGLP-1RAの累積浸透率を測定可能で、 図5に示すように約1.8%に達しました。TEER値とFD-4フラックスを用いて上皮バリアの完全性と細胞外透過性を評価しました。治療群ではTEERの時間依存性低下が観察され(補足図3)、GLP-1RA浸透の増加と対応しました。PBSおよびブランクフィルム処理組織ではTEERに変化が見られず、二層フィルムマトリックスが障壁を破壊しなかったことを示唆しました。これらのデータは、GDCが浸透強化効果の主な要因であることを示しています。
豚組織の組織学的評価
生 体外 豚頬粘膜の組織学的評価を行い、GLP-1RAおよびGDCへの3時間曝露後の組織分離法の影響と上皮の完全性を調査しました。 図6に示すように、加熱法で得られた新たに分離された組織は正常な上皮生理構造を保持し、層状の層が保たれ、連続した表面粘液が存在し、構造的損傷の証拠は見られませんでした。対照的に、機械的分離や貯蔵・凍結を受けた組織は、上皮細胞の形態にわずかな変化と表面粘液の厚さの減少が見られました。25mgのGLP-1RAに25mgのGDCが存在した頬粘膜は上皮の完全性を維持し、未処理の対照群に非常に似ていました。軽度の浮腫と表層上皮侵食のみが観察されました。GLP-1RA単独またはブランクおよびGLP-1RAへの曝露:GDC充填の二層膜は目に見える組織損傷を生じさせず、組織学的特徴はPBS処理された対照組織と同等でした。
図1:頬部および舌下粘膜領域を示す豚の口腔内。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。
図2:FDCと構成要素。6つのチャンバーが統合システム(左)に搭載されています。フランツ・セルという個人が描かれています(中央)。個々のチャンバー内の頬組織のマウントシステム(右)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図3:3Dプリントされた1 cm2樹脂インサートの構成要素。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。
図4:豚の頬上皮分離、取り付け、浸透、組織学的特徴付けプロセスのワークフロー。BioRender.com 年に作られました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図5:GLP-1 RAの累積量。25 mg/mL GLP-1RA(赤色)、25 mg/mL GLP-1RA(25 mg/mL GDC溶液、25 mg/mL GLP-1RA:25 mg/mL GDCをフィルム(紫色)に充填し、HTC、FDC、3Dインサートを通じて塗布した後、豚の頬上皮粘膜の受け手側に累積量のGLP-1 RAが浸透しました。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図6:異なる露光条件下での豚頬上皮粘膜のHE染色顕微鏡画像。(A) ブランクフィルム、(B) GLP-1RA: GDCの水溶液混合物、(C) GLP-1RA:GDCを捕捉したフィルム、(D) 熱処理(65°C)後に新鮮組織から分離した粘膜、(E) 熱処理後に凍結組織から分離された頬上皮、(F) 機械的方法で粘膜を分離したもの。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
| 粘着層の組成 | |
| 構成要素 | 濃度(mg) |
| GLP-1RA | 12.5mg |
| GDC | 12.5mg |
| HPMC | 45mg |
| Na-CMC | 10mg |
| PVP-K90 | 25mg |
| グリセロール | 3mg |
| エアロシル 200F | 2mg |
| バック層 | |
| エチルセルロース | 5mg |
| プロピレングリコール | 5mg |
表1:粘着剤および頬膜の裏層の組成。
補足図1:3D挿入物を用いてGLP-1RAを6時間インキュベートした後のGLP-1RAの吸着。データは3つの実験(n=3)±平均SDです。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。
補足図2:3Dインサートに埋め込まれた豚の頬粘膜組織を3時間曝露した後のGLP-1RAの見かけの透過率(Papp)。25 mg/mL GLP溶液(赤)、25 mg/mL GLP + 25 mg/mL GDC 水溶液(黒)、および25 mg/mL GLP + 25 mg/mL GDC を頬膜に組み込んだ(紫)。表示されるデータは平均標準差(SD)±(n = 3)です。グループ間の統計的有意性はp< 0.05でした。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。
