マウス皮質の深部経頭蓋画像のための頭部装着型光学透明頭蓋骨(HOTS)ウィンドウ

サマリー

このプロトコルは、最適化された2段階の頭蓋骨クリアリング手順に基づく、ヘッドマウント型光学透明頭蓋骨(HOTS)ウィンドウを記述します。この方法により、非常に透明な頭蓋骨が得られ、成マウスの大脳皮質を最大~800μmの深さまで二光子でイメージングすることが可能です。

要約

成体マウスの大脳皮質の高解像度二光子画像は、頭蓋骨からの光散乱によって大きく制限されており、これにより信号が減衰し、 生体内での画像深さが制限されます。頭蓋骨クリアリング法は、完全な頭蓋骨を通じて皮質への光学アクセスを可能にするために開発されていますが、実際の性能はクリア時間の限界と最適でないクリアリングカクテルによって制約されています。ここでは、ヘッドマウント型光学透過頭蓋骨(HOTS)ウィンドウを実装するための詳細なプロトコルを紹介します。この方法では、頭部に装着型キャップを用いて頭蓋骨に洗浄液を保持し、長時間の麻酔や身体的拘束を避け、目覚めたまま自由に行動するマウスが数時間にわたり頭蓋骨をクリアできるようにしました。さらに、試薬(HOTS-S1:10% wt/v EDTA、15% wt/v D-マンノース、10% wt/v スルフォラン、0.5% wt/v Tween 20;HOTS-S2:70% wt/v D-マンノース、5% wt/v スルフォラン、0.5% wt/v Tween 20) 体系的な化学スクリーニングにより最適化。頭蓋骨の露出と安定化、ヘッドマウントキャップの作成と取り付け、クリアリング試薬の投与と補充、そしてその後の画像診断準備を含む段階的なプロトコルを提供します。生後6週間のマウス(~20g)では、HOTSプロトコルが通常、皮質構造の2光子イメージングを可能にし、piaより下~~800μmの深さまで、開頭蓋骨ウィンドウに近い性能を持つ高度透明な頭蓋骨を生成します。HOTSウィンドウにより、Thy1-GFP-Mマウスでは構造イメージング、Thy1-GCaMP6sマウスでは機能的カルシウムイメージングが可能です。私たちは、HOTSウィンドウが便利で低侵襲的なアプローチとして、深部経頭蓋画像診断やオプトジェネティック、光薬理学的、その他の光を活用した操作を生 体内で大きく促進すると信じています。

概要

皮質ニューロンのバイタル内モニタリングは、脳の構造と機能を理解するために不可欠です^。二光子顕微鏡(TPM)はこのような生体内^研究の重要なツール^です。しかし、その画像品質と奥行きは、^4,5皮質の上に覆われた不透明な頭蓋骨からの強い光散乱によって大きく制約されています。

オープンスカル⁶および薄スティンドスカルウィンドウ^7,8は皮質への光学アクセスを大幅に改善し広く使われていますが、両者とも本質的な限界があります。開頭蓋骨の窓は急性脳損傷や炎症反応を引き起こす可能性があります ^9,10 に対し、頭蓋骨の薄化は技術的に要求が高く、均一な厚さを達成するのは困難です^11,12。

in vivoの頭蓋骨光学クリアリング技術は、成体マウスにおける軸索分解能による2光子イメージングを可能にする低侵襲の代替手段を提供します。しかし、実現可能なイメージング深度は依然として限られており(通常はpiaより150〜400μm下)、12,13,14,15。実際には、頭蓋骨クリアリングは通常、麻酔下での硬直頭部固定に短時間限定されており、頭蓋骨組成に対するクリアリングカクテルの体系的な最適化は^{12、13、14、15}の研究が十分に行われていません。

これらの制約を克服するために、私たちは以前、自由行動マウスの頭部装着型光学透明頭蓋骨(HOTS)ウィンドウを開発し、長時間オフラインでの頭蓋骨クリアリングをサポートします(図1A)¹⁶。このアプローチは、試薬(S1およびS2)を用いた2段階のクリアリング手順を用いており、前回の研究¹⁶で体系的な化学スクリーニングによって最適化されました。クリアリング試薬の体系的な最適化とクリアリング効果、可逆性、バイオセーフティ、HOTSウィンドウの in vivo イメージング性能の特徴付けは、我々の前回の研究¹⁶で報告されており、HOTS処理後に良好なアストログリウム応答を示しました。ここでは、成体マウスにおける深部経頭蓋2光子画像を可能にするためのHOTSウィンドウを設定するためのステップバイステッププロトコルを示します。代表的な準備では、画像深さはpiaより~800μmに達し、開頭蓋骨窓で達成可能な深度とほぼ一致します。HOTSウィンドウは、Thy1-GFP-Mマウスでの深部構造イメージングや、覚醒状態のThy1-GCaMP6sマウスにおける機能的カルシウムイメージングを可能にします。

