光学回折断層撮影を用いたリアルタイムラベルフリーイメージングおよびマクロファージ形態動態の定量解析

サマリー

このプロトコルは、マクロファージ形態動態のリアルタイムイメージングおよび定量解析のためのラベルフリーの光学回折断層撮影ベースのワークフローを記述しています。この手法は単細胞の形態と移動を継続的に追跡し、長期のライブセルイメージング中に予測される面積、周囲、平均移動速度の時間分解測定を提供します。

要約

本研究は、マクロファージの時間依存的な形態変化を観察するための、ラベルフリーの光学回折断層撮影(ODT)に基づくワークフローを生細胞画像および解析に確立します。この手法は、安定した環境条件下で長期間にわたる単一細胞の形態や移動の連続記録を可能にし、予測面積、周囲、平均移動速度などの定量的パラメータの抽出を可能にします。このワークフローは、外因的標識を用いずに単一細胞レベルで動的な細胞挙動を捉える実用的なアプローチを提供します。RAW264.7マクロファージをモデルとして、リポ多糖刺激下でバイカリン前処理を用いてタイムラプスイメージングを行い、異なる条件下での動的な細胞変化を捉えました。代表的な細胞が選定され、追跡および定量解析が行われました。結果は、このワークフローが安定した長期単一細胞追跡をサポートし、細胞形態や運動性の時間的変化を反映していることを示しています。このアプローチは、異なる刺激に対する動的な細胞挙動を観察するためのラベルフリーの方法を提供し、従来のエンドポイントベースのアッセイを補完する有用な手段となります。また、細胞形態動態の研究において他の接着細胞タイプにも応用可能である可能性があります。

概要

マクロファージは自然免疫応答や組織の恒常性において中心的な役割を果たし、その機能状態は微小環境刺激に応じて動的に変化します。伝統的に、マクロファージは炎症促進または抗炎症・修復関連の表現型を採用すると説明されてきました^1,2。しかし、増え続ける証拠により、マクロファージ活性化は離散的な二元状態ではなく連続的かつ可塑的なプロセスであることが示唆されています3,4。異なる刺激の下で、マクロファージは時間とともに徐々に変化し、細胞形態や移動行動の変化も伴います⁵。したがって、単一細胞レベルでの形態的および移動的変化の時間分解は、動的な細胞応答の研究に重要なアプローチを提供します。

現在のマクロファージ状態の研究手法は主に免疫染色、フローサイトメトリー、トランスクリプトミックまたはプロテオミクス解析に依存し^{ています。}これらの手法は通常、固定サンプルまたは離散的な時間点に基づいており、^{ライブ条件下7}で同一セル内の連続的な変化を追跡する能力が制限されます。蛍光ベースの生細胞イメージングは動的観察を可能にしますが、長期実験中に光毒性や光漂白の影響を受ける可能性があります^8,9。光学回折断層撮影(ODT)は、細胞の三次元屈折率分布を再構築し、定量的な^{構造情報を提供する}ラベルフリーイメージング技術です。ODTは外因的標識を必要としないため、長期のライブ細胞イメージングに適しており、細胞挙動への摂動を低減します。近年、ODTはさまざまな^{細胞モデルの}動的研究に応用されており、これまでの研究は主にイメージング能力と構造特性評価に焦点を当てていました。これに対し、本研究は定義されたin vitro刺激条件下でのマクロファージ形態動態の長期かつ時間分解された単一細胞解析のための標準化されたラベルフリーワークフローを確立します。

このワークフローは、 in vitro のRAW264.7マクロファージモデルを用いて、リポ多糖(LPS)刺激とバイカリン(BAI)前処理を用いて実証されています。BAIは、ワークフローを示すための定義された条件を確立するための代表的な実験変調器として使用されました。連続イメージングにより、予測面積、周囲、平均移動速度などの定量的な単一細胞パラメータを抽出し、形態的および行動的変化を時間的に解析することが可能になります。このアプローチは、機能状態や極化を定義するのではなく、動的な表現型変化の記述的分析を提供することを意図しており、時間的情報を提供することでエンドポイントベースのアッセイの補完的な手法として機能する可能性があります。このモデルシステムではワークフローが検証されており、他のアディアラントセルタイプにも応用可能です。

