卵巣微小環境の探査:マウス卵巣体細胞の単離、2次元培養、オルガノイド培養の方法

サマリー

私たちは、卵巣の間質豊富な部分からマウス卵巣体細胞を単離する方法と、足場を使わない方法でマウス卵巣体細胞オルガノイドを生成する方法を述べます。

要約

卵巣は卵胞内および周囲の間質の両組織に多様な体細胞群から成り、卵巣機能の支えや高品質な配偶子の生成に不可欠です。マウス卵巣から体細胞を分離する方法、内皮細胞、上皮細胞、ステロイドゲン細胞、ストロマル細胞、免疫細胞などを報告しています。これらの一次卵巣体細胞が従来の2次元培養システムでプレート化・培養されると、卵巣に通常見られる細胞の異質性、組織、細胞間および細胞-マトリックス相互作用は失われます。したがって、スキャフォールドフリーアプローチを用いてマウスの卵巣体細胞オルガノイドを生成する方法も記述します。これらのオルガノイドは自己組織化し、多様な細胞群を維持し、細胞外マトリックスや分泌因子(サイトカインを含む)を産生します。オルガノイドは共培養実験に利用でき、少なくとも3週間培養内で高い生存率を保つことができます。全体として、これらのモデルは体細胞の観点から卵巣の生理学および病理の検証を可能にします。

概要

卵母細胞、すなわち女性配偶子は次世代の発生に不可欠ですが、卵巣内の体細胞集団は配偶子の発生、ステロイドホルモンの産生、卵巣の恒常性において重要な役割を果たします。卵母細胞は体細胞顆粒やテカ細胞に囲まれ、卵胞として知られる卵巣の機能単位を形成します。グラヌローサ細胞は卵母細胞と物理的に連結されており、減数分裂停止の調節に加え、代謝および栄養の支援も提供します^1,2。さらに、ゴナドトロピンに反応して、顆粒物やテカ細胞はエストロゲン、プロゲステロン、アンドロゲンなどのステロイドホルモンを産生し、これらは生殖器系を超えて心血管系、筋骨格系、神経系に影響を与え、女性^{全体の健康にも}影響を及ぼします。卵巣卵胞は、血管、免疫細胞、複数の間質線維芽細胞および間葉細胞の集団、そして高度に秩序化された細胞外マトリックス(ECM^)からなる異質な卵巣間質内に発達します4。この気質微小環境は、卵胞の成長、排卵、黄体形成に影響を与える物理的・化学的手がかりを提供します^。

生子や卵胞をvitroで単離・培養するためのいくつかの方法が存在し、これらの方法により卵形成と卵胞形成5の理解が進み^ました。しかし、卵巣の体細胞区画は比較的研究が少なく、その一因として、堅牢なin vitroモデルが存在しないことが一因です。現在の卵巣体細胞区画のモデルは主に線維芽細胞、卵巣表面上皮細胞、内皮細胞、免疫細胞、または肉芽細胞6,7,8,9,10,11などの単一の細胞タイプに限定されています。広義に定義された一次卵巣体細胞の2次元培養は、時間とともにマクロファージ集団を有利にし、細胞の異質性を失います¹²。さらに、従来の二次元(2D)単一層培養では、卵巣に存在する多様な細胞間および細胞間マトリックス間の相互作用が認められません。卵巣組織のエクスプラントは、在来組織の細胞的および構造的複雑さを保持しますが、卵巣内のどこから得られたかによって組成は異なります^13,14。

オルガノイドは、三次元(3D)、多細胞、ミニチュア化された臓器や組織のバージョンであり、生体内での組織構造と機能を再現します(^15,16)。オルガノイドは、正常または病変組織から単離された幹細胞や一次細胞から生成されることがあります¹⁵。女性の生殖器系の文脈では、子宮内膜、卵管、子宮頸部、胎盤をモデル化するためにオルガノイドが生成^{されています。}しかし、卵巣に関しては、最近までオルガノイドモデルは卵巣表面上皮細胞やがん細胞のような単一の細胞タイプに限定されていたか、卵巣間質ではなく濾胞構造に似た誘導多能性幹細胞から作られてきた^17,18。最近の研究では、マウス、アカクザル、ヒト卵巣組織から分離された体細胞の異質な集団を用いてオルガノイドを生成・特徴付けています19,20,21。これらのオルガノイドモデルは、卵巣老化の細胞メカニズムやフタル酸エステル曝露がECM組成に与える影響の調査を可能にしました^19,21。

卵胞および間質の体細胞が卵巣機能に極めて重要であることを踏まえ、私たちは、ストロマ豊富なマウス卵巣から体細胞を分離し、従来の単層培養またはオルガノイドモデルを用いてin vitro で培養する方法を記述します。足場フリーのアガロースマイクロモールドを用いると、卵巣体細胞は1〜3日以内にオルガノイドを形成します。オルガノイドは線維芽細胞、マクロファージ、ステロイドゲン細胞などの主要な卵巣細胞群を保存し、最大3週間の高い生存率で培養可能です。卵巣の体細胞オルガノイドは、トランスクリプトムおよび組織学的評価、条件付け培地の解析、他の細胞種との共培養、および化合物スクリーニング手法に適しています。総じて、これらのオルガノイドは卵巣体細胞区画の in vitro での問い合わせと調節の堅牢なモデルであり、卵巣の発生、加齢、生理学、病理学の研究に応用可能です。

プロトコル

このプロトコルの開発に動物を用いることは、ノースウェスタン大学の動物ケア・利用委員会および国立衛生研究所の実験動物ケア・利用ガイドライン(ノースウェスタン大学動物福祉保証番号:A3283-01)に準拠したものでした。IACUCプロトコルID:IS00013082_IM12)。アガロースマイクロモールド、メディア、サプリメント用のシリコーン鋳造品を含むすべての材料の製造者情報およびカタログ番号は、 材料表に記載されています。プロトコルステップの概要は 図1に示されています。すべてのプロトコル手順は、適切な個人用防護具を使用し、すべての機関のバイオセーフティおよび環境衛生・安全規則を遵守し、特に指定がない限りクラスIIのバイオセーフティキャビネット内で実施されるべきです。

