カラーギーナン誘発性前立腺炎におけるユーグイピルのネットワーク薬理学およびラットモデル解析

サマリー

本研究はネットワーク薬理学と 生体内 実験を統合し、前立腺炎治療におけるユーグイピルの潜在的効果を調査しています。ネットワーク薬理学解析およびラット前立腺炎モデルにおけるYGP治療は、YGPの治療効果が炎症反応の調節と関連している可能性を示唆し、YGPが前立腺炎において抗炎症効果を発揮していることを示しました。

要約

前立腺炎は一般的な泌尿器系疾患で、治療の選択肢は限られています。ユーグイピル(YGP)は、特に炎症関連疾患において治療価値が期待されています。本研究はその効果を評価し、潜在的なメカニズムを探ることを目的としました。YGPの活性成分は経口バイオアバリアフリー(OB ≥ 30%)および薬物類似性(DL ≥ 0.18)基準を用いてTCMSPからスクリーニングし、対応するターゲットを収集した。前立腺炎関連標的はGeneCardsから得られ、重なり合う標的はタンパク質間相互作用(PPI)ネットワークおよび京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)エンリッチメントを用いて解析されました。合計126種類の有効化合物と208の潜在的な標的が特定され、そのうち180の重複標的が前立腺炎に関連していました。PPI解析により、TP53、IL6、AKT1、TNF、IL1Bが主要なハブ遺伝子として特定されました。KEGG濃縮は、IL-17、TNF、MAPK、PI3K-Aktシグナル伝達経路などの炎症関連経路の関与を示唆しました。前立腺炎のラットモデルは、前立腺内注射によるカラギーナンの投与によって確立されました。腫瘍壊死因子α因子(TNF-α)およびインターロイキン6(IL-6)の組織学的検査および測定を行い、治療効果の評価を図りました。YGP治療により前立腺組織病理が改善され、タンパク質およびmRNAレベルでTNF-αおよびIL-6レベルが低下しました。これらの発見は、YGPが前立腺炎において抗炎症効果を発揮することを示唆していますが、具体的な分子メカニズムはまだ検証されていません。

概要

前立腺炎は、前立腺が腫れや刺激によって炎症を起こす状態^です。世界の泌尿器科臨床受診の約25%を占め^{ています。}米国国立衛生研究所(NIH)は前立腺炎を急性細菌性、慢性細菌性、慢性前立腺炎/慢性骨盤痛症候群(CP/CPPS)、無症状前立腺炎3の4つの分類に分類^{しました。}これらの中で最も多く見られたCP/CPPSは、持続的な炎症や免疫調節障害と密接に関連しています。前立腺炎の炎症性の理解が進んでいるにもかかわらず、特に非細菌性サブタイプに対する現在の治療戦略は限られています ^4,5。抗生物質は臨床現場で一般的に使用されています。しかし、非細菌性前立腺炎に対するその有効性^{は非常に議論の}的です。α遮断薬から非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)まで、他の治療法は主に症状緩和を目的としていますが、消化器障害や起立性低血圧などのリスクが無視できないほどの最適とは言えない結果がしばしば示^{されています。}これらの制限は、前立腺炎の炎症を効果的に調節できる代替治療法の必要性を浮き彫りにしています。

伝統中国医学(TCM)は、より優れた安全性と耐容性プロファイルにより幅広い治療効果をもたらす可能性があります。¹¹。幽桂丸(YGP)は『景月全書』に記録された古典的な処方であり、何世紀にもわたり腎陽を補い関連疾患の緩和に実証的に用いられてきました¹²。過去の研究では、その成分の一部が抗炎症活性を持つことが報告されています(13,14,15,16)。臨床的証拠はYGPが前立腺炎の症状を効果的に緩和できることを示唆していますが、その根本的なメカニズムは依然として不明です¹⁷。ネットワーク薬理学は、システム生物学と薬理学を組み合わせて、伝統医学の複雑なメカニズムを明らかにする強力で統合的なアプローチとして機能^します。YGPは複数の標的および炎症関連経路を調節することで抗炎症効果を発揮する可能性があると仮説が立てられました。これらの予測は、カラギーナン注射によって前立腺炎を誘発するin vivo前立腺炎モデルを用いてさらに評価されました。モデル確立後、動物はYGPで処理されました。前立腺組織はヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色による組織病理学的検査のため、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)による炎症マーカーの定量評価のために採取されました。