プロトコル

すべての動物ケアおよび実験手順は、広東省動物ケア利用委員会の承認を受け、中国科学院深圳高等技術研究所動物実験倫理委員会の指針に従って実施されました。このプロトコルで使用される試薬および装置は 材料表に記載されています。

注:このプロトコルは、頭蓋骨の厚さ約100μmの6週間生後マウス(体重~20g)に最適化されています。

1. 頭蓋骨清掃液の準備

1. 頭蓋骨クリアリング溶液S1を準備します(10% wt/v EDTA、15% wt/v D-マンノース、10% wt/v スルフォラン、0.5% wt/v Tween 20;RI:1.38;最終pH:7.0-7.4)
   1. 重さは水酸化ナトリウム(NaOH)0.35gです。これを20mLの脱イオン水に入り、ビーカーに入れて完全に溶けるまでかき混ぜます。これにより溶液のpHが上がり、EDTAの溶解を促進します。
      注意:NaOHは腐食性があります。適切な個人用防護具(手袋、白衣、目の保護具)を着用し、化学煙幕の中で取り扱いましょう。
   2. NaOH溶液にエチレンジアミネテトラアセチン酸(EDTA)4gを加えます。ビーカーを40°Cの水槽に入れ、EDTAが完全に溶けるまで連続でかき混ぜます。
   3. 混合物を室温まで冷やします。溶液にD-マンノース6g、スルフォラン4g、トゥイーン20000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000室温ですべての成分が完全に溶けるまでかき混ぜます。
   4. 脱イオン水を加えて最終的な容量を40mLにします。よく混ぜてS1を得てください。
      注:S1は室温で数ヶ月間保存可能です。
2. 頭蓋骨クリアリング溶液S2を準備します(70% wt/v D-マンノース、5% wt/v スルホラン、0.5% wt/v Tween 20;最終 RI: 1.44; 最終pH: 7.0-7.4)
   1. Dマンノース28g、スルフォラン2g、Tween 2000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
   2. 脱イオン水を約30 mLに加え、室温ですべての成分が完全に溶解するまでかき混ぜます。
   3. 脱イオン水を加えて最終的な容量を40 mLにし、十分に混ぜてS2を得ます。
      注意:穏やかな加熱(25〜30°C)と連続攪拌はD-マンノースの溶解を加速させます。S2は室温で数ヶ月間保存可能です。

2. 手術準備

1. すべての手術器具をオートクレーブし、75%アルコールで作業スペースを徹底的に消毒してください。
2. マウスを腹腔内注射し、1%(w/v)ペントバルビタールナトリウム(体重20グラムあたり150–200μL)を投与します。
   注:他の可逆的麻酔薬はペントバルビタールナトリウムの代替として使用可能です。
3. 麻酔の深さをつまみ反射テストでモニタリングし、手術開始前にマウスが完全に麻酔されていることを確認してください。
4. ネズミを立体型フレームに入れ、イヤーバーで頭部を固定します。
5. 温熱パッドを使って体温を37°Cに保ちます。
6. 角膜乾燥を防ぐために両目に眼科軟膏を塗布してください。
   注意:麻酔の過剰投与や呼吸抑制を防ぐため、呼吸と反射を注意深く監視してください。