図1:マウス卵巣体細胞単離、卵巣体細胞生成およびその下流応用の概説。 マウスの卵巣は単離され、間質部分が濃縮されます。濃縮された間質部分は酵素的および機械的に消化されます。消化されていない組織は押し出されます。細胞はペレット化され、洗浄され、数えられ、2D培養のためにプレート化されます。オルガノイド生成では、2次元培養を一晩行った後、トリプシンを用いて細胞を採取し、ペレット化、洗浄、カウントを行います。細胞はアガロースマイクロモールドにシードされ、オルガノイド培養に用いられます。オルガノイドは組織学、RNAやタンパク質抽出、コンディショナルド培地分析、治療、薬物スクリーニング、さらには共培養に利用可能です。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

1. 卵巣体細胞の単離および培養用の培地準備

注:卵巣組織の消化および原一次体細胞の分離および培養には4種類の培地が必要です:解離培地(DM;マウス卵巣の解離および穿刺にはステップ2.3–2.4で使用)、酵素培地(EM;ストローマ富むマウス卵巣の酵素的消化に使用)、クエンチング培地(QM;第2.9段階で酵素消化を遅らせるために使用)、 およびプレート培地(PM;ステップ2.11–2.14およびステップ4.6で、一次卵巣体細胞の洗浄、プレート、2次元培養、および2次元培養時のトリプシン不活化に使用される)。すべてのメディアは滅菌されたクラスIIの生物学的安全キャビネットまたはラミナーフローフードで準備されるべきです。以下に挙げる培地レシピは5〜6匹のマウスの卵巣処理に十分ですが、必要に応じてスケール調整する必要があります。すべての培地は最大1週間前から準備し、4°Cで保存できますが、EMの酵素は細胞分離当日に新鮮に加えなければなりません。

1. LeibovitzのL-15培地で、胎児用牛血清(FBS)1%とペニシリン・ストレプトマイシン(PS)0.5%を含むDM(15 mL)を準備します。無菌フィルターを使って培地を滅菌してください。
   注:DMは周囲の空気交換のためにバッファリングされており、周囲組織からの卵巣の微小剥離や間質部分の濃縮に使用されます。
2. 1%のFBSと0.5%のPS(αMEM)を含むEM(10 mL)を準備します。コラーゲンIVを82酵素単位/mLとDNase I 0.2 mg/mL(≥400酵素活性単位/mg)を追加します。酵素を逆に溶解させ、その後滅菌フィルターで滅菌します。
   注:酵素培地は5%_CO2 の空気交換用に重炭酸ナトリウム緩衝されており、卵巣組織片の酵素的消化に使用されます。
3. αMEM培地で10%FBSおよび0.5%PSを含むQM(20 mL)を準備します。無菌フィルターを使って培地を滅菌してください。
   注:QMは5%_CO2 の空気交換用に炭酸水素ナトリウム緩衝されており、酵素分解の冷却に使用されます。
4. RPMI 1640(25 mM HEPESおよび2 mM L-グルタミンを含む)に10% FBSと1% PS を含むPM(30 mL)を準備します。無菌フィルターを使って培地を滅菌してください。
   注:PMは空気交換のために炭酸水素ナトリウム緩衝されており、5%の_CO2 で、一次卵巣体細胞のプレートや2D培養に使用されます。

2. 卵巣組織の消化および一次体細胞の分離

注:マウスの卵巣は酵素的および機械的に分離され、一次体細胞を分離します。5〜6匹のマウスの卵巣は同じ皿で一緒に処理できます。以下の手順は無菌技術を用いて行うべきで、できれば層流フード内の解剖顕微鏡を用いて行うべきです。