プロトコル

すべての動物実験は北京中医大学の動物管理利用委員会(BUCM-2024110107-4103)によって承認されました。

アクティブ構成員とターゲットの収集
YGPは、レフマニア・グルティノサ、アコニトゥム・カルミカエリ、シナモム・カッシア、ディオスコレア・オオシタ、コルヌス・オフィシナリス、クスキュタ・チネンシス、アンジェリカ・シネンシス、ユーコミア・ウルモイデス、セルヴィ・コルヌス・コラ、リキウム・バルバルムで構成されています。これらのハーブ名は、伝統的な中国医学システムの薬理学データベースおよび分析プラットフォーム(TCMSP)に入力され、その化合物を取得しました。有効化合物は経口バイオアバリアベイ(OB ≥ 30%)および薬物類似性(DL ≥ 0.18)基準^19、20、21を用いてスクリーニングされました。各化合物の対応する標的はTCMSPから得られ、UniProtデータベースを用いて遺伝子記号に標準化されました。前立腺炎関連のターゲットはGeneCardsデータベースから「prostatitis」というキーワードで取得し、平均より関連スコアの高い遺伝子を研究対象として選定しました。

前立腺炎に対するYGPの規制ネットワークの構築
YGP関連標的と前立腺炎関連標的の交差点が特定され、潜在的な治療標的の集合として定義されました。これらの標的はCytoscape(バージョン3.9.1)に取り込まれ、化合物-標的-疾患ネットワークを構築しました。ネットワークトポロジー解析はCytoHubbaプラグインを用いて行われ、最大クリーク中心性(MCC^{)値に基づいて}主要コンポーネントが特定されました。

タンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク解析
重複する標的はSTRINGデータベース(バージョン11.5)にインポートされ、生物は ホモ・サピエンスに設定されました。必要な最小インタラクションスコアは≥ 0.7に設定され、切断されたノードは²³番目に隠されていました。インタラクションデータはTSV形式でエクスポートされ、Cytoscapeで可視化されました。Hub遺伝子は、次数中心性に基づくCytoHubbaプラグインを用いてさらに同定されました。

KEGG経路およびGO濃縮解析
共有されたターゲットは、京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)経路解析のためのMetascapeプラットフォームにアップロードされました。入力および解析種は ホモ・サピエンスに設定されました。KEGG経路濃縮解析を実施しました。経路は、公開文献やデータベース注釈によって前立腺炎との関連性に基づいてさらにフィルタリングされました。残りの経路はLog P値に基づいてランク付けされました。上部の濃縮されたKEGG経路はバブルプロットを用いて可視化されました。

分子ドッキング
主要な標的はPPIネットワークから度数中心性に基づいて選定され、活性化合物はMCC値に基づくYGP-前立腺炎調節ネットワークから同定され、その後のドッキング解析に用いられました。タンパク質構造はAlphaFoldタンパク質構造データベースからPDB形式で取得され、リガンド構造はTCMSPからmol2形式²⁴でダウンロードされました。分子ドッキングはCB-Dock2オンラインプラットフォーム²⁵を用いて実施されました。ドッキング前には、タンパク質構造は水分子を除去し、水素原子を加え、欠損残基を補うことで自動的に前処理されていました。結合の親和性が記録され、GraphPad Prism(バージョン10.1.2)を使ってヒートマップが作成されました。Vinaスコアが最も低いリガンド-タンパク質複合体の三次元構造はChimeraXで可視化され、LigPlusで二次元相互作用図が作成されました。

YGP水抽出物製剤
YGPの漢方成分は伝統的な配合比率に従って調合され、例えば地黄(Shudihuang)の加工根24g、アウニトゥム・カルミカエリ(Fuzi)加工側根6g、シナモム・カッシア(Rougui)樹皮6g、対向側のディオスコリア(Shanyao)12g、Cornus officinalis(山珠魚)の果実9gが含まれます。 Cuscuta chinensis(Tusizi)の種子12g、Cervi Cornus Colla(Lujiaojiao)の加工角ゼラチン12g、Lycium barbarum(Gouqi)の果実12g、Angelica sinensis(Danggui)の根9g、Eucommia ulmoides(Duzhong)の樹皮12g。アコニトゥム・カルミカエリイとセルヴィ・コルヌス・コラを除くすべてのハーブは、蒸留水の合計重量の6倍に30分間浸され、一方でアコニトゥム・カルミカエリは蒸留水の6倍の重さに別々に浸されました。アコニトゥム・カルミカエリイはまず電気加熱装置で1時間摘出し、その後、Cervi Cornus Collaを除く残りのハーブを加え、各サイクル1時間にわたり2回摘出しました。その後、Cervi Cornus Collaは60〜70°Cの水浴で溶かされ、完全に溶解して抽出物に取り込まれました。冷却後、煮込み液は二層ガーゼでろ過され、アリクォート(約合)を用いて-20°Cで48時間冷凍し、凍温乾燥して粉末抽出物を得ました。