補足図3:経上皮抵抗性(TEER)。 3Dインサートで固定された豚の頬上皮組織から、25 mg/mL GLP-1 + 25 mg/mL GDC溶液(赤)、25 mg/mL GLP-1 + 25 mg/mL GDC 口腔膜(緑)、および25 mg/mL GLP-1RAをPBS(青)に曝露した後、経上皮抵抗性(TEER)の徐々の減少。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。
補足図4:組織の完全性と漏れ。 組織の完全性と漏れは、3D挿入物の豚頬上皮組織をドナー側の0.05 mM FD4にさらすことで評価されました。サンプルは6時間ごとに60分間隔で採取されました。3つの実験の平均+SD。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。
補足ファイル1:transwell-Oring-v7 (JOVE).stl.このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。
補足ファイル2:transwell-v9 (JOVE).stl.このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。
補足ファイル3:追加の実験詳細。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。
ディスカッション
この手法は、豚の頬側および他の口粘上皮の分離のための実験プロトコルと、低濃度安定GLP-1RA類似体を例として用いるペプチド系治療薬の透過性アッセイを説明しています。ペプチドは親水性の高分子で、粘膜を通る透過性はほとんどありません17。上記のプロトコルの成功は、頬粘膜と舌下粘膜の正確な分離と固定に依存しています。隔離には専門的な技術と厳格な温度管理が必要です。加熱過程中のわずかな熱変動でも、上皮組織に有害な生理学的・形態的変化を引き起こし、最終的には浸透データの完全性を損なう可能性があります。さらに、カスタマイズされた3Dプリントインサート内で分離組織を固定することは重要なステップです。上皮層が繊細であるため、取り付け時の組織破裂や漏れのリスクが高まります。これを軽減するために、FD4漏れ試験を用い、これはフラックス試験開始前に膜の完全性を確保するための品質管理手段として機能しています。FD4の漏れは最初に目視で評価され、さらに紫外線可視分光法を用いて定量化されました。対応するデータは補足データ(補足図4 および 補足ファイル3)に記載されています。
従来のFDCは生 前 外試験の標準とされていますが、通常10mLと受け皿内の大量の容量のため、ペプチド治療薬の定量化にはしばしば課題があります。大量のサンプルは過剰な希釈を引き起こし、標準的な分析法では浸透ペプチド濃度を低いLODより下回ってしまいます。これを回避するために、Caco-2を含む上皮細胞単分子層に用いられるトランスウェルシステムのスケールと体積を模倣した新しい3Dプリントインサートを開発しました。挿入は標準的な12ウェル組織培養プレートに直接挿入でき、孤立した豚の頬上皮粘膜を安全に収容できます。この修飾により、ドナー区画の容積は約7倍に減少し、1.5 mLとなり、分析物に集中し、uHPLCの感度制限を克服します。この適応は、高価で低透過性のペプチド医薬品の定量化において特に重要です。
GDCが存在する場合、3Dインサートシステムを用いてGLP-1 RAの浸透が増加することが観察されました。GLP-1RAの累積浸透量は3時間で~55.3μgに達し、ドナー側に最初に塗布された濃度の~4.3%に相当します。対照的に、頬膜に閉じ込められたGLP-1RAおよびGDCの濃度をFDCに貼付した頬粘膜に同濃度のGLP-1 RAフラックスを適用した際には検出できず、ペプチド浸透は起こったものの、大きな受信体体積の過度な希釈により分析的に検出できなかった可能性を示唆しています。しかし、二層頬膜製剤によるGLP-1 RAの累積浸透率は、3Dインサートで3時間経過した3時間で約1.8%に達し、微型化された受信システムを用いて投与形態から頬組織を横切る低レベルペプチド輸送を検出する可能性を示しました。GLP-1 RAの体外浸透も、ペプチドとGDCを含んだ綿パッドを含むHTCを用いて評価されました。これは、浸透増強剤を持つ薄膜からペプチドを提示可能であることを証明するための非常に有用な初期スクリーニング装置です。豚の頬上皮のバリア完全性は、TEERおよびFD-4漏れを用いて実験中に監視できます。GLP-1受容体作動薬(GLP-1 RA)への曝露中にTEERがゆっくりと時間依存的に低下することが観察され、これは胆汁塩によって頬粘膜で誘導される細胞側輸送の増加と一致します。