1. EM10 mL、QM 20 mL、PM 20 mLを別々の100 mmペトリ皿に加えます。使用前に、組織培養インキュベーター(加湿環境、37°C、_CO25%)で最低1時間均等にしてください。
2. 使用前にDMを37°Cの水浴で温めてください。
3. マウスの卵巣を3 mLのDMを含む35mmのペトリ皿に切り離し、細かい鉗子や顕微ハサミを使って付着した脂肪組織、卵管、卵巣滑液包から卵巣を分離します(図2Ai,ii)。必要に応じて解剖顕微鏡を活用して微細解剖を行いましょう。
4. 剥離した卵巣を2〜3 mLのDMを入れた45mmの時計ガラスに移します。解剖顕微鏡の下で、非利き手と利き手でそれぞれ28Gインスリン針を使い、卵巣の全領域を固定・穿刺し、約10分間刺します。卵巣組織を頻繁に回転させて、すべての部位が破壊されているか確認してください。
   注:卵巣を貫通することで、前卵胞や卵胞複合体、顆粒細胞が胞卵胞から放出され、間質部分が豊かになります(図2Aiii–iv)。
5. 細かい先端の鉗子を使って、間質に富んだマウスの卵巣を平衡EMでペトリ皿へ移動させます(図2Bi)。
6. 培地の温度とpH変化を最小限に抑えるために迅速に作業し、細かいピンセットでストローマに富んだ卵巣を約2〜3 mmの片に引き裂きます(図2Bii)。
7. ペトリ皿を斜めに持って、p1000ピペットで卵巣組織の入ったEMを繰り返しピペットし、1 mL、100×または3分間(早い方)に設定します(図2Biii)。必要なときにペトリ皿を回して、すべてのティッシュピースがピペットで送り込まれているか確認してください。
   注意:組織が大きすぎてp1000チップでピペット化できない場合は、滅菌メスで先端を切って開口部を広げることができます。ボアは組織の大部分(>50%)が入れるように広がり、剪断効果を生み出します。
8. EMおよび卵巣組織片を含むペトリ皿を組織培養インキュベーター(加湿環境、37°C、_CO25%)に移し、合計30分間培養します。その後、皿を取り出してピペッティングを繰り返し(100×または3分間)、30分の培養終了時に再度検査します(図2Biii)。
   注意:最初の15分間の培養後、組織片は十分に消化され、>80%がp1000ピペットの先端を通るまで、開口部を広くするために先端を切る必要がなくなります。消化の総時間とピペッティングの量は、裂けた組織片の開始サイズに依存します。さらに、マウスの年齢や品種、酵素の活性のロットごとの変動、ピペットのボアサイズも組織分解速度に影響を与えます。卵巣組織の断片が約1mmの断片に分解され、目でまだ見える状態になると消化が抑制されるべきです(図2Biv)。過剰消化は細胞の喪失や細胞の生存能力低下を引き起こす可能性があります。
9. 酵素を希釈し、組織の消化を遅らせるために20 mLの前平衡QMを加えます(図2Ci)。
10. 細胞懸濁液を50 mL円錐管の上に置かれた40μmの細胞ストレーナーを通して、未消化の組織片を除去します(図2Cii)。300 × g のフィルター液を室温で5分間遠心分離し、セルをペレット状にします(図2Ciii)。
11. 細胞を洗浄するには、吸引で上澄液を除去し、細胞ペレットを1 mLの予平衡PMに再懸浮させ、細胞懸濁液を1.5 mLのマイクロ遠心分離管に移し、室温で300 × g で5分間遠心分離して再び細胞をペレット化します(図2Civ)。
12. 上清液を除去し、細胞ペレットを1 mLのPMに再懸濁させ、10 μLのアリコットをトリパンブルーで染色して細胞の生存可能性を評価し、ヘモサイトメーターで細胞数を数えます。
    注:この分離プロトコル段階でのマウス株や年齢に応じた原一次卵巣体細胞の予想数については 表1 を参照してください。この段階での細胞生存率は>80%であるはずです。
13. 細胞を組織培養処理容器上で約1.25 ×^{10 5-1.5} × 10⁵/^cm² の密度でプレートします(例:細胞数が約3 × 10⁶の場合は、組織培養処理済み60 mm皿に細胞をプレートし、約1 × 10⁶の場合は、組織培養処理済み6ウェルプレートの1つのウェルにプレートします)。
    1. プレートや皿の総体積に応じて追加のPMを加えます(例:60mm皿の場合はPMを4mL追加、6ウェルプレートのウェルの場合はさらに2mLのPMを追加)。
       注意:上記のプレート密度は、2次元培養後のオルガノイド生成に利用する場合に推奨されます。より長い2D培養では、細胞を低密度でプレートすることが可能です。平衡されていない余分なメッキ媒体は、最大1週間4°Cで保存可能です。PMはオルガノイドの生成と2次元培養中の卵巣体細胞維持の両方に必要です。このプロトコルの段階では、卵巣体細胞を2次元単層培養(ステップ2.14)で維持するか、オルガノイドの生成に利用される(セクション3に進む)。オルガノイド生成前に一晩の2D培養は、40μm細胞ストレーナーを通過した可能性のある初期卵胞から卵母細胞を除去するために必要です。
14. 一晩(最低16時間)プレーティング後、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS;Mg/Caフリー、pH 7.0–7.3)を除去するために、死んだ細胞やゴミを除去します(図3A)。洗浄後に新鮮PMを加え、培養中は隔日で培地を新しいPMに置き換えます(図3B)。
    注:分離後の細胞生存率は高いものの、一晩かけてプレートを施した後、細胞死や組織培養容器への付着困難により、総細胞数の大幅な減少が観察されることが多いです(図3A)。

図2:マウス卵巣体細胞分離の概説。 (A) (i,ii) マウス卵巣剥離および (iii,iv) ストローマ濃縮の代表画像。マウスの卵巣は Aの点線で囲まれています。(B) 機械的および酵素的消化過程における卵巣組織断片の代表的な画像。間質豊富化された卵巣(i)裂裂前後、(iii)ピペッティング中の卵巣組織片、(iv)消化後の卵巣組織片。(C) (i) 消化の冷却、(ii) 細胞懸濁液のろ過、(iii,iv) マウスの一次卵巣体細胞のペレット化の代表画像。 Ciiおよび Ciiiの挿入図には、それぞれ遠心分離後に細胞ストレーナーと細胞ペレットに捕捉された未消化の組織片が示されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:一次卵巣体細胞は2D培養が可能です。 (A) プレート付け後16時間後、PBS洗浄前後に60mm皿にプレートされた一次卵巣体細胞の代表的な光画像。(B) 24ウェルプレートに3日間培養された一次卵巣体細胞の代表的な光画像。スケールバー=400μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

3. オルガノイド生成および培養のためのアガロースマイクロモールドおよび培地の調製

注:卵巣体細胞オルガノイドは、卵巣オルガノイド培地を用いた足場なしアガロースマイクロモールドで生成・培養されます。アガロースマイクロモールドおよび卵巣オルガノイド培地は、滅菌されたクラスII生物学的安全キャビネットまたは層流フードで無菌技術を用いて準備する必要があります。