3. 手術とヘッドプレートの取り付け

1. 頭蓋骨曝露とクリーニング(図1Ba)
   1. 細かい鉗子と外科用ハサミを使って、頭蓋骨の背面全体にわたって頭皮を除去します。側頭筋の縁を露出させるために皮膚を外側にトリミングし、首筋に向かって後方を露出させます。
   2. 細かい鉗子を使って頭蓋骨表面から骨膜を優しく取り除きます。
   3. 湿った綿先のアプリケーターで頭蓋骨表面をきれいにし、優しい風で頭蓋骨を乾かします。
   4. 大脳皮質の機能領域の正確な位置特定が必要な場合は、立体視装置を使って頭蓋骨表面に1 mm間隔の基準点をマークします。
2. デンタルセメントとヘッドプレートの塗布(図1Bb)
   1. メーカーの指示に従って歯科用セメントを準備してください。安定した接着を確保するために、接着力が強く耐久性が高く、長期固定に適した歯科用セメントが推奨されます。
   2. 露出した頭蓋骨表面や周囲組織に薄く歯科用セメントを塗布し、クリアウィンドウの部分はコーティングせずに残します。
      注意:歯科用セメントの粉末成分と液体成分を1:1の体積比率で混ぜた後、セメントが爪楊枝の先端に付着するまで約10秒待ってから塗布してください。これにより車体の流動性が低下し、ハンドリングが向上します。施工中は、周囲から指定されたクリアリングウィンドウに向かってセメントを塗布し、窓の部分は完全にセメントを残さずに保ちます。クリアされた領域は、頭蓋骨表面のシーラント(歯科用セメントと柔らかいライナー材料)の境界によって定義されます。したがって、その大きさは調整可能ですが、頭蓋の縫合糸やキャップの大きさによって制限されます。一方の半球での一般的な適用では、クリアされた領域は通常直径約3~5mmです。
   3. 小型チタン製のヘッドプレート(後の画像診断時にカスタムホルダーに固定するため)をデンタルセメントで頭蓋骨に固定します。
      注意:ヘッドフィクションには異なるヘッドプレートのデザインが使われます。この研究では、市販のヘッドプレートとカスタムの2穴チタンプレートの両方が成功裏に使用されました。設計に関わらず、ヘッドプレートはその後の撮影に十分な機械的安定性を提供し、意図されたクリアリングや撮影ウィンドウを妨げてはなりません。

4. HOTSウィンドウの作成

1. 自己硬化型の歯科軟着ライナー素材で頭蓋骨を密封します(図1Bc)。
   1. デンタルセメントが約5分間完全に硬化した後、クリアリングウィンドウ部分を除くセメント層を薄く自己硬化する軟着ライナー材で覆い、頭蓋骨全体に連続したシールを形成します。
      注意:柔らかいライナー素材は密閉性を高め、クリアリング試薬への長時間曝露時の漏れを抑えます。
   2. 自己硬化型のデンタル用ソフトライナー素材を、計画されたクリアウィンドウの周りに滑らかに成形し、キャップの平らなシーリング面を作ります。
2. キャップの取り付け(図1Bd)
   1. 使い捨てプラスチックピペット(ポリエチレン、PE)のヘッドを切り取り、上部が閉じて底が開いた小さな円筒形のキャップを作ります。PEは優れた化学的安定性を示し、クリアリング過程でS1またはS2クリアリング溶液との目に見える分解や反応はありません。
      注:1mLのトランスファーピペットバルブのヘッドから切り取られるキャップは通常、直径~12mm、高さ~10–14mmです。
   2. キャップを指定されたクリアウィンドウの部分に当て、柔らかいライナーの素材に優しく押し付けます。
      注意:キャップはクリアされた部分より大きく、クリアエリアに使われていない頭蓋骨の下の一部は、クリアリングを防ぐために歯科用シーラントを塗布できます。
   3. キャップの底部に追加の柔らかいライナー素材を貼り、キャップと頭蓋骨の接合部を完全に密閉します。
   4. 1mLの注射器に26Gの針を使い、キャップ壁に1つ以上の小さな穴を開けて、注入と除去液の抽出のためのポートとして使います。
   5. 柔らかいライナー素材を完全に硬化させてください。キャップがしっかり取り付けられ、インターフェースに目に見える隙間がないか確認してください。
   6. ネズミを立体走行フレームから取り出し、麻酔が完全に回復するまで温かいケージに入れます。
      注意:ここは適切な停止地点です。歯科用セメントと柔らかいライナー素材が完全に硬化した後に頭蓋骨クリアリングの施術を行います。当院では、HOTSウィンドウは午後に設置し、手術から完全に回復した後の翌朝に頭蓋骨クリアリングを行います。または、HOTS窓の設置から約15分後に頭蓋骨クリアリングを開始することも可能です。HOTS窓の設置中、骨膜は除去されますが、頭蓋骨は構造的に無傷のままです。

5. 覚醒した自由行動マウスの頭蓋骨クリアリング

注意:クリアリングフェーズ中、ネズミは起きていて自由にケージ内で行動します。溶液注入とヘッドマウントキャップからの交換には短時間のイソフルラン麻酔のみを使用してください。

