ショウジョウバエ複眼の高解像度Zスタックイメージングのためのテープマウントプロトコル

Summary

このプロトコルの主な目的は、ショウジョウバエ複眼の非破壊画像および定量解析を可能にすることです。テープマウンティング戦略と立体顕微鏡Zスタック取得、拡張焦点深度再構成を組み合わせて、高解像度でアーティファクトのない画像を生成します。

Abstract

ここでは、ショウジョウバエ複眼の高解像度表現型解析のための非破壊的なマウントおよび画像診断プロトコルを提示します。ショウジョウバエの複眼の正確な表現型は、その凸状の形状や取り扱い時の機械的脆弱性によってしばしば制限されます。これに対応するため、多角から高解像度の可視化を可能にする多用途で非侵襲的な画像ワークフローを詳述します。このプロトコルは、逆テーププラットフォーム上にカスタムの接着剤マウント戦略を用い、頭部は完全に触れずに体と翼でハエを固定します。重要なのは、この柔軟な構成が異なる取り付け姿勢を支えていることです。個々の目の完全な凸性を捉えるための横向きと、頭部全体の対称性を評価するための正面位置です。この方法は高密度アレイの配置も容易にし、1セッションあたり20〜30サンプルの迅速な処理を可能にします。反射光立体顕微鏡とZスタック取得および拡張焦点深度(EDF)再構成を統合することで、均一にシャープな準3D合成画像を生成します。このアプローチは自然な色素沈着を保持し、定量的な臓器規模の表現型解析に適した高精度でコントラスト豊かな画像を生成します。

Introduction

ショウジョウバエのメラノガスター複眼は、発生過程における臓器の成長、パターン形成、頑健さを研究するための古典的かつ強力なモデルです。約800個の高度に秩序化されたオマチディアから成るハエ眼は、増殖、分化、^{組織組織に影響を与える}遺伝的撹乱の感度が高く定量的な読み取り^{を提供します。}眼の発達における遺伝的操作は、保存されたシグナル伝達経路に関する基本的な洞察をもたらしてきました。画期的な研究により、転写因子の無眼発現が非網膜組織での眼形成を誘導するのに十分であることが示され、眼が臓器の特定と可塑性のパラダイムとして確立されました^。その後の研究では、D. melanogasterのヒッポシグナル伝達経路が増殖とアポトーシスの協調制御を通じて眼の大きさと細胞数の中心的調節因子であることが特定^{されました。}並行して、HedgehogおよびBMPシグナル伝達は、発達中の網膜内で形態形成の進行、成長精度、空間パターンを調節することが示されました^<....

Protocol

1. サンプルの収集と同期

注:実験的な比較可能性を確保するために、エクロジョンタイミングの厳密な制御が必要です。標準的な25°Cの培養条件下では、卵の産みから10〜12日以内に崩壊が起こります。この期間中は蛹を注意深く観察し、蛹殻の色が濃くなっていることは間もなく羽化の兆候です。

1. 直接タッピング法(標準法)
   1. 標準的な24×95mmのプラスチック製 ショウジョウバエ 培養バイアル(フォームプラグで密封)を柔らかいパッドに優しく叩き、成虫のハエを底に落とします。
   2. プラグを素早く外し、新しい採取バイアルの口を培養バイアルと合わせます。
   3. セットアップを逆にして培養バイアルを上に置くようにします。壁を軽く叩いてハエを採取バイアルに移します。
      注意:この方法は、標準的なコーンミール・寒天の餌質が湿っている場合は推奨されません。閉じたばかりのハエは簡単に捕獲されて殺されてしまうからです。死亡率を最小限に抑えるために、まず空の24×95mmバイアルにハエを集めます。麻酔後(ステップ3)、ハエを新鮮な培地が入った24×95mmのバイアルの内壁に移します。
2. 負のジオタキシス移送法(アンチアタッチメント法)
   1. 新しい採取....

Results

サンプル収集から画像取得までの完全な実験パイプラインは 図1にまとめられています。修正プロトコルの効率性は、高密度サンプルアレイの作成によって実証されています。 図2Aに示すように、20〜30匹の麻酔フライを1つの逆テーププラットフォーム上に格子状のパターンで配置できます。テープの非接着性端に書かれた向きマーカーにより、ヘッドの方向性が一貫しており、最小限の段階調整で迅速かつ体系的なイメージングが可能になります。特に、この方法は固定プロセスを標準化し、野生型および変異型の両方の再現可能なイメージングのための高密度アレイの迅速な生成を可能にします。成功した調製により、曲面網膜全体にわたって均一にシャープな画像が生成され、変形や光学的ぼやけがありません。

この戦略により、2つの異なる向きでの安定した固定が可能です。 図2B は、フライが横向き.......

Discussion

ショウジョウバエの複眼は遺伝子スクリーニングのための強力な表現型読み取りとして機能し、目の大きさ、粗さ、色素沈着^2,3,8の観察可能な変化は、しばしばヒッポ^5,6やヘッジホッグ⁷のような基本的なシグナル伝達経路の乱れを示します。しかし、このようなスクリーンの効率は長い間、従来のイメージングワークフローの限界によってボトルネックされてきました。従来の固定技術は、通常ピンセットで手動で位置決めるか、永久接着で行うもので、労力と時間がかかるだけでなく、分析対象の構造自体を傷つけやすいです。これらの課題に対処するため、カスタムの逆テーププラットフォームを用いた多用途な取り付け戦略を開発しました。このアプローチは、.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
二酸化炭素(CO2)ガスシリンダー	現地サプライヤー	該当なし
CO2麻酔用吹き銃	T&L	DG-08
デジタル顕微鏡カメラ	ライカ	DMC6200
細いピンセット	ヴェトゥス	MOS-167B
フォームプラグ	東鵬	該当なし
画像取得ソフトウェア(LAS X)	ライカ	3.7.1
画像処理ソフトウェア(FIJI/ImageJ)	NIH	オープンソース
LEDドーム照明装置	ライカ	LED5000 HDI
LEDグースネック照明器	コシム	LG-10
モーター式立体顕微鏡	ライカ	M205 FCA
対物レンズ	ライカ	1.0x PlanApo NA0.2
空気圧式フットペダルバルブ	デリクシー	FV-320
標準ショウジョウバエ培養バイアル	ライブール	2424951
標準ショウジョウバエの餌食培地	該当なし	トウモロコシ粉・アガー・モラセス
標準的なガラス顕微鏡スライド	シトテスト	10127101P-G
標準立体顕微鏡	ニコン	SMZ745
白紙マスキングテープ	アブウィン	幅25mmです