1. アガロースマイクロモールドの調製
   1. マイクロモールド用のシリコーンキャストとグレーフ鉗子を滅菌パウチとオートクレーブに入れ、乾燥サイクルで滅菌します(ジャケット圧力:20 psi、チャンバー温度:250°F(121.11 °C)、滅菌時間:15分)。
      注:複数のシリコーン鋳型を一度に使用し、より迅速なアガロースマイクロモールド生成に利用できます。
   2. アガロースマイクロモールドの保存のために、24ウェルの組織培養プレートの各ウェルに1%のPSを含むPBSを1mL追加します。
   3. 電子レンジ、熱湯浴、またはホットプレートで加熱して、1.5%(w/v)の滅菌アガロースをPBSに溶かします。
      注:アガロースを50mLの円錐形チューブで電子レンジで温め、水が入った100mLのビーカーに入れて加熱するとよく使えます(図4Ai)。煮沸の制御を可能にするだけでなく、ビーカー内で作られる熱湯はアガロースの再固化を遅らせます。
   4. 液体アガロースを約50°Cまで冷やし、チューブを快適に扱えるようになるまで待ちます。
   5. シリコーンキャストに1.5%アガロースを300〜350 μLゆっくりピペットで注入し、過剰充填や不足充填を避け、気泡を発生させないように注意します(図4Aii)。アガロースが鋳造の上部に平らな層を作るようにし、凹や凸の縁を作っていないことを確認してください(図4Aiii,iv)。アガロースが固化し始める前に、滅菌されたp10ピペットの先端で泡を割ります(図4Bi–iii)。
   6. アガロースをシリコーン鋳型内で室温で2〜3分間固化させます(図4Biv)。
   7. 固まったら、PBS + 1% PSを含む24ウェル組織培養プレートのウェルにシリコーンを逆さまにキャストします。シリコーンを慎重に曲げてアガロースマイクロモールドをプレート内に取り出します(図4Ci)。
      注:24ウェル組織培養プレートにパラフィルムで包まれたPBS +1% PSに浸したアガロースマイクロモールドは、使用の最大1か月前まで4°Cで保存可能です(図4Cii)。アガロースマイクロモールドは使用の少なくとも16時間前に準備すべきであり、マイクロウェルには鋳造直後に空気泡が存在し、PBS+1%PSで浸水することが多いためです(図4Ciii)。しかし、これらの気泡は保管中に消散します(図4Civ)。オルガノイド培養に使用される前に、アガロースマイクロウェル挿入物は顕微鏡で慎重に調べ、鋳造中にマイクロウェルが融合や破損していないか確認する必要があります(図4Di–iv)。欠陥のあるマイクロモールドはオルガノイドの生成および培養には推奨されません。欠陥が約25%を占めるため、過剰なアガロースマイクロモールドの準備が推奨されます
2. 卵巣オルガノイド培地の調製
   1. バイオセーフティキャビネット内で、製造者の指示に従って基底培地にオルガノイド成長培地(マウス)サプリメント1および2、1%のPS(PS)を加えます。準備済みの卵巣オルガノイド培地は使用前に最大2週間、4°Cで保存してください。
      注意:サプリメント1と2は分割して-20°Cで保存可能です。

図4:アガロースマイクロモールドの準備 図表示。(A) (i) 1.5% アガロース製剤、(ii) シリコーン鋳型へのピペット化、(iii) 適切に充填されたシリコーンキャストの代表画像。 Aiiiと Aivの破線は、それぞれアガロースマイクロモールドの平らな底と凸底を示しています。(b) (i,ii) アガロース内に気泡のある充填シリコーン鋳型の代表画像、(iii) アガロース固化前にピペットチップで気泡を割る様子、(iv) シリコーン鋳型内の固化アガロースマイクロモールドの代表画像。(C) (i) シリコーン鋳型から固化したアガロースマイクロモールドの除去、(ii) PBS + 1% PS を含む24ウェルプレートでのアガロースマイクロモールドの保管、(iii) 鋳造直後のマイクロウェル内に存在する気泡、(iv) 16時間の保管後に気泡のない適切に鋳造されたアガロースマイクロモールドの代表画像。(D)(i,ii)結合井戸、(iii)破壊井戸、または(iv)損傷を持つマイクロモールドの代表画像。略称:PBS = リン酸緩衝生理食塩水;PS = ペニシリン・ストレプトマイシン。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

4. オルガノイドの生成と培養

注:2D培養後、2D培養から一次卵巣体細胞を採取し、アガロースマイクロモールドにシードしてオルガノイドを生成します。以下の手順は、滅菌されたクラスIIの生物安全キャビネット内で無菌技術を用いて実施されます。

1. PMとオルガノイド培地を水浴で37°Cまで温め、0.05%トリプシンを室温に温めます。
2. グレーフェ鉗子を使い、マイクロモールドを新しい24孔プレートのウェルに慎重に移します(図5Ai)。
3. アガロースマイクロモールドを含む24ウェルプレートの各ウェルに500μLの卵巣オルガノイド培地を加えます(図5Aii)。マイクロモールドは培地に完全に浸し、インキュベーター(加湿環境、37°C、_CO5%)で少なくとも30分間平衡状態にしてください。
4. 粘着した卵巣体細胞からPMを吸引して除去し、Mg/CaフリーPBSで細胞を洗浄します。
5. 2D培養から細胞を採取するために、0.05%のトリプシン(6ウェルプレートまたは60mm皿用1〜2mLのトリプシン)を加えます。細胞をトリプシンとともに37°Cで2〜3分間インキュベーターで培養します。
6. 顕微鏡で細胞が剥離したことを確認し、トリプシンを不活性化するために、使用したトリプシン1体分に2巻の温めたPMを加えます。
7. 細胞懸存液を15 mLの円錐形チューブに移し、室温で300 × g の遠心分離で5分間ペレットします。
8. 細胞を温めたPM1 mLに再懸浮させ、トリパンブルーでアリコットを染色して細胞の生存可能性を評価し、ヘモサイトメーターで細胞数を計ります。
   注:マウス株や年齢に応じて、2D培養を一晩行い、その後のトリプシン化後の原一次卵巣体細胞の予想数については 表1 を参照してください。トリプシン化された細胞の生存率は通常90%以上です。
9. 細胞を遠心分離(室温で300 × g 、5分間)でペレットし、細胞ペレットを卵巣オルガノイド培地に再懸浮させ、密度3.33 × 10個⁶ 個の生細胞を1 mLあたり、すなわち75 μLの培地あたり2.5個×^10個の5 個の生細胞にします。
   注:ここでは、アガロースマイクロモールドあたり2.5×10個の⁵細胞がシードされています。したがって、生成可能なマイクロモールドの総数は細胞数に依存します。オルガノイドはアガロースマイクロモールドあたり2.5個未満×10個^{5細胞未満}で生成可能ですが、オルガノイドの大きさ、集合速度、相対細胞組成、ホルモン産生を含む機能に影響が出る可能性があります。
10. 平衡化されたアガロースマイクロモールドをインキュベーターから取り出し、マイクロモールドが細胞シーディングチャンバーが上向きになるように配置し、卵巣オルガノイド培地を細胞シーディングチャンバーから取り出します(図5Aiii)。
    1. マイクロモールドの細胞シーディングチャンバーから培地を取り出すには、Graefe鉗子を使ってマイクロモールドを持ち上げ傾けるか、ピペッティングで行います。ピペッティングで細胞シーディングチャンバーから培地を除去するには、培地を抽出しながらピペットの先端を細胞シーディングチャンバーの隅に優しく浮かせます。マイクロウェルを乱さないため、アガロースマイクロモールドに直接接触しないでください。
       注意:細胞シーディングチャンバーはできるだけ乾燥していて、マイクロウェルが目で見えるようにする必要がありますが、マイクロモールドの外側は卵巣オルガノイド培地で囲まれている必要があります(図5Aiii)。
11. 細胞懸浮液を75μL(すなわち2.5 μL×10⁵ 細胞)を各アガロースマイクロモールドの細胞シーディングチャンバーに直接投与し、気泡の発生を防ぎます(図5Bi)。24ウェルプレートをインキュベーターに戻します。
12. 細胞シーディングから1〜2時間後、アガロースマイクロモールドの外側にさらに250μLの温まった卵巣オルガノイド培地を加え、細胞シーディングチャンバーを乱さないよう注意します(図5Bii)。
    注:一次卵巣体細胞は、アガロースマイクロモールド内で種子授ま後1〜24時間以内に集まり始めるはずです(図5Biii)。
13. 細胞シーディング翌日にアガロースマイクロモールドの周囲の培地を750μLの新鮮卵巣オルガノイド培地に置き換え、その後培養中は隔日で使用します。
    1. 培地を交換するには、プレートをわずかな角度で持ち、アガロースマイクロモールドの周りの使用済み培地を取り除きます。細胞シーディングチャンバーから培地を除去しないでください。細胞シーディングチャンバーを乱さないように、新しい培地をウェルの壁に優しくピペットで送り込む。
       注:培地変化による調理された培地は、オルガノイド分泌因子の解析のために-80°Cで保存可能です。オルガノイドが形成されると(細胞シード後1〜3日)、換え換えタンパク質や阻害剤を含む培地に置き換え、さまざまな処理がオルガノイド機能に与える影響を調べたり、化合物のスクリーニングに利用したりできます。