1. S1の初期負荷
   1. マウスを誘導チャンバーに入れ、3〜4%のイソフルランを空気中に300〜500 mL/分の流量で短時間麻酔を誘導し、マウスが動けなくなるまで続けます。維持麻酔は適用されませんでした。
   2. マウスを優しく拘束し、ヘッドマウントキャップを手で安定させます。
   3. 1 mLの注射器と26Gの針を使い、頭部装着型キャップに約1 mLのS1をゆっくりと注入します。
   4. ネズミをホームケージに戻し、S1が頭蓋骨に2時間作用させます。
      注意:S1とS2の孵化期間中は、ネズミを個別に標準的なケージに入れて飼育してください。
2. リフレッシュするシーズン1
   1. 初期S1ローディングから2時間後に、再びイソフルランで短時間麻酔します。
   2. キャップから1mLの注射器でS1を吸引します。
   3. キャップに1mLのシリンジで新鮮なS1を補充してください。
   4. マウスをケージに戻し、S1にさらに2時間の間動かせます。
   5. 初期負荷から4時間後にステップ5.2.1–5.2.4を繰り返し、2回目のS1置換を行います。
   6. 2回目の置換後は、S1の作用を続け、合計6時間のS1曝露時間に達するまで待ちます。
      注:このプロトコル(1 mL S1 6時間投与)は生後6週のマウス(~20 g)に最適化されています。頭蓋骨が厚い高齢動物では、S1の潜伏期間が段階的に延長されることがあります。いかなる調整も、過度な頭蓋骨軟化を防ぐために動物福祉の綿密なモニタリングと最終画像検査の品質を伴う必要があります。
3. S2の応用
   1. S1治療を6時間後、短時間イソフルランでマウスを麻酔します。
   2. キャップから1mLの注射器でS1を吸引し、代わりに0.7mLのS2を投与します。
   3. マウスをケージに戻し、S2が頭蓋骨に1時間作用させて透明度を高め、屈折率のマッチングを行ってください。
      注:このような条件下では、S1とS2のクリアリングフェーズを合わせたものは通常7時間以内に完了します(S1 + S2 6時間 + 1時間)。クリアに成功した場合、出血のない透明な頭蓋骨表面が目に見えることを示します。頭蓋骨はクリア後にわずかに柔らかくなることがあります。細かい鉗子で優しく触れると、軽度の順服を示しつつ構造的には無傷であるべきです。頭蓋骨表面への過度な圧力は避けてください。

6. 画像準備

1. 麻酔と頭部固定による画像診断
   1. S2培養終了時に、1%(w/v)のペントバルビタールナトリウムを150–200 μL/200 μLの腹腔内注射でマウスを麻酔します。
   2. 足のつまみ反射テストで十分な麻酔を確認しましょう。
   3. チタン製のヘッドプレートをカスタムデザインのヘッドホルダーにネジで固定して、マウスのヘッドを固定します。
   4. 画像検査中の乾燥を防ぐために両目に眼用軟膏を塗布してください。
   5. 温熱パッドを使って体温を~37°Cに保ちます。
2. クリアされた頭蓋骨表面の露出(図1Be,Bf)
   1. キャップからS2溶液を注射器で吸引します。
   2. 細いハサミでプラスチックキャップを慎重に切り、鉗子で取り除き、頭蓋に過度な力をかけないようにしてください。
   3. クリアウィンドウを囲む柔らかいライナーの素材を優しく剥がし、クリアした頭蓋骨部分を完全に露出させます。
   4. 画像診断時に、透明化した頭蓋骨に少量のS2溶液を直接塗布し、屈折率を合わせる浸漬培地として作用します。
      注:本研究では標準的な水浸物レンズを使用し、16×/NA 0.8の対物レンズ(N16XLWD-PF、ニコン)および25×/NA 1.1の対物レンズ(N25X-APO-MP、ニコン)が含まれます。S2を浸漬媒体として使用する際は、球面収差を減らすために、対物レンズの補正カラーを利用可能な場合、S2の屈折率に適した設定に調整してください。ここでの実験では、クリアされた頭蓋骨は約2時間の二光子画像撮影に十分な光学的明瞭さを維持し、樹状棘の観察中に明らかな画質の劣化はありませんでした。約2日後、さらなる画像検査のために再クリアリングが必要となり、再クリアリング時間は初期クリアリングよりも大幅に短くなり、同じ動物から効率的な繰り返し画像撮影が可能となりました。
3. 覚醒ヘッド固定イメージング(オプション)
   注意:覚醒時のイメージングでは、実験前にマウスを頭部固定に慣れさせてください。短時間イソフルランでマウスを麻酔し、埋め込みしたヘッドプレートを1回のセッションで15〜30分間ホルダーに固定し、これを2〜3日間繰り返します。
   1. 取り扱いを容易にするために短時間のイソフルラン麻酔を使いましょう。埋め込みされたヘッドプレートだけをホルダーに固定し、体が走行車やプラットフォーム上で自由に動けるようにします。
   2. 6.2.1–6.2.4の手順に従って、クリアされた頭蓋骨表面を露出し、画像診断前にS2を塗布します。