プロトコル

1. マクロファージ培養

注意:すべての手順は、実験用手袋と白衣を着用した状態でバイオセーフティキャビネット内で行ってください。

1. 全培養培地(高グルコースのDulbecco's modified Eagle medium(DMEM)に胎児用牛血清(FBS)10%とペニシリン・ストレプトマイシン1%を補足)を準備します。
2. RAW264.7マクロファージのバイアルを37°Cの水浴で1分未満解凍します。
3. 細胞懸濁液を高グルコースDMEMに移し、10%のFBSと1%のペニシリン・ストレプトマイシンを補足します。
4. 遠心分離機で300 × g で5分間加熱します。
5. 上清液は捨てる。
6. 細胞を新鮮な完全な培地に再懸浮させます。
7. 種細胞を60mmの皿に分け、皿ごとに2〜5個の⁵ 個×10個ずつ。
8. 細胞を37°Cで5%のCO₂で培養します。
9. 解凍後12〜24時間以内に培地を変えないでください。
10. ミディウムは2〜3日に一度交換してください。
11. 逆立顕微鏡を使って細胞の形態を観察します。
12. 80〜90%のパスセージセルは穏やかなピペッティングで合流します。
    注意:トリプシンの使用は避けてください。6番から18番の細胞を使用します。実験には形態が均一で空化がない細胞を選択します。細胞株はSTRプロファイリングで認証され、品質管理検査を受けました。詳細な報告書と英語の要約は補足ファイルに掲載されています。

2. 細胞治療

1. 対数成長段階の細胞は優しいピペッティングで採取します。
2. 細胞を完全な培地に再懸濁させます。
3. セルカウンターを使ってセル密度を測定します。
4. 細胞密度を4 ×^{10 4} cells/mLに調整します。
5. 各35mm皿に2mLの細胞懸濁液を種子化します。
6. 料理を2つのグループに割り当てます:(i) LPSグループ、(ii) BAI + LPSグループ。
7. 細胞を37°Cで5%のCO₂で12〜16時間培養します。
8. DMSOで50 mM BAIストック溶液を準備します。BAIのストック溶液は−20°Cで保存します。
9. BAIをBAI+LPS基に最終濃度100μMに加え、BAIストック溶液を直接培養培地で希釈して最終作業濃度を得ます。
10. LPSグループに同量のDMSOを加えます。
11. LPSストック溶液(1 mg/mL)を完全な培地で準備します。
12. 両基にLPSを加え、最終濃度1 μg/mLにします。LPSストック溶液を直接培養培地で希釈し、最終的な作業濃度を得ます。
13. すぐに画像撮影に進み、画像検査中は培地を変えないでください。

3. 光学回折断層撮影

1. ODTイメージングシステムを起動し、環境制御モジュールを起動してください。
2. ステージ温度を37°Cに設定します。
3. CO₂濃度を5%に設定してください。
4. システムを少なくとも20分間は平衡させてください。
5. 取得ソフトを開きます。
6. 培養皿をイメージングステージに置きます。
7. セルの位置を特定するには60倍の対物レンズ(NA = 1.42)を使いましょう。
8. 画像診断のために境界が明確な単離細胞を選択します。
9. 撮影間隔を8分に設定してください。
10. フレーム数を181に設定してください。
11. タイムラプス撮影中にピントを合わせるためのオートフォーカス機能を有効にしてください。
12. タイムラプスの取得を開始してください。
13. 取得時のシステムの安定性を監視してください。
    注:焦点のずれを最小限に抑えるために、実験全体を通じてオートフォーカス安定化が適用されました。

4. 画像再構築と定量解析

1. 画像取得後、ソフトウェアは自動的に画像再構成を実行します。
2. 標準の組み込みアルゴリズムを使用しています。
3. 進行バーが完成するまで待ちましょう。
4. 解析ソフトウェア(Intellyseg、v2.1.0)を開いてください。
5. 生データセットをインポートするには「Import RAW Data」を選択してください。
6. ターゲットフォルダを閲覧しています。
7. ターゲットファイルを選択し、データセットをインポートします。
8. 「セル」をクリックすると、データセット間で一貫した設定で自動セグメンテーションを行います。¹³。
9. 以下の基準に基づいてセルを選択する:(i) 隣接セルと重複しない、(ii) 画像境界と接触していない、(iii) 時系列全体を通じて継続的に追跡可能であること。
10. データセット間で一貫した分析のために、視野ごとに固定数のセル(n = 8)を選択します。
11. 「長期追跡」モジュールを開きます。
12. ここでスタートフレームとエンドフレームが登場します。
13. 「Track」をクリックするとトラッキングを開始します。これは連続するフレーム^間のセル位置の一貫性に基づいています。
14. 軌道の連続性を確保するために、トラッキングエラーを手動で修正してください:(i) 誤ったマスクを右クリックして「アイテムを削除」を選び、(ii) 「手動セグメンテーション」を開く、(iii) 「セル」を選択して「追加」をクリック、(iv) 「クリック」または「ボックス」を使って正しいマスクを追加する。
15. 「エクスポート」をクリックし、「データエクスポート」を選択してください。
16. 「ビデオエクスポート」を選択し、出力要素を選択します。
17. ここで開始と終了のフレームが登場します。
18. セーブパスとファイル形式を選択してください。
19. 「OK」をクリックして動画をエクスポートしてください。
20. 「エクスポート」をクリックし、「チャートシステム」を選択してください。
21. 「トラックチャート」を選択してください。
22. 「セル」をセグメンテーションカテゴリとして選びます。
23. ここでトラッキングフレームレンジの登場です。
24. 出力パラメータ(例:面積、周囲)を選択します。
25. 「画像またはExcelをエクスポート」をクリックしてファイルを保存してください。
26. 時系列全体にわたる重心変位に基づいて、各セルの平均移動速度(μm/h)を計算します。

