ショウジョウバエ複眼の高解像度Zスタックイメージングのためのテープマウントプロトコル

Summary

このプロトコルの主な目的は、ショウジョウバエ複眼の非破壊画像および定量解析を可能にすることです。テープマウンティング戦略と立体顕微鏡Zスタック取得、拡張焦点深度再構成を組み合わせて、高解像度でアーティファクトのない画像を生成します。

Abstract

ここでは、ショウジョウバエ複眼の高解像度表現型解析のための非破壊的なマウントおよび画像診断プロトコルを提示します。ショウジョウバエの複眼の正確な表現型は、その凸状の形状や取り扱い時の機械的脆弱性によってしばしば制限されます。これに対応するため、多角から高解像度の可視化を可能にする多用途で非侵襲的な画像ワークフローを詳述します。このプロトコルは、逆テーププラットフォーム上にカスタムの接着剤マウント戦略を用い、頭部は完全に触れずに体と翼でハエを固定します。重要なのは、この柔軟な構成が異なる取り付け姿勢を支えていることです。個々の目の完全な凸性を捉えるための横向きと、頭部全体の対称性を評価するための正面位置です。この方法は高密度アレイの配置も容易にし、1セッションあたり20〜30サンプルの迅速な処理を可能にします。反射光立体顕微鏡とZスタック取得および拡張焦点深度(EDF)再構成を統合することで、均一にシャープな準3D合成画像を生成します。このアプローチは自然な色素沈着を保持し、定量的な臓器規模の表現型解析に適した高精度でコントラスト豊かな画像を生成します。

Introduction

ショウジョウバエのメラノガスター複眼は、発生過程における臓器の成長、パターン形成、頑健さを研究するための古典的かつ強力なモデルです。約800個の高度に秩序化されたオマチディアから成るハエ眼は、増殖、分化、^{組織組織に影響を与える}遺伝的撹乱の感度が高く定量的な読み取り^{を提供します。}眼の発達における遺伝的操作は、保存されたシグナル伝達経路に関する基本的な洞察をもたらしてきました。画期的な研究により、転写因子の無眼発現が非網膜組織での眼形成を誘導するのに十分であることが示され、眼が臓器の特定と可塑性のパラダイムとして確立されました^。その後の研究では、D. melanogasterのヒッポシグナル伝達経路が増殖とアポトーシスの協調制御を通じて眼の大きさと細胞数の中心的調節因子であることが特定^{されました。}並行して、HedgehogおよびBMPシグナル伝達は、発達中の網膜内で形態形成の進行、成長精度、空間パターンを調節することが示されました^7,8。

しかし、成人の複合眼の高精実度画像を撮影するには、凸状の半球状形状のため大きな光学的課題があります。標準的な明視野顕微鏡は被写界深度が浅いため、1回の露光で眼の最背面端(極)と周辺端(赤道)に同時に焦点を合わせることは不^{可能です。}この制約により、網膜表面のかなりの部分がぼやけてしまい、多彩表現型を定量化するための高解像度画像解析や機械学習ツールの適用が妨げられることがあります。網膜表面を完全に特徴付けるためには、光学アーティファクトなしで全曲率を可視化する必要があります。したがって、本来の眼の形態を保存しつつ、曲面網膜全体の高解像度可視化を可能にするイメージング手法が必要です。

さらに、従来の顕微鏡検査用のサンプル準備方法は、フライヘッドの構造的な強度を損なうことがよくあります。従来の取り付け技術では、表面の細部を隠す接着剤や、ピンセットで頭部カプセルに圧力をかける物理的な操作が求められることが多いです。網膜形態形成の研究で指摘されているように、眼の構造的な完全性は極めて重要です。直接圧力や穿刺はヘモリンパ漏れを引き起こし、内部圧力の低下と、その後の眼表面の崩壊(「へこみ」)を引き起こします。これらの機械的アーティファクトは神経変性表現型や遺伝的欠陥を模倣し、大規模なスクリーニングで偽陽性の結果を引き起こすことがあります。このプロトコルの目的は、無傷のショウジョウバエ複眼の高解像度可視化のための非破壊的なマウントおよび画像処理ワークフローを提供することです。

ここでは、頭部に直接接触せずに完全なショウジョウバエ複眼および頭部全体の形態を高解像度で可視化できる、迅速かつ再現可能なイメージングワークフローを提示します。この方法では、成虫のハエを体と翼を固定する柔軟な接着剤マウント方式で固定し、片目の完全な曲率を捉えるための横向きまたは前方向きで安定した位置を取ることを可能にします。この多用途な取り付け方法により、機械的損傷を最小限に抑え、三次元の目の形状を保存します。反射光立体顕微鏡、Zスタック取得、拡張焦点深度^再構成9と組み合わせることで、この手法は複数の視点から均一にシャープで高品質な画像を生成し、定性的検査と定量的表現型解析の両方に適しています。この方法は特にショ ウジョウバエの遺伝的攪乱、発生表現型、そして高スループットスクリーニングの眼形態の研究に適しています。