図5:卵巣体細胞オルガノイド生成の概説。 (A) (i) Graefe 鉗子を用いた培養皿へのアガロースマイクロモールド移送、(ii) 卵巣オルガノイド培地内でのアガロースマイクロモールドの平衡化、(iii) 細胞シーディングチャンバーからの培地除去の代表画像。 Aiiiの矢印は空の細胞シーディングチャンバーを示します。(B)(i,ii)アガロースマイクロモールドへの細胞シードの代表画像、(iii)卵巣体細胞が集まるアガロースマイクロモールドの透過光スキャン。スケールバー(Biii):2500μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

5. 下流応用におけるオルガノイドの利用

注:オルガノイドは組織学、分子生物学的応用(例:RNA/タンパク質解析)、条件付け培地分析、共培養など、さまざまな下流用途に利用可能です。

1. 組織学
   注:オルガノイドはアガロースマイクロモールドから除去せずに組織学的評価点のために処理可能です。実際、アガロースマイクロモールド内のオルガノイドは組織マイクロアレイと似た働きをし、複数の一定間隔のオルガノイドを同時に高スループット組織学的に評価することが可能です。
   1. 1.5%(w/v)の滅菌アガロースをPBSに煮沸して溶かします。
   2. 卵巣体細胞オルガノイドの培養後、プレートを斜めに持ってアガロースマイクロモールドを取り除きます。
   3. 解剖顕微鏡の下で、ピペットの先端を各細胞シーディングチャンバーの角に優しく浮かせ、オルガノイドを乱したりマイクロモールド自体を乱さずに培地を慎重に引き上げて、培地を細胞シーディングチャンバーから取り出します。
   4. 各細胞シーディングチャンバーの隅に1.5%アガロース液を100〜125μLの液体を慎重にピペットで送り込み、オルガノイドを乱さないように注意しながら細胞シーディングチャンバーを充填・密封します(図6Ai)。
   5. アガロースを室温で2〜3分間固化させます。
   6. 各ウェルに750μLの修正デイビッドソン液または4%パラホルマルデヒドを加え、4°Cで密閉されたアガロースマイクロモールド内にオルガノイドを固定します。
   7. 固定後は固定剤を除去し、アガロースマイクロモールドを70%エタノールで洗浄します。
      注意:マイクロモールドは組織処理(脱水、クリアリング、ワックス浸透)まで70%エタノール、4°Cで保存可能です。組織処理中は、アガロースマイクロモールドの配向を追跡してください。
   8. 組織処理後、アガロースマイクロモールドをパラフィンに埋め込み、マイクロモールドがパラフィンブロック内で平らになり、マイクロモールドの底部が最初に切断されるようにします(図6Aii)。
   9. 5μmでパラフィンを切片し、組織切片を荷電顕微鏡スライドに置きます。
      注:マイクロウェルの存在は、組織切片およびパラフィンブロックの両方で肉眼で確認できます(図6Aiii,iv)。マイクロモールド断片内のオルガノイドの存在は、顕微鏡で切片されたスライドを観察することで確認できます(図6Av)。同じスライドに2〜3つの連続したセクションを配置する代わりに、1つのスライドにそれぞれ50μm間隔(すなわち10^番目の セクションごとに)2〜3つのセクションを配置することで、ほとんどのオルガノイドが各スライドの少なくとも1つのセクションに表示される可能性が高まります。オルガノイドは組織切片内に一定間隔で配置されており、組織学的染色後の画像取得が容易になります(図6Avi)。
   10. スライドは37°Cのオーブンで一晩乾燥させます。
   11. 組織学的または免疫組織化学的染色を行うか、室温¹⁹で保存スライドを行ってください。
2. 分子応用のためのオルガノイドの収穫
   注:培養後、オルガノイドはアガロースマイクロモールドから取り出し、RNAやタンパク質抽出など、遺伝子やタンパク質の発現を評価するための様々な分子生物学的応用のために処理されます。
   1. アガロースマイクロモールドを含むプレートをわずかな角度で持ち、ピペッティングでアガロースマイクロモールドを囲む培地を除去します。
   2. アガロースマイクロモールドを含むウェルに室温のPBSを750μL添加します。
   3. グレーフェ鉗子を使ってアガロースマイクロモールドを逆さまに攪拌し、オルガノイドを周囲のPBSに放出します。顕微鏡でアガロースマイクロモールドからオルガノイドの放出を確認します。
   4. 空のアガロースマイクロモールドをグレーフェ鉗子で取り出し、オルガノイドを含むPBSをピペットでマイクロ遠心分離機管に移します。
   5. オルガノイドを室温で10,000 × g で遠心分離して5分間ペレットします。
   6. 上清液を吸引して除去し、RNAまたはタンパク質の抽出に進みます。あるいは、細胞ペレットを急凍して-80°^C19で保存する方法もあります。
3. オルガノイド調応培地の保存
   注:オルガノイド由来の条件付け培地は、ホルモン、サイトカイン、成長因子などのオルガノイド分泌因子の解析のために培養中に保存可能です。オルガノイド条件付き培地中のサイトカイン解析の代表的な結果は 図7Aに示されています。
   1. アガロースマイクロモールドを含むプレートをわずかな角度で持ち、ピペッティングでマイクロモールドを取り除きます。オルガノイドを乱さないため、細胞シーディングチャンバーから培地を除去しないでください。
   2. 調整された培地をマイクロ遠心分離機チューブに移し、培地分析またはフラッシュ冷凍して-80^°Cで保存^します。
      注意:オプションとして、10,000 × g で調製培地を5分間遠心分離し、死んだ細胞やゴミをペレットで除去してください。上清液を新しいマイクロ遠心分離機チューブに移し、その後培地分析や保管を行います。