5. データ提示

1. 定量的な測定は記述的に提示されます。統計的推論は行われませんでした。各処理群には5つの独立したサンプルが含まれていました。
   実験ワークフローの概要は 図1に示されています。主要な試薬、計測機器、ソフトウェアは 材料表に記載されています。画像診断条件は 表1にまとめられています。

結果

ODTベースのワークフローの性能を評価するため、2つの処理群(LPSおよびBAI + LPS)に対してタイムラプス画像化を行い、各グループに5つの独立したサンプルを用いました。すべてのサンプルは同じ画像条件下で取得されました。長期的な単一細胞追跡および定量解析に伴う多大な作業量のため、各グループから代表的なサンプルが1名選ばれ、単一細胞解析および可視化が行われました。結果は記述的に提示されており、統計的推論を目的としたものではありません。

タイムラプスの形態動態

タイムラプスODTイメージングにより、この手法が単細胞形態変化の連続記録を可能にすることが示されました(図2)。分析されたサンプルに対応する代表的なタイムラプス動画は 補足ビデオ1 (LPS、サンプル1)および 補足映像2 (BAI + LPS、サンプル1)に提供されており、完全なデータセット(各グループのサ...

ディスカッション

本研究は、単一細胞レベルでのマクロファージ形態動態の連続イメージングおよび定量解析のためのラベルフリーODTベースのワークフローを確立します。この手法により、長期のライブセルイメージング中に予測される面積、周囲、平均移動速度の時間分解測定が可能になります。細胞シーディング密度は、セグメンテーションや追跡性能に影響を与える重要な要素です。高密度は重なり合うセルを生み、低密度は解析可能なセルの数を減らします。したがって、画像診断前にシーディング条件を最適化する必要があります。画像間隔は、時間的解像度、データ量、長期的な細胞追跡の連続性のバランスを取るための予備実験に基づいて決定されました。区間が短いほど時間的解像度は向上しますが、データサイズや光毒性リスクも高まります。一方、区間が長い場合は動的変化を捉える能力が低下する可能性があります。

長期的な取得には安定した環境条件が必要です。実験中は温度、CO₂濃度、最小限の機械的攪乱を維持する必要があります。オートフォーカス安定化も、長時間の撮影時に焦点のずれを最小限に抑える...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ODTイメージングシステム	Pellucid Optics	MH-PanoView	ラベルフリーのライブセルイメージングに使用
取得ソフトウェア	Pellucid Optics	Lucida-Pano v2.1.0	イメージ取得に使用
解析ソフトウェア	Pellucid Optics	Intellyseg v2.1.0	イメージ再構成、セグメンテーション、追跡に使用
RAW264.7	Wuhan Zishan Biotechnology	STCC20020P	in vitroの極性化とイメージング実験に使用されるマウスマクロファージ細胞株
バイカリン (BAI)	Shanghai Yuanye	JB246114	細胞前処理に使用
リポ多糖 (LPS)	Solarbio	L8880	マクロファージを刺激するために使用
DMEM培地	Gibco	C11995500BT	細胞培養培地
ウシ胎児血清	Procell	164210	細胞培養用サプリメント
ペニシリル＆ndash;ストレプトマイシン (100x)	Procell	PB180120	細胞培養用抗生物質
60 mm培養皿	Corning	CLS430166	細胞培養に使用
35 mmガラス底皿	Cellvis	D35-10-1.5-N	ODTイメージングに使用
倒立顕微鏡	OLYMPUS	CKX53	通常の細胞観察と培養中のモニタリングに使用
セルカウンター	RWD Life Science	C100	細胞密度決定に使用