Protocol

1. サンプルの収集と同期

注:実験的な比較可能性を確保するために、エクロジョンタイミングの厳密な制御が必要です。標準的な25°Cの培養条件下では、卵の産みから10〜12日以内に崩壊が起こります。この期間中は蛹を注意深く観察し、蛹殻の色が濃くなっていることは間もなく羽化の兆候です。

1. 直接タッピング法(標準法)
   1. 標準的な24×95mmのプラスチック製 ショウジョウバエ 培養バイアル(フォームプラグで密封)を柔らかいパッドに優しく叩き、成虫のハエを底に落とします。
   2. プラグを素早く外し、新しい採取バイアルの口を培養バイアルと合わせます。
   3. セットアップを逆にして培養バイアルを上に置くようにします。壁を軽く叩いてハエを採取バイアルに移します。
      注意:この方法は、標準的なコーンミール・寒天の餌質が湿っている場合は推奨されません。閉じたばかりのハエは簡単に捕獲されて殺されてしまうからです。死亡率を最小限に抑えるために、まず空の24×95mmバイアルにハエを集めます。麻酔後(ステップ3)、ハエを新鮮な培地が入った24×95mmのバイアルの内壁に移します。
2. 負のジオタキシス移送法(アンチアタッチメント法)
   1. 新しい採取バイアルからプラグを取り出し、カウンターの上で逆さまにして、迷い込んだハエの侵入を防ぎます。
   2. 培養瓶は開口部を下に向けて持つ。ハエは開口部から離れて餌の側に向かって上へ登ります。
   3. 開口部からハエがいなくなったら、素早く培養バイアルの栓を抜き、ベンチの逆さまの空の24 x 95mm採取バイアルと合わせます。
   4. 接続点を作業台に優しく叩き、ハエを採取バイアルに落とします。
      注:この方法は食物の付着による死亡率を大幅に減らしますが、直接採取よりも時間がかかります。
3. CO₂麻酔法(高効率法)
   1. 培養バイアルを逆さにしてプラグを下向きにします。
   2. CO₂麻酔銃の針をプラグとバイアルの壁の間に慎重に差し込みます。
   3. フットペダルとハンドバルブを優しく作動させ、低く穏やかな流量で100%のCO₂を放出します。
   4. ハエが麻酔されてプラグに落ちたら、培養バイアルを水平に置きます。プラグを外し、空の採集バイアルに合わせ、培養バイアルを優しく叩いて麻酔されたハエを採集バイアルに移します。
      注意:過剰な空気の流れはハエを食品表面に吹き飛ばし、粘着や死を引き起こすことがあります。ハエを物理的に押し流させずに麻酔できる程度の穏やかな_CO2 流量を厳密に維持してください。モニターは、翼や脚の微かな痙攣や動きなどの回復の初期兆候を注意深く観察します。
4. 表示とメンテナンス
   1. 採集バイアルに性、採集日、発泡日、遺伝子型、培養条件をラベル付けしてください。
   2. 性別分離:画像検査で飛行が10日を超えた場合、交尾や実験環境に干渉する可能性のあるF2世代の出現を防ぐため、オスとメスを異なる食物含有培養バイアルに分けてください。
      注:ハエは、過去の培養条件下(例:25°C)で、画像検査に適した年齢に達するまでこれらの食品入りバイアルに保持することができます。

2. 取り付け板の準備

1. クリーンな標準ガラス顕微鏡スライドを入手してください。
2. スライドより約2cm長い白い紙のマスキングテープを切ります。
3. スライドにテープを貼り、接着面が上向き(非接着面)をガラスに当てます。テープがスライドの両端で約1cmはみ出していることを確認してください。
4. 張り出した端を、スライドの背面にさらに2~5mmのテープをきつく巻きつけて固定します。
5. 接着面が平らで張り、しわがないことを確認してください。
6. ラベル付け:テープの非接着端に向き表示(例:「Top/Up」や「Bottom/Down」)やサンプル識別子をマークし、顕微鏡下での向き付けやサンプル追跡を容易にします。
   注意:画像診断用のハエを選ぶ際は、体格差が大きい個体を避けてください。同じ倍率でも、体格の違いによって複合眼の表面積が比較できないことがあります。

