トランスクリプトミクス解析を用いた乳がんにおけるハブ遺伝子、単一塩基多型、潜在的な薬剤標的の同定

Summary

本研究は、HER2陽性乳がんにおける治療抵抗性に関連するミトコンドリア酸化ストレス関連遺伝子を調査しました。トランスクリプトミクスデータセット、統合バイオインフォマティクス、臨床データ(n = 4,929)を用いて、著者らはMTHFD2およびPRDX3を予後価値を持つ重要な差異発現遺伝子として特定しました。 サイコで。 解析は遺伝的変異の機能的影響を示唆しています。

Abstract

HER2陽性(HER2⁺)乳がんは、ラパチニブのような治療に対して耐性を発症することが多いです。これにはミトコンドリア代謝や酸化還元再プログラムが関与する可能性があります。本研究は、ミトコンドリア酸化ストレス関連遺伝子(MOS-DEGs)を抵抗性のバイオマーカーとして特定し、その機能的なnsSNPsおよび構造的影響を特徴づけることを目的としました。RNA-seqデータセット(GSE231524、GSE231525)を用いてDEGを解析し、ミトコンドリア酸化ストレス遺伝子と交差してMOS-DEGを得たDEGsを特定しました。機能豊化、PPI解析、ROC解析、発現プロファイリング、生存分析が実施されました。nsSNPは複数の予測ツールを用いて評価され、構造的影響は二次モデルおよび3Dモデルで評価されました。統合トランスクリプトミクスおよび臨床解析により、MTHFD2およびPRDX3がミトコンドリア酸化還元代謝において相反する調節役割を示す中心MOS-DEGとして特定されました。MTHFD2は有意に上位調節され、予後不良(HR = 1.53、p = 1.1 × 10⁻¹⁶)と関連し、PRDX3は保護的な発現パターンを示しました(HR = 0.73、p = 7.7×10⁻¹⁰)。ROC解析は、これらの技術が治療反応の予測因子としての可能性を示唆しました。nsSNP解析により、MTHFD2に5つの有害変異、PRDX3に4つの有害変異が確認され、そのうちrs1471336772(MTHFD2)およびrs747786383(PRDX3.)が最も病原性が高いと特定されました。これらの変異体は、SIFT ≤ 0.05、PolyPhen-2 ≥ 0.85、有害なCADDスコア、高いREVELスコアなど複数の計算スコアシステムに基づき有害であると予測され、触媒またはレドックス活性ドメイン内に位置していました。構造モデルにより、これらの置換は構造を不安定化させ、金属および補因子結合部位を破壊し、NADPH再生やチオレドキシン依存性の過酸化酵素活性に影響を与える可能性が示唆されました。分子動力学の予測は、構造的安定性の喪失や柔軟性の変化の可能性を示し、ミトコンドリア酸化還元制御の機能障害の可能性を示唆しました。本研究は、HER2⁺ 乳がんにおけるミトコンドリア酸化ストレスの調節因子としてMTHFD2およびPRDX3を同定しています。これらの遺伝子における有害なnsSNPは酸化還元バランスの変化に寄与し、代謝適応(MTHFD2)や抗酸化防御(PRDX3)に影響を与える可能性があります。

Introduction

乳がんは世界中で最も一般的に診断されるがんであり、早期発見や標的治療の大きな進展にもかかわらず、がん関連死の主な原因の一つ^です。乳腺腫瘍内の分子異質性は多様な臨床結果や治療反応の基盤であり、精密^腫瘍学に継続的な課題をもたらし^{ています。}認知されている分子サブタイプの中で、ヒト表皮成長因子受容体2(HER2)陽性乳がんは全乳がんの約15〜20%を占め、HER2遺伝子増幅およびHER2受容体チロシンキナーゼの過剰発現が特徴です^6,7。トラスツズマブやラパチニブなどのHER2標的治療法は患者の予後を著しく改善しましたが、これらの薬剤に対する一次耐性および獲得耐性が頻繁に現れ、腫瘍の再発や疾患進行を引き起こします^8,9。したがって、HER2治療耐性を駆動する分子メカニズムの解明は、臨床腫瘍学における大きな未充足の課題として残っています。

新たな証拠は、ミトコンドリア機能障害と酸化ストレスが乳がんにおける薬剤耐性の媒介において重要な役割を果たすことを示唆しています。ミトコンドリアはATP産生における標準的な役割を超えて、アポトーシス、酸化還元シグナル伝達、代謝可塑性の重要な調節因子であり、これらはがん細胞が治療圧力に耐えるために利用するプロセスです。特に、耐性HER2⁺ がん細胞は、酸化リン酸化(OXPHOS)、活性酸素種(ROS)緩衝作用の強化、ミトコンドリア生合成の変化への代謝シフトを示します。これらの適応により、細胞はHER2シグナル伝達経路の持続的な阻害にもかかわらず生存シグナルを維持し、アポトーシスを回避することを可能にします。したがって、ミトコンドリア複合体サブユニットやレドックス調節酵素をコードする遺伝子は、耐性克服のためのバイオマーカーおよび治療標的となる可能性があります。