7. 回復

1. 画像診断後、頭蓋骨表面から残留するS2溶液を優しく吸引し除去します。
2. クリアされた頭蓋骨部分をリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で数回洗い流し、頭蓋骨の本来の不透明状態の徐々の回復を促進します。
3. 頭蓋骨や周囲組織の残留液体を無菌綿棒で優しく乾燥させ、骨への機械的損傷を防ぎます。
4. 動物をその後の実験のために生かしておく場合は、生存期間中に骨を保護するために、頭蓋骨の窓に生体適合性シーラントであるクイックキャスト(WPI)を塗布します。
5. 保護層が完全に硬化するまで待ってください。
6. マウスをヘッドホルダーから外して、温かいケージに入れます。動物が麻酔から完全に回復するまで観察し、その後元のケージに戻してください。

結果

このプロトコルに従い、ヘッドマウント型の光学透明頭蓋骨(HOTS)ウィンドウは、成体マウスの頭蓋骨の完全性を保ちつつ、深部経頭蓋2光子画像化を可能にします。準備の成功は、2つの重要な結果によって示されます。(1) 皮質血管がクリア時に頭蓋骨を通して明確に見える(図1Bf)、(2) クリアされた頭蓋骨に軽い凹みが現れ、効果的な脱石作用とコラーゲンの緩みを示します。HOTSウィンドウは、毛細血管出血を防ぐために、無傷の頭蓋骨の上に位置し、縫合線から離れて設置する必要があります。これはHOTSウィンドウ破損の一般的な原因です。もう一つの一般的な故障モードは、適切に密封されていないキャップとソフトライナーの材料界面からの除去試薬の漏れで、透明性が完全に失われることです。

光学クリアリング効果を評価するために、異 域 および 体内での透明性の進行的改善を検証しました。分解能ターゲットに頭蓋骨片を置...

ディスカッション

HOTS法は、頭部に装着した光学的透明頭蓋骨(HOTS)ウィンドウを利用し、クリアリング試薬を収めたキャップと2段階の頭蓋骨クリアリング手順を組み合わせ、成体マウスの頭蓋骨の透明性を高めつつ頭蓋骨の完全性を維持します。標準プロトコル(6週齢マウスではS1に6時間、S2で1時間)では、得られたウィンドウは深部経頭蓋2光子イメージングを信頼性高く支持し、PIAより~800μm下の構造を可視化可能にしました。

安定した透明なウィンドウを得るためには、いくつかの手続き的ステップが重要です。頭蓋骨は清潔かつ乾燥しており、頭皮と骨膜は慎重に除去して、歯科セメントが骨にしっかり密着し、その後の画像検査時にヘッドプレートをしっかりと固定します。セメント層は露出した骨と周囲の組織を覆い、硬い基盤を形成します。その後、歯科セメントや窓周辺に薄く自己硬化するデンタル軟着ライナーの層を塗布し、後のクリアリング試薬の漏れを防ぎます。HOTSウィンドウは可能な限り頭蓋縫合から離れた場所に設置すべきです。縫合糸の上を直接クリアすると毛細血管出血...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1mL使い捨てピペット	北京バイオトップ 科学  &技術 株式会社	該当なし
デンタルセメント	上海榮翔歯科材料有限公司	該当なし
D-マンノース	マックリン	D813082
EDTA	アラジン	エル16428
イソフルラン	後輪駆動	該当なし
クイックキャスト	WPI	該当なし	生体適合性のシーラント
ナオ	マックリン	S832169
自己硬化    歯科     ソフトライナー素材	ヤンマフ・バイオテクノロジー(ヘビ)株式会社	該当なし
ペントバルビタールナトリウム	バイオパイク	該当なし
立体誘導装置	後輪駆動	該当なし
滅菌使い捨て注射器	ミナンク	該当なし	1 mL;26G針
サルフォラン	マックリン	S817950
Thy1-GFP-Mマウス		該当なし	提供 楊湛教授著
Thyl-GCaMP6s ネズミ	ジャクソン研究所
トゥイーン20	シグマ・ヴェテック	V900548
水没の目的	ニコン	N25X-APO-MP	25×/NA 1.1 目的
水没の目的	ニコン	N16XLWD-PF	16×/NA 0.8 objective