動物モデルと実験設計
オスのスプラグ・ドーリーラット(生後8週、体重200〜220g)は、特定の病原体のない環境で飼育され、12時間の明暗サイクルと自由な食物と水の利用が可能でした。1週間の順応後、ラットはランダムに3つのグループ(n=6群)に分けました:対照群、モデル群、YGP群です。慢性前立腺炎は3%カラギー^{ナン溶液の}前立腺内注射によって誘発されました。簡単に、ラットにはイソフルラン(誘導時3–4%、維持時1.5–2%)で麻酔され、前立腺を露出させるために腹部中央切開が行われました。前立腺の各腹葉に合計25μLの3%カラギナン溶液を注射しました。対照群は生理食塩水(生理食塩水)のみの前立腺内注射を受けました。術後ペニシリン(2.5 ×^{10 5} U/kg)を筋肉内投与で3日間投与しました。

煎じ液からYGP凍結乾燥抽出粉末を製製し、0.9%無菌の生理食塩水で再構成して経口ガベジ用の均一な懸液(10.54 g/kg/日)を得ました。YGP群のラットには経口YGP抽出物(10 mL/kg)投与され、対照群およびモデル群には0.9%の無菌生理食塩水の同等量が投与されました。4週間後、ラットはペントバルビタールナトリウム(50 mg/kg、腹腔内注射)で麻酔され、倫理ガイドラインに従い犠牲にされた前立腺組織を採取しました。

組織病理学的検査
前立腺組織は4%パラホルマルデヒドで24時間固定され、段階エタノール(アルコール75%で4時間、アルコール85%で2時間、90%アルコールで2時間、95%アルコールで1時間、絶対エタノールで1時間)で脱水され、キシレンでクリアされ、パラフィンに埋め込まれました。4–5μmの断片は標準手順²⁷に従いHE染色を受けました。簡単に、切片は脱硫、再水和、ヘマトキシリン染色、分化、エオシンによるカウンタースインメントが行われました。脱水とマウント後、切片は光学顕微鏡で観察され、組織病理学的評価が行われました。

組織病理学的炎症は、炎症細胞浸潤、線維芽細胞増殖、腺皮形態、分泌状態に基づく半定量的スコアリングシステムを用いて評価されました。炎症性細胞浸潤は0(浸潤なし)、2(軽度浸潤)、4(中等度浸潤)、6(重度浸潤)と評価されました。線維芽細胞増殖は0(欠如)、1(軽度)、2(中等度)、3(重度)と評価されました。扇胞の形態は0(大刺腔)、1(中程度に縮小した腔)、2(著しく縮小した)、3(扇窩閉塞または消失)と評価されました。分泌状態は0(豊富な分泌)、1(中程度の分泌)、2(分泌不足)、3(分泌不足)と評価されました。総組織病理スコアは4つのパラメータの合計として計算され、スコアが高いほど前立腺組織損傷や炎症がより重度であることを示し^ました。

エリサ
前立腺組織(100mg)は氷のように冷たいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄され、プロテアーゼ阻害剤を補足した溶解バッファーで均質化しました。ホモジネートは4°Cで30〜120分間培養され、5000 × g で4°Cで15分間遠心分離して上清液を採取しました。TNF-αおよびIL-6のタンパク質レベルは、製造元の指示に従ってELISAキットを用いて測定されました。標準試験とサンプルは96ウェルプレートに追加され、37°Cで培養され、その後ビオチン化抗体および酵素共役体による逐次培養が行われました。洗浄後、基質溶液を加えて色現し、反応は停止液で終了しました。吸収はマイクロプレートリーダーを用いて450nmで測定されました。サイトカイン濃度は標準曲線に基づいて計算されました。