同時に、ミトコンドリア遺伝子や酸化ストレス関連遺伝子における非同義の単一塩基多型(nsSNP)はタンパク質の構造や機能を修飾し、酵素活性、薬物反応、疾患感受性に影響を与えることがある¹⁰。nsSNPsの有害影響の計算予測 in silico。SIFT、PolyPhen-2、CADDなどのツールは、がんの異質性や治療抵抗性に寄与する可能性のある機能的変異を迅速に特定する手段を提供します。したがって、トランスクリプトムおよび突然変異データを統合することで、転写レベルとゲノムレベルの両方における遺伝子調節障害と構造変異の多面的な視点が得られます。

バイオインフォマティクスとシステム生物学の最近の進展により、大規模な発現プロファイリングとネットワーク解析を通じて潜在的なドライバー遺伝子の高スループット同定が可能となりました。Gene Expression Omnibus(GEO)のような公開リポジトリは、実験モデルや患者コホート間の分子変化を捉える貴重なRNAシーケンスデータセットを提供しています。DESeq2、clusterProfiler、STRING–Cytoscapeネットワーク解析などの解析ツールと組み合わせることで、これらのリソースは差異発現遺伝子(DEG)の包括的な特徴付け、経路の濃縮、ハブ遺伝子発見を可能にします。重要なのは、ミトコンドリア酸化ストレス遺伝子シグネチャーをDEGsと統合することで、HER2標的治療耐性の新たな分子メカニズムを明らかにし、治療介入のための候補バイオマーカーを特定することができる点です。

HER3駆動の抵抗軸は、HER2阻害後の主要な補償経路として近年注目を集めています。HER3の活性化は下流のPI3K/AKTシグナル伝達を回復させ、細胞生存と薬剤耐性を促進します(図1)。ERKシグナル伝達の負の調節因子であるDUSP6(Dual Specificity Phosphatase 6)が、この適応応答の調節に関与しているとされています。DUSP6の阻害はERKシグナルを再活性化し、HER3介在耐性を打ち消す可能性がありますが、ミトコンドリアの酸化ストレスや代謝適応との相互作用は十分に解明されていません。したがって、DUSP6阻害および慢性ラパチニブ曝露下でのHER2⁺ 細胞株(BT474およびMDA-MB-453)の比較トランスクリプトミクス解析は、薬物耐性の分子決定因子を解明するのに理想的なモデルを提供します。

図1。ミトコンドリア機能障害、酸化ストレス、乳がん進行を結びつける分子的風景の概略的表現。これらの統合された分子メカニズムは、乳がんにおけるミトコンドリア酸化ストレス媒介がんの基盤となっています。特にDUFS3、UQCRC1、COX4I1、SDHA、ATP5POに関与するミトコンドリア電子伝達連鎖複合体の調節不全は、過剰な活性酸素種(ROS)の生成を引き起こし、酸化DNA損傷、脂質過酸化、ミトコンドリア膜電位の低下を引き起こします。これらの酸化的摂動はPI3K/AKT、MAPK、NF-ΚBなどのがん性シグナル伝達経路を活性化し、p53やBAXなどのアポトーシス調節因子を抑制することで腫瘍細胞の生存、増殖、免疫回避を促進します。図はまた、ミトコンドリア酸化ストレスががん代謝および腫瘍微小環境に与える二重の影響を強調し、HER2+乳がん状態における治療抵抗性と免疫調節への寄与を強調しています。この統合モデルは、ミトコンドリアのドライバー遺伝子や潜在的な治療標的を特定することを目的とした、その後のトランスクリプトミクスおよびSNPベースの解析の機構的基盤を形成します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

本研究は、HER2⁺ 乳がんにおけるハブ遺伝子、機能的nsSNP、およびミトコンドリア酸化ストレスに関連する潜在的な薬物標的を体系的に同定することを目的としています。GSE231524およびGSE231525からのトランスクリプトミクスデータを、厳選されたミトコンドリアおよび酸化ストレス関連遺伝子セットを統合することで、本研究は治療抵抗性に寄与するミトコンドリア酸化ストレス関連差異発現遺伝子(MOS-DEGs)を定義することを目的としました。下流解析には、遺伝子オントロジー(GO)およびKEGG経路の濃縮、タンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク構築、ハブ遺伝子優先順位付け、Kaplan–Meier免疫療法データベースを用いた生存相関解析が含まれていました。さらに、nsSNP変異や構造的影響の可能性について、主要な遺伝子をさらに調査し、変異駆動の機能的影響を明らかにしました。

トランスクリプトミックプロファイリング、ネットワーク生物学、 そしてサイコ 変異解析を組み合わせることで、本研究はHER2⁺ 乳がんにおける潜在的なミトコンドリアバイオマーカーおよび治療標的を発見するための統合的な枠組みを提供します。酸化的リン酸化連結ハブ遺伝子およびその機能的SNPの同定は、HER2標的薬剤耐性を克服し患者転帰を改善するための精密治療戦略の開発への道を開く可能性があります。