3. 安楽死と騎乗

1. 安楽死
   1. ハエを密封された空の採取バイアルに移します。
   2. 密封されたバイアルを-80°Cの冷凍庫に15〜20分間入れます。
      注意:細いピンセットの鋭い先端でフライを刺したり絞ったりしないでください。わずかな血リンパ漏れでも内部静水圧が急激に低下し、即座にへこみや複眼の不可逆的な虚脱を引き起こし、画像画の品質を損なう。
2. 横方向視点(複眼)用のマウント
   1. 位置決め:標準的な立体顕微鏡(例:Nikon SMZ745)の下で、細かいピンセットを使って安楽死したハエを横向き(横向き)に位置付けます。
   2. 転移:細いピンセットを使い、翼を優しく掴み(横方向の姿勢を保ち)、準備された接着板に移します。
   3. 固定:ハエの体の片側を粘着テープに貼り付けます。翼を広げてテープにぴったりと貼り付けて安定性を高めます。
   4. 付属物の管理:装着時には、脚が複眼を妨げないように注意してください。前脚が視界を遮る場合は、ピンセットを使って慎重に目から引き離し、テープにしっかりと貼り付けます(例えば、脚を下に伸ばしたり、胸の下に隠したりします)。
   5. 固定方法:ピンセットを傾け、先端の側面(鋭利な先端ではなく)でテープ本体を優しく押し当てて、しっかりと接着します。
   6. 微調整:ヘッドが水平かどうか確認してください。目が単一の焦点面にない場合は、ピンセットを使って体の角度を微調整します。
3. 正面からのマウント(頭部全体)
   1. 位置:麻酔パッドの上でフライを腹側(うつ伏せ)に配置します。
   2. 転送:ピンセットで片方の翼を掴み、フライを持ち上げます。接着板に移してください。
   3. 初期固定:両翼を優しく外側(左右)に広げ、接着面にしっかりと押し付けてフライを固定します。
   4. ボディ安定化:胸部を優しく押さえ、接着プレートに完全に接触させます。ピンセットで後腹部(尾)を軽く掴み、体軸をまっすぐに伸ばしてから腹部をテープに貼り付けます。
   5. 頭部の向き:細いピンセットを使って頭部の角度を調整し、前面面(面)が接着面と平行になるようにします。複眼は同じ焦点面で水平で見えるべきです。
4. 配置
   1. 接着面に複数のフライを並列またはグリッド状のアレイで取り付けます。個々のフライが重ならないように注意し、Zスタック干渉を防ぎますが、スループットを最大化するために密密な詰め込み(例:1スライドあたり20〜30枚のフライ)も許可されます。すべてのハエを同じ方向(ステップ2.6のラベルで示す通り)に合わせて、系統的な画像撮影を容易にします。
   2. 同じコホートから異なる安楽死されたハエのセットを用いて、側面および前頭部画像診断用の別々のサンプルアレイを準備します。一度フライがテープに付着すると、安全に取り外したり再配置したりすると、試料に深刻な機械的損傷を与えます。したがって、同一の個人から複数のビューを連続して画像化することはできません。
      注意:組織乾燥を防ぐため、安楽死とマウント直後にサンプルの画像撮影を強く推奨します。