この技術の制約は、新鮮な豚の組織に依存していることで、屠殺場からいつでも入手できるわけではなく、組織の質にもばらつきがあります。新鮮な組織を適切な距離で入手する制約に対処するため、後で使用できる高品質なサンプルを保存するためのクライオプロテクションを評価しました。新鮮な組織の使用が最適ですが、隔離された保存粘膜組織の使用には、氷結晶の形成やそれに伴うバリア損傷を防ぐために、クライオプロテクティブの慎重な使用と凍結速度が必要です。このプロトコルは、標準的なマクロスケールの浸透研究と高感度ペプチド解析のギャップを埋める能力を持っています。3Dインサートを用いた組織分離プロセスと浸透プロトコルの両方を最適化することで、FDCで通常報告されているよりも高い再現性と感度を実現しました。さらに、3D挿入の利用は高価なペプチド分子の検出限界を研究者が提供し、 生外 粘膜研究の柔軟性とスループットを大幅に向上させています。
これらのプロトコルは、ペプチド以外の薬剤クラスを用いた粘膜組織浸透の信頼性の高い測定の基盤を提供します。 生体外 モデルから高解像度の浸透プロファイルを生成する能力は、動物モデルから得られる前臨床吸収データの予測を支援します。GLP-1 RAの 体外 浸透は、ペプチドを豊富に含んだ綿パッドと浸透促進剤溶液であるGDCを含むHTCも評価されました。この投与方法により、混合体と粘膜表面との密接かつ再現可能な接触が保証されました。トランスウェル模倣3DインサートにおいてGDCの比率が1:1の場合、GLP-1RAの浸透率が有意に増加することが観察されました。これは、浸透強化剤を持つ薄膜からのペプチド提示が、培養された上皮細胞の単一層から組織粘膜に適応した構造設計で可能であることを証明する非常に有用なスクリーニング装置です。豚の口腔上皮のバリア完全性は、TEER測定とFD4漏れを用いて実験中に監視できます。
全体として、生体外浸透および組織学的評価は、浸透強化剤の存在下での口腔および舌下ペプチド輸送の信頼できる評価は、組織準備、フラックスプロトコル、分析感度に依存していることを示している。検討された分離アプローチの中で、熱法を用いた新たに採取された豚の頬上皮および舌下上皮の分離は、上皮の完全性維持と組織解離の再現性の良好なバランスをもたらし、安定したベースラインTEER、最小限のFD4漏出、保存された組織細胞構造が示されました。重要なのは、3Dプリントインサートがレシーバーコンパートメントの希釈を減少させることで実験の信頼性を大幅に向上させ、FDCでは検出できない低ペプチドフラックスの定量化を可能にしたことです。これらの発見を総合すると、組織挿入チャンバー内で分離された豚の口腔上皮粘膜を、治療ペプチドの全身投与のための口腔投与を評価する場外プラットフォームとして利用することが支持されます。
開示事項
著者には開示すべき金銭的関与や利益相反はありません。
謝辞
著者たちは技術支援をくれたベン・ショヴリン(UCD獣医学部)に感謝しています。また、uHPLC解析のサポートをしてくれたハンス・エッカート博士(UCD化学部)にも感謝いたします。このプロジェクトは、欧州連合のHorizon Europe研究・イノベーションプログラムから助成金番号101071054のもとで資金提供を受けています。また、助成金番号13/RC/2073_P2、リサーチアイルランドCURAM医療機器センター、欧州開発基金からの追加資金支援にも感謝します。著者らは、ロズデラ・アイリッシュ・ミートのケネス・マクナマラ氏に豚の頬肉を提供してくださったことに感謝します。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| コンピューター/ラップトップ | 汎用 | 任意の標準システム | ≥8 GB RAM 推奨 |
| データ取得スクリプト | カスタム | collect.py | Pythonベースの取得スクリプト |
| 使い捨てゲル電極 | 汎用 | プレジェルAg/AgCl電極 | 使い捨て、粘着性 |
| EEG取得モジュール | Upside Down Labs | BioAmp EXG Pill | 生体電位信号のアナログフロントエンド |
| 電極ジェル（再利用可能な電極を使用する場合） | 汎用 | 導電性ジェル | 信号伝導性を向上 |
| インタラクティブアプリケーション（ゲーム） | 汎用 | 任意の簡単なゲーム（例：レース） | キーボード制御インターフェース |
| ジャンパワイヤ | 汎用 | オス＆ndash;メスコネクタ | 標準ブレッドボードワイヤー |
| Matplotlib / Seaborn | オープンソース | 最新バージョン | 可視化ライブラリ |
| マイクロコントローラボード | Arduino | Uno / Maker Uno | 10ビットADC、USBインターフェース |
| Pythonプログラミング環境 | Python Software Foundation | Python ≥3.8 | オープンソースプログラミング言語 |