Protocol

データ検索と前処理

本研究は公開されているトランスクリプトムおよび遺伝データを用いて実施されました。人間や動物の被験者は直接関与していません。HER2⁺乳がん治療耐性に関連するトランスクリプトミックデータセットは、NCBI遺伝子発現オムニバス(GEO)データベースから取得されました(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)¹¹。GSE231524およびGSE231525の2つのRNA-seqデータセットが、HER2+乳がん細胞株(BT474およびMDA-MB-453)におけるHER3駆動耐性およびDUSP6阻害に特に焦点を当てていることから選ばれました。これらのデータセットには、ラパチニブ(1μM)曝露およびDUSP6ノックダウンに由来する親表、薬剤耐性、薬剤耐性表現型が含まれていました。生カウント行列および対応するメタデータファイルは、RStudio(v4.3.2)のGEOquery(v2.70.0)およびBiobase(v2.62.0)パッケージを使ってアクセスされました¹²。メタデータは各データセットごとに2つの主要な対照を定義するために厳選されました。GSE231524は対照群(BT474親代、0日目)と薬剤耐性および薬剤耐性サンプル(9日目〜9か月目)を比較しGSE231525、対照群(スクランブルドsiRNA)とDUSP6ノックダウン(DUSP6-KD)を比較しました。品質管理とデータ正規化はDESeq2(v1.42.0)フレームワークを用いて行われ、分散安定化変換(VST)を用いて異様分散性を低減し、サンプル間の比較可能性を確保しました。データ分布およびクラスタリングパターンは、ggplot2(v3.5.0)およびpheatmap(v1.0.12)を用いて視覚的に評価し、データの均一性を確認し、差異表現解析の前に潜在的な外れ値を特定しました^13,14。

本研究では、細胞株トランスクリプトミクスデータセットから得られた結果と患者由来の臨床データセットから得られた結果との間に明確な区別が維持されました。細胞株データは主に探索的解析に用いられ、差異発現遺伝子の同定や、制御された実験モデルにおける予備的な機構的知見の生成に用いられました。対照的に、患者由来データセットは遺伝子発現パターンの外部検証や臨床的関連性評価、予後評価に用いられました。したがって、細胞株モデルおよび臨床コホートの結果は、過度な一般化を避け、すべての結果に適切な翻訳的文脈を確保するために別々に解釈されます。

差異遺伝子発現解析

対照条件と治療条件間で有意に変容された遺伝子を特定するために差異発現解析が行われました。正規化されたカウントは、DESeq2に統合された調整回帰モデル(ARM)を用いて処理され、log₂フォールド変化と統計的有意性を正確に推定しました。設計式は~条件として定義され、対照群と処理群を表しました。調整p値(FDR)が0.05<、絶対log₂フォールド変化≥1の遺伝子は有意に発現に差があると考えられました。効果サイズ推定の堅牢性を高めるために、apeglm法を用いてLog₂フォールド変化縮小を実施しました。分析結果はEnhancedVolcano (v1.22.0)¹⁵ およびggplot2¹⁶を用いて可視化され、発現規模と統計的信頼度の関係を示す火山プロットおよびMAプロットが生成されました。分散推定もDESeq2内で評価され、生物学的複製の正確な分散モデリングと一貫した正規化を確保しました¹⁷。

ミトコンドリア酸化ストレス関連差異発現遺伝子(MOS-DEGs)の検索および同定

エネルギー代謝、酸化ストレス、薬剤耐性の関連を調査するため、Human MitoCarta3.0¹⁸ (https://personal.broadinstitute.org/scalvo/MitoCarta3.0/human.mitocarta3.0.html)、Gene Ontology(GO:0006979、酸化ストレスへの応答)(http://geneontology.org/)、京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)酸化リン酸化経路など複数のデータベースからミトコンドリアおよび酸化ストレス関連遺伝子の包括的なリストが作成されました(https://www.genome.jp/kegg/ 年)、およびヒト酸化ストレス遺伝子データベース(HOSGDB)(http://hosgdb.com/ 年)。回収されたすべての遺伝子は、orgを用いてHGNC承認の遺伝子シンボルに標準化されました。Hs.eg.db(v3.18.0)およびAnnotationDbi(v1.64.0)は、重複したエントリー、擬遺伝子、非コードRNAは注釈の正確性を確保するために削除されました。その結果生まれた厳選されたミトコンドリア酸化ストレス遺伝子パネル(MOS遺伝子)は、両トランスクリプトミックデータセットから同定された差異発現遺伝子との統合の参考セットとして用いられました。

キュレーションされたMOS遺伝子リストと、GSE231524およびGSE231525から得られたDEGの交差は、rでdplyr(v1.1.3)¹⁹ およびベースのRのintersect()関数を用いて実行されました。この統合的アプローチにより、ミトコンドリア代謝、酸化還元調節、酸化ストレス適応に機能的に関連した遺伝子を表すMOS-DEGsの同定が可能となりました。データセット間の重複は、^{実験モデル間}で共有および一意遺伝子を示すためにRのVennDiagram(v1.7.3)パッケージを用いて可視化されました。洗練されたMOS-DEGのリストは下流解析に用いられ、HER2標的治療耐性の転写および代謝再プログラミングのメカニズムに関する洞察を提供しました。