4. オルガノイド共培養
   注:卵巣体細胞オルガノイドは複数の方法で他の細胞や組織と共培養可能です。ステップ5.4.1および5.4.3で説明された方法によるオルガノイド共培養と卵巣がん細胞および卵胞の代表的な結果は、以下に示されています。 図7B,C.
   1. 一次マウス卵巣体細胞と他の細胞種を組み合わせてオルガノイドを生成し、直接的な細胞間相互作用の影響を調べるには、手順5.4.1.1–5.4.1.4に従ってください。
      1. ステップ4.1–4.9に従い、2D培養後に一次卵巣体細胞を洗浄し、0.05%トリプシンを用いて2D培養から細胞を採取し、計数、細胞を卵巣オルガノイド培地に再懸浮させ、密度は2.5 ×10⁵ 個の生細胞、75 μLの培地で行われます。
      2. もし他の細胞タイプが相接している場合は、2D培養から細胞を採取してください。細胞数を数え、遠心分離でパレット化し、卵巣オルガノイド培地に75μLあたり2.5個×10個⁵ 個の生細胞で再懸浮させます。
      3. 一次卵巣体細胞の懸濁と、既知の比率で関心のある他の細胞タイプの懸濁を組み合わせます。
      4. 手順4.10–4.13に従い、得られた細胞懸濁液をアガロースマイクロモールドおよびオルガノイド培養にシードします。
   2. 形成されたオルガノイドを含むアガロースマイクロモールドを、他の細胞やオルガノイドを含む24ウェルプレートに移すには、手順5.4.2.1–5.4.2.4をご案内します。
      注:オルガノイド由来の分泌因子が他の細胞タイプに与える影響を評価するため、形成されたオルガノイドはアガロースマイクロモールド内に残し、アガロースマイクロモールド全体を他の細胞やオルガノイドを含む24ウェルプレートに移すことができます。これらの共培養法は、卵巣オルガノイド培地を用いて両方の細胞・組織タイプを培養できる場合に利用できます。
      1. 卵巣オルガノイド培地を37°Cまで温めて水浴で行う。
      2. アガロースマイクロモールドを含むプレートを斜めに持って、ピペッティングでアガロースマイクロモールドを囲む媒体を除去します。
      3. グレーフェ鉗子を使い、マイクロモールドを他の細胞やオルガノイドを含む24ウェルプレートに慎重に移します。
      4. アガロースマイクロモールドの周囲に750μLの新鮮卵巣オルガノイド培地を加えます。
   3. アガロースマイクロモールドから形成されたオルガノイドを除去し、新しいアガロースマイクロモールドに移すには、手順5.4.3.1–5.4.3.13に従ってください。
      注:卵巣オルガノイド培地が共培養実験の望ましい培地でない場合、ステップ5.4.2で説明されたパラダイムは、アガロースマイクロモールドが卵巣オルガノイド培地で飽和していることから、著しい培地の継承という課題を提起します。形成されたオルガノイド(初期細胞シーディング後1〜3日)はアガロースマイクロモールドから移され、新たなアガロースマイクロモールドに移され、培地の持ち越しを防ぐために追加の培養や共培養が可能です。
      1. 共培養用の培地を水浴で37°Cまで温めます。
         注:DMEM、αMEM、F12ベースの培地は、卵巣体細胞オルガノイドを用いた共培養実験に成功裏に用いられています。
      2. グレーフェ鉗子を使い、PBS +1% PSから新しいアガロースマイクロモールドを、他の細胞やオルガノイドを含む24ウェルプレートのウェルに慎重に移し、共培養します。
      3. マイクロモールドは培地に完全に浸し、必要に応じて共培養用の必要な培地を追加し、インキュベーター(加湿環境、37°C、_CO5%)で少なくとも30分間均等にしてください。
      4. 形成されたオルガノイドを含むアガロースマイクロモールドを含むプレートをわずかな角度で持ち、ピペッティングでアガロースマイクロモールドを取り除きます。
      5. 形成されたオルガノイドとアガロースマイクロモールドの周囲に共培養用の望ましい培地を加えます。
      6. グレーフェ鉗子を使ってアガロースマイクロモールドを逆さまに攪拌し、オルガノイドを周囲の培地に放出します。顕微鏡でアガロースマイクロモールドからのオルガノイド放出を確認します。
         注:一次卵巣体細胞が十分に凝集していない場合、アガロースマイクロモールドからオルガノイドを除去してもオルガノイドは完全な状態に残らないことがあります。オルガノイドの組み立てには、単離されたマウスの株や年齢によって1〜3日かかることがあります。
      7. 空のアガロースマイクロモールドをグレーフェ鉗子で取り出し、オルガノイドを含む培地をピペットでマイクロ遠心分離機チューブに移します。
      8. オルガノイドを室温で300× g で5分間遠心分離します。
      9. 解剖顕微鏡下でピペッティングで上清液を除去し、オルガノイドを含む培地を50〜75μL残します。
      10. 平衡化されたマイクロモールドをインキュベーターから取り出し、細胞シーディングチャンバーが上を向くようにマイクロモールドの向きを確認してください。
      11. 細胞シーディングチャンバーから培地はグレーフェ鉗子またはピペッティングで取り出します。
          注意:ウェルには500μLを超える培地を含まないようにしてはなり、マイクロモールドの細胞シーディングチャンバーを空にする必要があります。
      12. オルガノイドをピペットで各新しいアガロースマイクロモールドの細胞シーディングチャンバーに直接移します。24ウェルプレートをインキュベーターに戻します。
      13. 1〜2時間後に、アガロースマイクロモールドの外側にさらに250μLの必要な培地を加え、細胞シーディングチャンバーを乱さないように注意してください。