| PyTorchライブラリ | Meta AI | バージョン≥1.12 | ディープラーニングフレームワーク |
| Scikit-learn | オープンソース | 最新安定版 | MLユーティリティ |
| 信号処理ライブラリ | SciPy | 最新バージョン | フィルタリング、STFT |
| USBケーブル | 汎用 | USB Type-A から B | データ転送ケーブル |
参考文献
- Karki, S., et al. Oromucosal films for peptide delivery: formulation strategies using permeation enhancers and polymers. Drug Deliv Transl Res. , (2025).
- Karavasili, C., Eleftheriadis, G. K., Gioumouxouzis, C., Andriotis, E. G., Fatouros, D. G. Mucosal drug delivery and 3d printing technologies: a focus on special patient populations. Adv Drug Deliv Rev. 176, 113858(2021).
- Brayden, D. J., Hill, T., Fairlie, D., Maher, S., Mrsny, R. Systemic delivery of peptides by the oral route: formulation and medicinal chemistry approaches. Adv Drug Deliv Rev. 157, 2-36 (2020).
- Al Musaimi, O. FDA's stamp of approval: unveiling peptide breakthroughs in cardiovascular diseases, ACE, HIV, CNS, and beyond. J Pept Sci. 30 (11), e3627(2024).
- Lewis, A. L., McEntee, N., Holland, J., Patel, A. Development and approval of Rybelsus (oral semaglutide): ushering in a new era in peptide delivery. Drug Deliv Transl Res. 12 (1), 1-6 (2022).
- Zhang, Y., Zhang, H., Ghosh, D., Williams, R. O. Just how prevalent are peptide therapeutic products? a critical review. Int J Pharm. 587, 119491(2020).
- Wanasathop, A., Patel, P. B., Choi, H. A., Li, S. K. Permeability of buccal mucosa. Pharmaceutics. 13 (11), 1814(2021).
- Mazzinelli, E., et al. Oral mucosa models to evaluate drug permeability. Pharmaceutics. 15 (5), 1559(2023).
- Djekic, L., Martinovic, M. In vitro, ex vivo and in vivo methods for characterization of bioadhesiveness of drug delivery systems. Bioadhesives Drug Deliv. , (2020).
- Mura, P., et al. A preliminary study for the development and optimization by experimental design of an in vitro method for prediction of drug buccal absorption. Int J Pharm. 547 (1-2), 530-536 (2018).
- Majid, H., Bartel, A., Burckhardt, B. B. Development, validation and standardization of oromucosal ex-vivo permeation studies for implementation in quality-controlled environments. J Pharm Biomed Anal. 194, 113769(2021).