MOS-DEGの発現プロファイリングと可視化

同定されたMOS-DEGsの発現プロファイリングは、RStudioのComplexHeatmap(v2.18.0)²¹ およびpheatmap(v1.0.12)パッケージを用いて行われ、親、薬剤耐性、耐性疾患における全体的な発現パターンを可視化しました。正規化されたカウントデータはzスコアスケーリングを用いて変換され、サンプル間で遺伝子発現マトリックスを標準化しました。クラスタリングはユークリッド距離法および完全連鎖法を用いて共発現パターンの検出と条件特異的な転写プロファイルの識別を行いました。状態間の明確な視覚的差異を確保するために、ggplot2を用いてヒートマップとクラスタリングプロットを作成しました。この可視化アプローチにより、ミトコンドリア活性、酸化ストレス調節、薬剤耐性状態下での代謝再プログラミングに関連する遺伝子群の同定が可能となりました。

機能的豊富化と経路注釈

同定されたMOS-DEGの生物学的意義および調節機構を探るため、遺伝子オントロジー(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)の濃縮解析がR Studio(バージョン4.3.1)を用いて実施されました。解析は、複数のBioconductorパッケージを用いて再現可能な計算と可視化を行うtidyverse環境で実施されました。遺伝子注釈と識別子マッピングは組織を用いて行われました。Hs.eg.db ホ モ・サピエンスの リファレンスゲノム(GRCh38)に基づくデータベース(https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/)。GO濃縮解析はclusterProfilerパッケージ(バージョン4.8.1、https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/)を用いて行われ、遺伝子を生物学的プロセス(BP)、細胞成分(CC)、分子機能(MF)の3つの主要なオントロジーに分類しています。enrichGO²² 関数は、パラメータをp 値 <0.05に設定し、 p値を調整した 状態で使用されました。(FDR)<0.05で、ベンジャミニ–ホッホバーグ補正法を適用しました。バープロット、ドットプロット、コード図などの可視化は、enrichplot(https://bioconductor.org/packages/enrichplot/)、ggplot2¹³ (https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/)、GOplot(https://cran.r-project.org/web/packages/GOplot/)を用いて生成されました。これらのツールは、強化されたGO用語とその遺伝子関連を構造化した視点を提供しました。

KEGG経路の濃縮はclusterProfilerパッケージ内のenrichKEGG()関数を用いて行われ、人間のKEGGデータベース(https://www.genome.jp/kegg/)を参照しています。KEGGRESTパッケージ(https://bioconductor.org/packages/KEGGREST/)は経路データの検索と注釈に使用されました。調整済み p値 (q値)<0.05の経路は有意とみなされました。可視化と経路マッピングはpathview(https://bioconductor.org/packages/pathview/)、ggplot2、enrichplotを用いて行われ、ネットワーク表現^にはigraphとggraphが用いられました。すべての濃縮解析および可視化はR Studio(v4.3.1)で再現可能なコードと標準化されたバイオコンダクターワークフローを用いて実装され、MOS-DEGに関連する濃縮機能カテゴリーおよび生物学的経路の信頼性の高い同定が保証されました。

乳がんにおける予測バイオマーカーのROCベースの検証

MOS-DEGsの臨床的予測力を検証するため、ROCplotterオンラインツール(https://www.rocplot.org/)を用いて受信者の動作特性(ROC)曲線解析を実施しました²⁴。ROCplotterは、化学療法、ホルモン療法、抗HER2薬を含む3,104人の乳がん患者の遺伝子発現データと臨床注釈付き治療反応データセットを統合した統合ウェブベースのプラットフォームです。

分析は「病理的完全反応」をアウトカム変数、「任意の化学療法(いかなる化学療法)」を治療カテゴリーとして用いて行われました。Affymetrixマイクロアレイデータセットから得られた遺伝子発現値は、プラットフォーム内の臨床注釈に基づき、自動的にレスポンダーグループと非レスポンダーグループに階層化されました。

受講者操作特性(ROC)曲線(AUC)、マン・ホイットニーU検定、フォールド変化検定、カイ二乗検定を用いて、各遺伝子が応答者と非応答者を区別する能力を評価しました。判別性能を評価する主要な指標として、曲線下面積(AUC)が用いられました。AUC値が0.55を超え、ROCのp値が0.05<有意とみなされ、トランスクリプトミックバイオマーカーに典型的な中程度の予測性能を示し、分析的厳密性を維持するために偽発見率(FDR)補正を適用しました。

選ばれたすべてのMOS-DEGは対応するAffymetrixプローブIDで照会されました。各遺伝子の識別力は臨床乳がんコホート全体で評価され、発現データは反応者グループと非反応者グループに階層化されました。ROC曲線、ボックスプロット、および関連する統計出力はROCplotterプラットフォームによって直接生成され、下流の可視化および比較のためにエクスポートされました。この解析は、ミトコンドリア酸化ストレスに関与する酸化還元および代謝調節因子の予測価値を定量化しました。臨床サンプル間で一貫した予測有意性を示す遺伝子は、最終的な予測パネルに含めるために保持されました。