4. 画像取得

1. モーター式立体顕微鏡イメージングシステムの起動と初期化
   1. パソコン、モニター、顕微鏡ユニットの電源を順番に開けます。
   2. LAS Xソフトウェアを起動してください。
   3. 「初期化/自己テスト」のプロンプトが表示されたら、目標の下に障害物がないことを確認し、「 確認」をクリックします。顕微鏡がZ軸のキャリブレーションを完全に完了するまで待ってください。
      注:以下の手順は、LAS Xソフトウェアシステムを用いたステレオ顕微鏡向けに最適化されています。
2. サンプルの配置と照明
   1. 準備済みの取り付け板をモーター式立体顕微鏡のベースプラットフォームに移し、デジタルカメラの対物レンズの下にアレイの最初のサンプルを手動で配置します。
   2. 透過光(ベース)と入射光(上部)の光源をオンにします。複眼画像では主に反射光を使用します。均一な照明を確保するために絞りを調整してください。
3. ソフトウェア構成
   1. 取得モードをZスタックに設定してください。プロジェクト設定で、多次元移動優先度を「Zファースト」に設定し、モーター駆動の連続的かつ安定した動作を確保します。
   2. イメージングモードを反射光に設定してください。
   3. 拡張 焦点 深度(EDF)を有効にして、完全にピントを合わせた画像の合成を可能にします。
   4. 画像詳細設定でハイダイナミックレンジ(HDR)を有効にしてください。複眼の反射率が高くキチン質質の強い表面による鏡面のハイライトや過剰露出を軽減するために、これは強く推奨されます。
4. 位置とホワイトバランス
   1. 拡大率のノブを適切なレベル(例:横方向の片目視点ではズーム係数16倍、正面全体視点では12.5倍)に調整し、特定の関心領域が視野の半分から2分の3を占めるようにします。
   2. マウントプレートを手動で位置を調整し、ハエの胸部を視野の中央に誘導します。
   3. 胸部を使って色温度を補正するためにホワイトバランスキャリブレーションを行います。
5. 露光およびイメージングパラメータ(参照値)
   露光時間:60〜80ms。
   ゲイン:0–5(ノイズを最小限に抑えるために低音で維持)。
   強度:60%〜80%。
   Zスタックステップサイズ:標準:8–12μm。
   注:滑らかで健康な複眼(例: w¹¹¹⁸ × GMR-GAL4)の場合、連続的かつ規則的な曲率により光学断片数が少ないため、最大15μmのステップサイズで十分かもしれません。しかし、急激なトポロジカル変化を特徴とする粗末または不均一な眼表現型では、細かい構造の詳細を捉え、EDF再構成精度を大幅に向上させるために、より小さなステップサイズ(5μm程度)が必要です。
6. Zスタックの定義とキャプチャ
   1. 横方向の視点では、Zスタックの範囲を軌道リム(開始)から中心オマティジア(終了)までのステップサイズ8〜12μmで設定します。
   2. 正面視点では、複合眼の外側の輪郭がかろうじてピントが合うまでフォーカスノブを調整します(スタート)。頭頂部の中央眼(黄色い単純な目)がかろうじてピントが合うまで、逆方向に焦点を合わせます(終わり)。セット エンドをクリックします。
   3. プレビューをフリーズするには 「ライブ停止 」をクリックしてください。
   4. 取得開始をクリックします。システムは定義された焦点面を自動的に捉え、高解像度で完全にピントを合わせた画像を合成します。
7. ファイル保存:
   1. EDFの再構築が完了したら、ソフトウェアインターフェースの 「保存 」アイコンをクリックし(または ファイル > 「名前を付けて保存」へ移動してください。
   2. 宛先ディレクトリを選択し、指定されたファイル名を入力して「 保存」をクリックします。
   3. 各取得は3つの異なる画像ファイルを生成します:a.RAW/チャンネル画像(グレースケール);b.カラープレビュー画像;c. EDF合成画像(「_Composite」接尾辞付き)
      注:RAW/チャネル画像とEDF合成画像の両方は分析および記録のために保存されるべきです

Results

サンプル収集から画像取得までの完全な実験パイプラインは 図1にまとめられています。修正プロトコルの効率性は、高密度サンプルアレイの作成によって実証されています。 図2Aに示すように、20〜30匹の麻酔フライを1つの逆テーププラットフォーム上に格子状のパターンで配置できます。テープの非接着性端に書かれた向きマーカーにより、ヘッドの方向性が一貫しており、最小限の段階調整で迅速かつ体系的なイメージングが可能になります。特に、この方法は固定プロセスを標準化し、野生型および変異型の両方の再現可能なイメージングのための高密度アレイの迅速な生成を可能にします。成功した調製により、曲面網膜全体にわたって均一にシャープな画像が生成され、変形や光学的ぼやけがありません。

この戦略により、2つの異なる向きでの安定した固定が可能です。 図2B は、フライが横向き...

Discussion

ショウジョウバエの複眼は遺伝子スクリーニングのための強力な表現型読み取りとして機能し、目の大きさ、粗さ、色素沈着^2,3,8の観察可能な変化は、しばしばヒッポ^5,6やヘッジホッグ⁷のような基本的なシグナル伝達経路の乱れを示します。しかし、このようなスクリーンの効率は長い間、従来のイメージングワークフローの限界によってボトルネックされてきました。従来の固定技術は、通常ピンセットで手動で位置決めるか、永久接着で行うもので、労力と時間がかかるだけでなく、分析対象の構造自体を傷つけやすいです。これらの課題に対処するため、カスタムの逆テーププラットフォームを用いた多用途な取り付け戦略を開発しました。このアプローチは、...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
二酸化炭素(CO2)ガスシリンダー	現地サプライヤー	該当なし
CO2麻酔用吹き銃	T&L	DG-08
デジタル顕微鏡カメラ	ライカ	DMC6200
細いピンセット	ヴェトゥス	MOS-167B
フォームプラグ	東鵬	該当なし
画像取得ソフトウェア(LAS X)	ライカ	3.7.1
画像処理ソフトウェア(FIJI/ImageJ)	NIH	オープンソース
LEDドーム照明装置	ライカ	LED5000 HDI
LEDグースネック照明器	コシム	LG-10
モーター式立体顕微鏡	ライカ	M205 FCA
対物レンズ	ライカ	1.0x PlanApo NA0.2
空気圧式フットペダルバルブ	デリクシー	FV-320
標準ショウジョウバエ培養バイアル	ライブール	2424951
標準ショウジョウバエの餌食培地	該当なし	トウモロコシ粉・アガー・モラセス
標準的なガラス顕微鏡スライド	シトテスト	10127101P-G
標準立体顕微鏡	ニコン	SMZ745
白紙マスキングテープ	アブウィン	幅25mmです