- Wakchaure, R. S., Dhial, K., Pathak, A. Ethical and Safety Considerations in Drug Delivery Systems. Next-Generation Drug Delivery Systems. , Springer, Humana. New York, NY. (2025).
- Wang, S., Zuo, A., Guo, J. Types and evaluation of in vitro penetration models for buccal mucosal delivery. J Drug Deliv Sci Technol. 61, 102122(2021).
- Sa, G., et al. Histological features of oral epithelium in seven animal species: as a reference for selecting animal models. Eur J Pharm Sci. 81, 10-17 (2016).
- Patel, V. F., Liu, F., Brown, M. B. Modeling the oral cavity: in vitro and in vivo evaluations of buccal drug delivery systems. J Control Release. 161 (3), 746-756 (2012).
- Tian, Y., et al. Oromucosal films: from patient centricity to production by printing techniques. Expert Opin Drug Deliv. 16 (9), 981-993 (2019).
- Malhotra, S., Lijnse, T., O'cearbhaill, E., Brayden, D. J. Devices to overcome the buccal mucosal barrier to administer therapeutic peptides. Adv Drug Deliv Rev. 220, 115572(2025).
- De Vries, M. E., et al. Localization of the permeability barrier inside porcine buccal mucosa: a combined in vitro study of drug permeability, electrical resistance and tissue morphology. Int J Pharm. 76 (1-2), 25-35 (1991).
- Diaz Del Consuelo, I., Pizzolato, G. P., Falson, F., Guy, R. H., Jacques, Y. Evaluation of pig esophageal mucosa as a permeability barrier model for buccal tissue. J Pharm Sci. 94 (12), 2777-2788 (2005).
- Pather, S. I., Rathbone, M. J., Şenel, S. Current status and the future of buccal drug delivery systems. Expert Opin Drug Deliv. 5 (5), 531-542 (2008).
- Junginger, H. E., Hoogstraate, J. A., Verhoef, J. C. Recent advances in buccal drug delivery and absorption—in vitro and in vivo studies. J Control Release. 62 (1-2), 149-159 (1999).
- Goswami, T., Jasti, B. R., Li, X. Estimation of the theoretical pore sizes of the porcine oral mucosa for permeation of hydrophilic permeants. Arch Oral Biol. 54 (6), 577-582 (2009).
- Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D., Grizzle, W. A. Standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining. Biotech Histochem. 91 (5), 309-326 (2016).
- Franz-Montan, M., et al. Evaluation of different pig oral mucosa sites as permeability barrier models for drug permeation studies. Eur J Pharm Sci. 81, 52-59 (2016).
- Pegg, D. E. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , Springer, Humana. New York, NY. (2014).
- Hoogstraate, A., et al. In vivo buccal delivery of fluorescein isothiocyanate-dextran 4400 with glycodeoxycholate as an absorption enhancer in pigs. J Pharm Sci. 85 (5), 457-460 (1996).
- Karki, S., et al. A pullulan-based bilayer film for buccal delivery of a GLP-1 peptide analogue. Carbohydr Polym. 380, 125064(2026).
- Shu, W., et al. Computational and experimental analysis of drug-coated microneedle skin insertion: the mode of administration matters. Adv Mater Interfaces. 12 (17), 2500202(2025).
- Marxen, E., Axelsen, M. C., Pedersen, A. M. L., Jacobsen, J. Effect of cryoprotectants for maintaining drug permeability barriers in porcine buccal mucosa. Int J Pharm. 511 (1), 599-605 (2016).
- Rebollo, R., et al. Salcaprozate-based ionic liquids for GLP-1 gastric delivery: a mechanistic understanding of in vivo performance. J Control Release. 377, 267-276 (2025).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat Protoc. 2 (9), 2111-2119 (2007).
- Brayden, D. J., Stuettgen, V. Sodium glycodeoxycholate and sodium deoxycholate as epithelial permeation enhancers: in vitro and ex vivo intestinal and buccal bioassays. Eur J Pharm Sci. 159, 105737(2021).
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