腫瘍、正常、転移組織における差異発現解析(TNMplot解析)

主要なMOS-DEGsの発現パターンは、TNMplotウェブツールv2 (https://tnmplot.com/analysis/)²⁵を用いて正常、腫瘍、転移性乳腺組織にわたって解析されました。RNA-Seq(TCGA + GTEx + MET500)および遺伝子チップデータセットの両方を検証し、クロスプラットフォーム検証を確実にしました。「多重遺伝子解析」モジュールは乳浸潤性がんで選択された^{組織タイプ26}として使用されました。発現値はlog₂形質転換され、腫瘍群と正常群(TvsN)、転移性対腫瘍群(MvsT)、転移性群と正常群(MvsN)で比較されました。TNMplotはMann–Whitney U検定を用いて、統計的有意性を評価するためにフォールド変化(FC)とp値を自動で計算しました。発現分布はTNMplotインターフェースから直接生成されたボックスプロットと密度プロットとして可視化され、緑、赤、灰色はそれぞれ正常組織、腫瘍組織、転移組織を表しました。すべての図は高解像度でエクスポートされ、結果セクションに統合されました。この二重プラットフォーム解析により、乳がん進行に関連する主要なミトコンドリア酸化還元代謝調節因子の強健な同定と検証が可能^{となりました。}

カプラン・マイヤープロッターを用いた生存および予後解析

乳がんにおけるMOS-DEGの予後的関連性を評価するため、Kaplan–Meier Plotterオンラインツール(https://kmplot.com/analysis/)²⁸を用いて生存分析が実施されました。このデータベースは、複数のGEO、EGA、TCGAデータセットから得られた4,900人以上の乳がん患者の遺伝子発現および生存データを統合しています。解析は、優先遺伝子に対応する個々のAffymetrixプローブIDを用いて再発なし生存率(RFS)を用い、225609_at(GSR)、201761_at(MTHFD2)、201619_at(PRDX3/AOP1)、201128_s_at(ACLY)を用いて実施されました。患者は中央値発現カットオフに基づいて高発現群と低発現群に分けられ、生存確率はKaplan–Meier法を用いて推定されました。ログランク検定は生存曲線間の統計的有意性を評価するために用いられ、95%信頼区間(CI)を含むハザード比(HR)がツールによって自動的に算出されました。すべての解析はRFSエンドポイントを用いて行われ、ホルモン受容体やHER2の状態(ER、PR、HER2=すべて)に基づく制限はありませんでした。冗長なサンプルは除去され、統計的堅牢性を確保するために比例的なハザード仮定が検証されました。品質管理フィルターではバイアスされたマイクロアレイは除外されました。KMプロッターのデフォルト設定に従い、複数回のテストに対して手動プローブ選択やp値補正は適用されませんでした。統計的有意な差はp.<0.05と定義されました。生存プロットを可視化し、高解像度でダウンロードし、各候補MOS遺伝子^29,30の高発現体と低発現体の結果を比較しました。

本解析は、HER2⁺ 乳がんサンプルのみを用いて、差異発現遺伝子(DEG)およびハブ遺伝子の同定を目的としたものである。その後、HER2の状態(ER、PR、HER2=すべて)に制限なく生存分析を行い、同定された遺伝子のより広範な予後関連性と一般化可能性を評価しました。このアプローチは、研究の焦点を再定義するのではなく、二次的な検証ステップとして用いられました。したがって、同定されたハブ遺伝子の予後的影響は慎重に解釈され、主要な結論はHER2⁺ 乳がんに特有のままです。

MTHFD2-201(ENST00000394053.7)およびPRDX3-201(ENST00000298510.4)の標準転写配列は、Ensembl Genome Browser (https://www.ensembl.org)^31,32から取得されました。変異株の注釈と分類はEnsembl Variant Effect Predictor(https://www.ensembl.org/vep)を用いて行われ、各特定変異体に対して詳細なゲノム文脈、コドン変化、アミノ酸置換を提供しました。下流解析のために選ばれたのはミスセンス変異(非同義SNP)のみでした。

病原性予測と変異の優先順位付け

各nsSNPの機能的影響は、計算予測ツールを組み合わせて評価されました。SIFT(https://sift.bii.a-star.edu.sg)を用いてアミノ酸保存の評価を行い、スコア0.05の変異株を有害な³³≤分類しました。PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)は置換の構造的および進化的影響を推定し、スコア≥0.85は被害の可能性を示しました。³⁴。CADD(https://cadd.gs.washington.edu)は複数の注釈を統合した複合有害性スコアを提供し、≥20は高い病原性ポテンシャル³⁵を示しました。MetaLR³⁶、Mutation Assessor、REVELからの補完的な指標がVEPインターフェースから統合され、予測信頼性の向上が図られました³⁷。MetaLR ≥ 0.70、Mutation Assessor ≥ 3.5、REVEL ≥ 0.75 の閾値を満たす変異株が、病原性の可能性が高いと優先されました。