図6:卵巣の主要な卵巣細胞タイプは卵巣体細胞器に保存されています。 (A) (i) 培養末端でアガロースでマイクロモールドを密封する代表画像、(ii) 未切断のマイクロモールド、(iii) パラフィンブロックに埋め込まれた切片マイクロモールドの代表画像。マイクロウェルは(iv)マウント切片で可視化でき、切片されたマイクロモールド内のオルガノイドの存在は(vi)組織学的染色の前に顕微鏡で確認できます。(B) Vimentin、F4/80、Foxl2、3β-HSDに対する抗体を用いた免疫組織化学染色後のマウス卵巣組織切片および卵巣体細胞切片の代表画像。スケールバー=20μm。略称:H&E = ヘマトキシリンとエオシン。この図はDipaliらの許可を得て¹⁹ページを修正しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図7:卵巣体細胞オルガノイドと卵胞および卵巣がん細胞の共培養。 (A) 培養5日目にアガロースマイクロモールドあたりのオルガノイドサイトカイン分泌を測定し、オルガノイドを含まないアガロースマイクロモールドから調整された培地に正規化した。N=4個のアガロースマイクロモールド。(B) 培養0日目、4日目、8日目の卵巣卵胞の代表的な光画像(対照)オルガノイド有無にかかわらず、(i) 共培養パラダイムの概説。スケールバー=400μm。(ii)卵胞生存率および(iii)8日間の培養期間(対照)オルガノイド有無にかかわらず成長の定量化。データは平均±標準差で示されています。誤差の中には視覚化できないほど小さいものもあります。N=1グループあたり56個の卵胞。**P < 0.01。(C) 培養開始1日目、3日目、5日目にオルガノイド中の赤色蛍光タンパク質標識卵巣がん細胞(OVCAR8-RFP)と10:1の比率で培養した一次性卵巣体細胞の代表的な透過光(上)および蛍光(下)画像。スケールバー=400μm。略称:RFP = 赤色蛍光タンパク質。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

6. トラブルシューティングのヒント

1. 問題1:単離された一次卵巣体細胞の数が予想より少ない。
   注:酵素による消化後に卵巣組織断片が一貫して1mm未満、または目視で見えない場合、過剰消化による生存率低下により単離細胞数が少ない可能性があります。酵素による消化後に卵巣組織の断片が1mmを超える場合、卵巣組織の消化が不十分であるため、単離細胞数が少なくなる可能性があります。
   1. 酵素による消化後に卵巣組織の断片が1mmを超える場合は、手順6.1.1.1–6.1.1.2を追跡します。
      1. コラーゲンIVおよびDNase Iが推奨保存期間内であり、不適切な保管やDNase Iの場合は繰り返される凍結・解凍サイクルによる酵素活性の低下がないことを確認します。
      2. 卵巣組織のピペッティング回数を増やし、開口部を広くするためにp1000チップのボアサイズを狭め、EMでの培養時間を延長してください。
   2. 酵素分解後に卵巣組織断片が一貫して1mm未満であれば、卵巣組織の繰り返しピペッティングを減らし、p1000チップの穴を大きくして開口部を大きくして拡大し、EMでの総インキュベーションを減少させます。
2. 問題2:鋳造アガロースマイクロモールドの~25%以上に欠陥があります
   1. シリコーンキャストに残留アガロースやゴミがないか確認してください。必要に応じて、シリコーンの型をPBSで洗い、オートクレーブで再度滅菌してください。必要に応じて、鋳造に使われる1%アガロースを再加熱してください。固化したアガロースはシリコーン鋳物を均一に満たさず、気泡ができてしまう可能性があります。
   2. シリコーン鋳型にピペット化した後は、アガロースを完全に固化させます。鋳型からアガロースマイクロモールドを早期に取り出すとマイクロウェルが破損する恐れがあります。
   3. シリコーン鋳型が充填不足でないか確認してください。これはアガロースマイクロモールドの構造的な強度を低下させ、アガロースマイクロモールドを取り除く際にシリコーンを曲げる際に損傷を引き起こす可能性があります。
   4. さらに、シリコーン鋳造品の製造元は、12回までにオートクレーブ処理を推奨しています。シリコーン鋳型が過度に滅菌されている場合は、交換してください。
3. 問題3:オルガノイドが10%以上のマイクロウェルで形成されない
   1. アガロースマイクロモールドの鋳造時にシリコーン鋳型が過剰に充填されていないか確認してください。これにより細胞の不規則な分布が起こり、アガロースマイクロモールドの中央マイクロウェルが外側のマイクロウェルより有利になる可能性があります。
   2. アガロースマイクロモールドの細胞シーディングチャンバーに細胞懸濁液を投入する際には、泡がマイクロウェルへの細胞分布を妨げる可能性があるため、気泡を発生させないようにしてください。
   3. 必要に応じて、1マイクロモールドあたり75μL以上の細胞懸濁液(密度は3.33 × 1 mLあたり10個⁶ 個の生細胞)を用い、ピペット先端の容積不足による気泡が発生しないようにしてください。
   4. 細胞シーディングとアガロースマイクロモールドの外側に卵巣オルガノイド培地を追加する間隔を広げ、細胞がマイクロウェルに定着する十分な時間を確保します。