qRT-PCR
全RNAはカラム法を用いて前立腺組織から抽出され、260nmおよび280nmの吸収を測定して純度を定量化しました。RNAサンプルは逆転写キットを用いて42°Cで15分間cDNAに逆転写されました。qRT-PCRは、以下の条件下でサーモサイクラーを用いて実施されました:95°Cで3分間の初期変性、その後95°Cで10秒、60°Cで30秒の40サイクルを行いました。本研究で使用されたプライマー配列は 補足表1に記載されています。蛍光信号はアニーリング/拡張工程で収集されました。TNF-αおよびIL-6の発現レベルは内部参照遺伝子GAPDHに正規化されました。相対的な遺伝子発現は2^−ΔΔCt 法を用いて計算されました。

統計解析
すべてのデータは平均±標準偏差(SD)として提示されています。統計解析はGraphPadプリズムソフトウェア(バージョン10.1.2)を用いて実施されました。解析前にデータ分布の正規性が評価されました。複数群間の差異は一方向分散解析(ANOVA)を用いて分析し、その後Tukeyの事後検定で複数比較を行いました。p < 0.05の値は統計的に有意とされました。

結果

バイオアクティブ成分および標的遺伝子の同定
YGP中に基準を満たす生体活性成分は合計126点(OB≥30%、DL≥0.18)が同定されました。208の予測標的遺伝子に対応します。GeneCardsデータベースは前立腺炎に関連する9,845の遺伝子を検出しました。ベン解析では、YGPの予測標的と前立腺炎関連遺伝子の間に180の重複遺伝子が存在し、これらの共通標的がYGPの前立腺炎治療効果を媒介している可能性を示唆しています(図1)。ハーブ成分ごとの分布(括弧内の値は各ハーブごとに特定された成分数を示しています)は以下の通りです:Angelica sinensisが貢献(3)、Eucommia ulmoides(26)、Aconitum carmichaelii(7)、Lycium barbarum(37)、Dioscorea opposita(12)、Corn...

ディスカッション

前立腺炎は、前立腺実質または間葉内に炎症細胞が増加することによって病理学的に定義されます^28,29。500万人以上の韓国人男性を対象に9年間追跡された研究で、キムらは多変量解析により前立腺炎が前立腺がんのリスクを有意に増加させることを確認しました³⁰。しかし、現在の臨床管理は限られており、特に非細菌性前立腺炎では治療選択肢が依然として最適とは言えません^31,32。この文脈で、植物療法介入は抗炎症効果と比較的良好な安全性プロファイルから注目を集めています。本研究では、ケルセチンがネットワーク薬理学解析を通じてYGPにおける主要な有効化合物の一つとして特定されており、これは^{炎症性疾患}における関連性を示す以前の報告と一致しています。分子ドッキング解析...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4%パラホルマルデヒド	ビヨタイム	P0099-3L
アルファフォールドタンパク質構造データベース	アルファフォールドタンパク質構造データベース	https://alphafold.ebi.ac.uk/
BeyoFast SYBR グリーンqPCRミックス(2倍)	ビヨタイム	D7260
バイオインフォマティクスオンラインプラットフォーム	バイオインフォマティクスオンラインプラットフォーム	http://www.bioinformatics.com.cn/
カラギーナン	オリリーフ	S30559
CB-DOCK2	CB-DOCK2	http://183.56.231.194:8001/cb-dock2/php/blinddock.php
サイトスケープ	サイトスケープ	https://cytoscape.org/
GeneCards(遺伝子カード)	GeneCards(遺伝子カード)	https://www.genecards.org/
ヘマトキシリンと嗜酸(H&E) 染色キット	ビヨタイム	C0105S
メタスケープ	メタスケープ	https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1
ニュートラルバルサム	サービスバイオ	WG10004160
パラフィンワックス(埋め込み用)	サービスバイオ	RP-15
プロテアーゼ阻害カクテル(100倍)	エピジム	GRF101
ラットIL-6 ELISAキット	ビヨタイム	PI328
ラットTNF-&α;キット	北京 4A バイオテック株式会社	CRE0003
RNAeasy動物用ロングRNA分離キット(スピンカラム付き)	ビヨタイム	R0026
ストリング	ストリング	https://string-db.org/
TCMSP	TCMSP	https://www.tcmsp-e.com/#/database
ユニプロット	ユニプロット	https://www.uniprot.org/