構造的および機構的影響予測

アミノ酸置換が構造の完全性や生化学的機能にどのように影響するかを評価するため、上位のnsSNPはMutPred2(http://mutpred.mutdb.org)³⁸ およびDynaMut(http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut)³⁹を用いてさらに解析されました。MutPred2は、触媒活性の変化、金属結合残基の増減、溶媒アクセスの変化、アロステリック調節を含む機能障害の確率を推定し、0.80≥高度に病原性が高いと分類されました。DynaMutは野生型タンパク質と変異タンパク質間のギブス自由エネルギー変化(ΔΔG)を計算し、安定性変化の方向と大きさを評価し、原子変位や水素結合の再配置の可視化を生成しました。

二次構造および3D構造モデリングおよび溶媒アクセス性プロファイリング

MTHFD2およびPRDX3の実験的に分離された結晶構造は、タンパク質データバンク(PDB)から取得され、PyMOL V:3.1 (https://pymol.org)⁴⁰ で処理され、有害残基の空間的分布を可視化しました。変異体モデルは、対応するアミノ酸置換を導入し、その後構造の精緻化とエネルギー最小化を行って作成されました。比較3次元検査では、二次元素の変化、原子間接触の変化、nsSNPが触媒および共因子結合ドメインに空間的に近接していることが明らかになり、酸化還元および代謝機能の潜在的な障害が明らかになりました。

二次構造および溶媒曝露解析はPSIPRED V: 3.2 (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)^41,42およびNetSurfP 3.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetSurfP-2.0)⁴³を用いて実施されました。これらのツールは、αヘリックス、β鎖、コイル、無秩序領域、そして相対溶媒アクセス性(RSA)スコアを予測しました。中程度から高いRSA値と構造順序を示す残基をマッピングし、溶媒曝露および機能的に重要な位置を特定しました。影響を受けた部位は2Dトポロジー図で可視化され、有害な変異が剛性触媒コアで起こるのか柔軟なループ領域で起こるのかを判定し、タンパク質の折りたたみ動態や酵素効率に対する影響を予測しました。

データベースの相互検証、関数統合、安定性検証

優先順位付けされた各nsSNPは、dbSNP、1000ゲノム、ExAC、gnomADなどの集団レベルのゲノムデータベースと照合し、変異頻度、全体的な対立遺伝子分布、過去に報告された臨床関連を確認しました。進化保存、構造モデリング、機械学習に基づく機能予測の統合により、MTHFD2およびPRDX3における高信頼度の有害変異の同定が可能となりました。これらの高影響変異はその後、機能ドメインにマッピングされ、ミトコンドリア酸化ストレスの不均衡、代謝シグナル伝達の変化、乳がんにおける治療抵抗性における潜在的な役割を明らかにしました。各有害置換の熱力学的影響をさらに確認するために、iMutant 3.0 (https://folding.biofold.org/i-mutant/i-mutant3.0.html)⁴⁴ を用いて、配列および構造データを用いて変異がタンパク質安定性に与える影響を予測しました。解析では野生型タンパク質と変異型タンパク質間の自由エネルギー変化を表すΔΔG(kcal/mol)値を算出しました。ΔΔG値が陰性である変異は不安定化変異として分類され、タンパク質の安定性低下と展開確率の増加を示しました。iMutant予測とDynaMutおよびMutPred2の結果の統合により、酸化還元機能、触媒完全性、タンパク質全体の立体構造安定性に影響を与える可能性のある構造的に重要な残基の同定のクロスバリデーションが可能となりました。

統合的機能的解釈と治療的関連性

特定されたすべての有害なnsSNPは、dbSNP、gnomAD、ExACの母集団データベースとのクロスリファレンスにより検証され、マイナーアレル頻度およびがん表現型との既に報告された関連性を検証しました。進化的保存、構造モデリング、安定性データの統合的解釈により、高影響の変異rs1471336772(MTHFD2)およびrs747786383(PRDX3)がタンパク質の立体構造および触媒効率に最も強い悪影響を及ぼすことが示されました。計算結果は、MTHFD2の変異がNADPH依存性のレドックス代謝を不安定化させる一方で、PRDX3の変異がペルオキシダーゼ介在の酸化ストレス防御を損ない、ミトコンドリア機能障害や腫瘍攻撃性に寄与していることを示唆しています。このnsSNPベースの構造および機能解析は、将来の治療スクリーニングおよび変異検証のための計算的基盤を提供し、MTHFD2およびPRDX3が酸化還元標的乳がん治療の精密バイオマーカーであることを強調しています。分析戦略の明確さを高め、包括的概要を提供するために、研究の主要なステップをまとめた概略的なワークフローを 図2に示しています。このワークフローは、差分遺伝子発現解析、ミトコンドリア遺伝子フィルタリング、タンパク質間相互作用ネットワーク構築、ROC解析を用いた臨床検証、nsSNPに基づく構造特性評価を統合しています。この段階的な枠組みは、トランスクリプトミックデータ処理からバイオマーカー同定および機能的解釈への論理的な進展を強調しています。