結果

卵巣体細胞オルガノイドの細胞組成を調べるため、主要な卵巣細胞型に対する抗体を用いて6日間培養後のオルガノイド組織切片の免疫組織化学を実施しました。オルガノイドにはビメンチン陽性線維芽細胞、F4/80陽性マクロファージ、さらにステロイドゲン細胞群が含まれていました(図6B)¹⁹。私たちは、Foxl2に対する抗体を用いて顆粒状物および顆粒状ルテイン細胞をマークし、さらに3β-HSDに対する抗体を用いてテカ細胞、テカルテイン細胞、ステロイドゲン性線維芽細胞をマークしました。卵巣体細胞オルガノイドにはFoxl2陽性細胞と3β-HSD陽性細胞の両方が含まれていました(図6B)¹⁹。興味深いことに、F4/80マクロファージと3β-HSD陽性ステロイドゲン細胞は異なる空間的組織を示し、マクロファージはオルガノイドの周囲に限定され、3β-HSD陽性ステロイドゲン細胞はオルガ...

ディスカッション

本論文では、卵巣体細胞区画の異質性を維持しつつ、間質豊富な卵巣部分から一次マウス卵巣体細胞を分離する方法を説明しています。一次マウスの卵巣体細胞は2次元単層で培養することも、足場のないアガロースマイクロモールドを用いて卵巣体細胞オルガノイドの生成に利用されます。アガロースマイクロモールドはオルガノイド形成のための96マイクロウェルを含み、24ウェルプレートの1つのウェルに収まるため、一貫した大きさのオルガノイドを大量に生成する高スループットの方法となります。さらに、アガロースマイクロモールドは培地交換、画像診断、下流の組織学的応用を容易にします。卵巣体細胞は細胞シード後1〜3日以内に自己組み立てを行いオルガノイドを形成し、オルガノイドは線維芽細胞、マクロファージ、ステロイドゲン細胞などの主要な卵巣細胞タイプを6日間の培養で保存します。細胞集団は空間的に異なる組織を示し、F4/80陽性マクロファージと切断されたカスパーゼ3陽性アポトーシー細胞はオルガノイド周辺に限定される一方、3β-HSD陽性ステロイドゲン細胞はオルガノイドコアから一貫して枯渇している

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.2 μm, Polyethersulfone syringe filter	Corning	431229
1.5 mL microcentrifuge tubes	MIDSCI	PR-MCT15
100 mL glass beaker	Fisherbrand	FB100100
100 mm Petri dishes	Corning	351029
15 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	339651
24-well plates (TC-treated)	Corning	353047
28-gauge insulin needles	Exel International	26027
35 mm Petri dishes	Corning	351008
3β-HSD antibody	Cosmo Bio	K0607	1:1000
4% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	1574100
40 µm cell strainer	Corning	431750
45 mm watch glass	Electron Microscopy Sciences	7054345
50 mL concial tubes	ThermoFisher Scientific	339652
60 mL sterile syringe	Air-Tite	ML60
60 mm TC-treated plates	Corning	353037
6-well plates (TC-treated)	Corning	353046
Agarose	Hoefer	GR140-500	Gel strength >1200 g/cm2; Gel Temperature 36 °C
Autoclave sterilization pouch	Fisherbrand	01-812-55
Biotinylated Goat Anti-Mouse IgG	Vector Laboratories	BA-9200-1.5	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG	Vector Laboratories	PK-6101	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rat IgG	Vector Laboratories	BA-9400-1.5	1:100
Bluing reagent	Fisherbrand	23-245681
Centrifuge with swing bucket rotor for 50 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	Sorvall X1R Pro-MD
Class II biosafety cabinet	The Baker Company	SG403A
Cleaved Caspase-3 (CC3) antibody	Cell Signaling Technology	9579T	1:250
CO2 incubator	ThermoFisher Scientific	Heracell VIOS 160i CO2 Incubator
Collagenase, Type IV, powder	Gibco, Fisher Scientific	17-104-019
C-Series Mouse Cytokine Antibody Array 3 Kit	RayBiotech	AAM-CYT-3-8
Cytoseal XYL	Epredia	83124
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Millipore Sigma	DN25-100MG	Dnase I
Dissecting microscissors	World Precision Instruments	WPI-14003
Dissecting scissors	World Precision Instruments	WPI-15922
Dissection microscope	Leica	MZ9.5, S9 series
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco, Fisher Scientific	14-190-250	pH 7.0–7.3
Eosin	Fisherbrand	23-314631
F4/80 antibody	Bio-Rad	MCA497G	1:50
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States	Gibco, ThermoFisher Scientific	10082147
Fine-tipped dissecting forceps	World Precision Instruments	WPI-14098
FOXL2 antibody	Abcam	ab246511	1:200
Graefe Forceps	Fine Science Tools	1105010
Hematoxylin	EK Industries	EKI 47971GL
Hemocytometer	MedOne	DHCN015
Imaging System	ThermoFisher Scientific	EVOS FL Auto
IntestiCult Organoid Growth Medium (Mouse)	STEMCELL Technologies	06005	Basal medium, Supplements 1 and 2
Laminar flow hood	IVFtech	IVFtech sterile workstation
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco, Fisher Scientific	11415114
Microscope slides	Mercedes Scientific	MER 7255/90/WH/CC
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids	Millipore Sigma	Z764043-6EA	Silicone casts for agarose micromolds
Modified Davidson's Fixative	Electron Microscopy Sciences	6413350
OVCAR8-RFP cells			Joanna Burdette PhD, University of Illinois Chicagoからの贈り物
Penicillin-Streptomycin	Millipore Sigma	P4333-100ML
Picrosirius Red staining solution	StatLab	STPSRPT
RPMI 1640 Medium (ATCC modification)	Gibco, Fisher Scientific	A1049101
Tabletop centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430 R
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	T10282
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco, ThermoFisher Scientific	25300054
Vimentin antibody	Cell Signaling Technology	5741S	1:100
αMEM, GlutaMAX Supplement, no nucleosides	Gibco, Fisher Scientific	32561102