図2。HER2⁺ 乳がんにおけるミトコンドリア酸化ストレス関連バイオマーカーの同定および検証のための統合的多段階ワークフロー。この概 説は、研究で用いられた分析パイプラインをまとめたものです。まず、RNA-seqデータセット(GSE231524およびGSE231525)に対して差異遺伝子発現(DEG)解析を行い、有意に変異した遺伝子を特定しました。これらのDEGは、精選されたミトコンドリア酸化ストレス関連遺伝子と交差させ、MOS-DEGを得ました。次に、STRINGとCytoscapeを用いてタンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク解析を行い、ハブ遺伝子と機能モジュールを特定しました。その後、ROCプロッタープラットフォームを用いて、臨床コホートにおける選択遺伝子の予測性能を評価するために、受講者動作特性(ROC)曲線解析を適用しました。最後に、非同義SNP(nsSNP)解析と構造モデリングを行い、優先遺伝子(MTHFD2およびPRDX3)における主要変異の機能的および構造的影響を評価しました。この統合的ワークフローは、トランスクリプトミクス、ネットワーク解析、臨床解析、構造解析を結びつけ、潜在的なバイオマーカーや治療標的を特定します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

Results

差異遺伝子発現解析

HER2⁺ 乳がんの進行および治療抵抗性に関連する転写変異を調査するため、2つの独立したRNA-seqデータセット(GSE231524およびGSE231525)を用いて差異発現プロファイリングを実施しました。最初のデータセット(GSE231524年)では、合計19,727個の遺伝子が最初に定量化されました。正規化、フィルタリング、調整回帰モデル(ARM)の適用を経て、6,604遺伝子が有意に発現したと保持されました(補足表S1)。遺伝子記号の標準化、重複除去、注釈の精緻化を経て、6,300のユニークな遺伝子が後続解析のために最終決定されました。火山プロット、MAプロット、分散推定値(図3A-C)は、有意に上位・下位化した遺伝子の分布を明確に示しています(調整p < 0.05、|log₂FC| ≥1)。分散推定値は平均正規化カウント間で適切にフィットした分散パターンを示し、DESeq2

Discussion

ミトコンドリア酸化ストレスは腫瘍適応の決定的な特徴であり、細胞の生存、代謝可塑性、治療抵抗性を支配します。本研究では、HER2⁺ 乳がんにおけるミトコンドリア酸化ストレス関連の差異発現遺伝子(MOS-DEGs)を、トランスクリプトミックデータ、機能豊化、臨床検証、およびシ リコ 変異および構造解析を統合して体系的に探求しました。差異発現と突然変異プロファイリングの統合により、レドックス代謝調節がゲノム不安定性とどのように交差するかの多面的な理解が得られました。同定されたMOS-DEGsの中で、MTHFD2とPRDX3は、酸化ストレス適応、代謝調節、治療応答において異なるが相補的な機能を示す重要なミトコンドリア決定因子として浮上しました⁴⁸。これらの遺伝子内に複数の有害な非同義SNP(nsSNP)が同定され、単一アミノ酸置換が乳がん細胞における酵素活性、タンパク質折りたたみ、ミトコンドリアのレジリエンスを調節できることがさらに明らかになりました。本研究で提示された結果は統合的計算解析お...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnnotationDbi	Bioconductor	v1.64.0	HGNC遺伝子シンボルの標準化と注釈に使用されるRアノテーションパッケージ。
apeglm	Bioconductor	DESeq2のメソッド	差異発現分析におけるlog2倍数変化の縮小に使用されるメソッド。
Biobase	Bioconductor	v2.62.0	GEO由来の発現データとメタデータオブジェクトにアクセスし、管理するために使用されるRパッケージ。
CADD	University of Washington / Kircher Lab	ウェブツール	nsSNPの病原性予測に使用されるCombined Annotation Dependent Depletionスコア。
clusterProfiler	Bioconductor	v4.8.1	GOおよびKEGGのエンリッチメント分析に使用されるRパッケージ。
ComplexHeatmap	Bioconductor	v2.18.0	ヒートマップの生成と発現のクラスタリングに使用されるRパッケージ。
Cytoscape	Cytoscape Consortium	ソフトウェア	STRING由来のPPIネットワークとCytoHubbaの優先順位付けに使用されるネットワーク可視化プラットフォーム。
dbSNP	NCBI	データベース	優先されたnsSNPのクロスバリデーションに使用される集団変異データベース。
DESeq2	Bioconductor	v1.42.0	正規化、分散モデリング、および差異発現分析に使用されるRパッケージ。
dplyr	CRAN / tidyverse	v1.1.3	データ操作と遺伝子セットの交差に使用されるRパッケージ。
DynaMut	University of Melbourne / BioSig	ウェブサーバー	タンパク質の変異に関連する安定性と柔軟性の変化を推定するために使用されるツール。
EnhancedVolcano	Bioconductor	v1.22.0	差異発現結果を火山図として可視化するために使用されるRパッケージ。
Ensembl Genome Browser	EMBL-EBI / Ensembl	データベース	MTHFD2およびPRDX3の正規転写産物配列のソース。
Ensembl Variant Effect Predictor (VEP)	EMBL-EBI / Ensembl	ウェブツール	ミスセンス変異の注釈と予測スコアの統合に使用されるツール。
ExAC	Broad Institute	データベース	nsSNPのクロスバリデーションに使用される集団レベルの外染色体データベース。
Gene Expression Omnibus (GEO)	NCBI	データベース	HER2陽性乳がん分析のための転写データセットを取得するために使用されるリポジトリ。
Gene Ontology	Gene Ontology Consortium	GO:0006979	酸化ストレス関連遺伝子を取得し、エンリッチメント分析に使用するオントロジーリソース。
GEOquery	Bioconductor	v2.70.0	GEOカウントマトリクスとメタデータにアクセスするために使用されるRパッケージ。
ggplot2	CRAN / tidyverse	v3.5.0	データ可視化、クラスタリングプロット、グラフィカル出力に使用されるRパッケージ。
ggraph	CRAN	Rパッケージ	エンリッチメントと経路表現中のグラフとネットワーク可視化に使用されるRパッケージ。
gnomAD	Broad Institute	データベース	優先されたnsSNPの頻度と分布を確認するために使用される集団変異データベース。
GOplot	CRAN	Rパッケージ	コードとサマリープロットを含むGOエンリッチメントの可視化に使用されるRパッケージ。
GSE231524	NCBI GEO	アクセス番号	親、薬剤耐性、およびBT474耐性表現型の分析に使用されるRNA-seqデータセット。
GSE231525	NCBI GEO	アクセス番号	HER2陽性乳がん細胞におけるDUSP6ノックダウンの分析に使用されるRNA-seqデータセット。
Human MitoCarta3.0	Broad Institute	データベース	ミトコンドリア遺伝子セットを定義するために使用されるキュレーションされたミトコンドリア遺伝子リソース。
Human Oxidative Stress Gene Database (HOSGDB)	HOSGDB	データベース	酸化ストレス関連遺伝子を取得するために使用されるデータベース。
igraph	CRAN	Rパッケージ	ネットワーク表現と経路可視化に使用されるRパッケージ。
iMutant 3.0	University of Bologna / Biofold	ウェブサーバー	タンパク質の安定性に対する変異の影響を予測するために使用されるツール。
Kaplan–Meier Plotter	KMplot	ウェブツール	乳がんコホートにおける無再発生生存分析に使用されるオンラインプラットフォーム。
KEGG	Kyoto University	データベース	酸化的リン酸化および経路エンリッチメント分析に使用される経路データベース。
KEGGREST	Bioconductor	Rパッケージ	KEGG経路情報を取得し、注釈するために使用されるパッケージ。
Lapatinib	原稿には特定されていない	1 μMの処理条件	薬剤耐性/耐性表現型を導出するためにソース実験データセットで使用されるHER2標的阻害剤。
MetaLR	Ensembl VEP経由で統合	スコア	変異の優先順位付けに使用される計算病原性指標。
MutPred2	MutPred	ウェブサーバー	アミノ酸置換の機能的結果を予測するために使用されるツール。
NetSurfP 3.0	Technical University of Denmark	ウェブサーバー	二次構造と溶媒アクセス可能性の予測に使用されるツール。
org.Hs.eg.db	Bioconductor	v3.18.0	遺伝子識別子のマッピングに使用されるヒトゲノムアノテーションパッケージ。
pathview	Bioconductor	Rパッケージ	KEGG経路にエンリッチメント遺伝子をマッピングするために使用されるパッケージ。
pheatmap	CRAN	v1.0.12	ヒートマッププロットとクラスタリング可視化に使用されるRパッケージ。
PolyPhen-2	Harvard / Brigham and Women's Hospital	ウェブツール	アミノ酸置換の構造/機能的影響を推定するために使用される計算予測子。
Protein Data Bank (PDB)	RCSB PDB	データベース	MTHFD2およびPRDX3の実験的に解決されたタンパク質構造のソース。
PSIPRED	University College London	v3.2	2Dトポロジー分析に使用されるタンパク質二次構造予測サーバー。
PyMOL	Schrödinger / PyMOL	v3.1	タンパク質構造と変異部位を視覚化するために使用される分子グラフィックスソフトウェア。
REVEL	Ensembl VEP経由で統合	スコア	ミスセンス変異の優先順位付けに使用されるアンサンブル病原性スコア。
ROCplotter	ROCplot.org	ウェブツール	乳がん反応コホートにおける遺伝子発現のROCベース検証に使用されるオンラインプラットフォーム。
RStudio	Posit	v4.3.1/v4.3.2環境	転写、エンリッチメント、および可視化ワークフローに使用される統計コンピューティング環境。
SIFT	A*STAR	ウェブツール	アミノ酸置換を耐性または有害として