ヒトトランスクリプトミックデータの統合バイオインフォマティクス解析は、肺腺癌における3つの主要な診断および予後バイオマーカーを特定します

Summary

本研究は、TCGA-LUADおよびGEOのトランスクリプトミクスデータを用いて肺腺癌の診断および予後バイオマーカー GSE115002同定しました。 B3GNT3、 FERMT1、 SPP1 は上位調節され、腫瘍と正常組織を区別しました。これらの遺伝子は上皮-間葉系転移および免疫抑制に関連しています。遺伝子発現とTNM期を組み合わせたノモグラムでは、信頼できる予測価値が示されました。

Abstract

肺腺癌(LUAD)は、世界でがん関連死の主な原因です。手術、標的治療、免疫療法の進歩にもかかわらず、高度なLUADの5年生存率は20%未満であり、早期発見と予後のための信頼できる分子バイオマーカーの緊急性を示しています。本研究では、著者らは、3つの一貫して上型調節されている遺伝子がLUADの効果的な診断および予後バイオマーカーとして機能する可能性があると仮説を立てました。著者らは、TCGA-LUAD(腫瘍535例、正常サンプル59例)およびGSE115002(腫瘍52例、正常サンプル52例)の2つの独立したコホートのトランスクリプトミックデータを解析し、発現遺伝子の差異をスクリーニングしました。3つのコア遺伝子、B3GNT3、FERMT1、SPP1は両データセットのLUAD腫瘍で一貫して過剰発現を示していました。これらの遺伝子は優れた診断性能を示し、TCGA-LUADではAUC値が0.95を超え、GSE115002では高い精度を示しました。生存分析により、各遺伝子の高い発現は全体および無疾患生存期間の短縮に有意に関連しており、多変量Cox回帰分析によりそれらの独立した予後価値が検証されました。機能豊か化解析により、これら3つの遺伝子は上皮-間葉質転移、細胞外マトリックスリモデリング、免疫抑制に関与しており、いずれもLUADの侵襲および転移と密接に関連していることが示されました。著者らはさらに、3つの遺伝子とTNM期を組み合わせた予後ノモグラムを構築し、コンコーダンス指数0.743を達成し、良好な予測性能を示しました。これらの発見は、B3GNT3、FERMT1、SPP1がLUADの診断および予後バイオマーカーとして有望であり、リスク階層化および管理における臨床応用を支持していることを裏付けています。

Introduction

肺がんは世界のがん死亡率の主な原因であり、2020年には約180万人の死亡を招い^{ています。}肺腺癌(LUAD)は全肺がん症例の約40%を占めています²。手術、標的治療、免疫療法の進歩にもかかわらず、進行したLUADの5年生存率は依然として20%未満のままです^3,4。早期発見と正確な予後のための信頼できる分子バイオマーカーが緊急に求められています。ハイスループットシーケンシングや、がんゲノムアトラス(TCGA)や遺伝子発現オムニバス(GEO)などの公開データベースにより、がんの系統的なトランスクリプトミックプロファイリングが可能^{となります。}統合的クロスコホートバイオインフォマティクスは候補バイオマーカー発見の信頼性を向上させる⁵.

細胞増殖、EGFRシグナル伝達、免疫逃逸7など、多くの遺伝子や経路がLUADに関与^{していることが示}されています。しかし、臨床応用に翻訳されたものはほとんどありません。遺伝子シグネチャーと臨床病理学的特徴、特にノモグラムを組み合わせたリスクモデルは、LUAD⁸の予後精度を向上させます。 B3GNT3、 FERMT1、 SPP1 は個別にがん進行に関連していますが、LUADにおける診断、予後、免疫微小環境調節の複合的価値は独立したコホート間で体系的に検証されていません。本研究は、これら3つの遺伝子を統合したクロスプラットフォーム解析として初めてLUADの統合バイオマーカーパネルとして提供し、臨床的に応用可能な予後ノモグラムを提供します。

B3GNT3はPD-L1を安定化し免疫回避を促進するグリコシルトランスフェラーゼをコードしています(^9,10)。FERMT1(キンドリン-1)はインテグリンの活性化を調節し、非小細胞肺がん(NSCLC)における転移を促進します^11,12。SPP1(オステオポンチン)は細胞外マトリックスの再構築、上皮-間葉転換(EMT)、および化学抵抗性を媒介します 13,14,15。概日リズムに関連する遺伝子はLUADの予後と診断を予測することも示されており、¹⁶は多オミクス統合タンパク質シグナルネットワークを通じてLUADの性差も明らかに^{されています。}B3GNT3およびSPP1は分泌または膜局在であり、低侵襲バイオマーカーとしての利用を支持します。LUADの分類やバイオマーカーの同定は、重複する特徴^{選択手法を通じて}も達成可能であり、多重オミック相互作用は肺がんの進行において重要な機能的役割を果たし^ます。包括的なマルチオミクス統合によって特定されたミトコンドリア遺伝子シグネチャーもLUAD予後や個別化治療に価値があります²⁰。B3GNT3およびSPP1は分泌または膜局在であり、低侵襲バイオマーカーとしての利用を支持します。本研究は統合バイオインフォマティクスを用いて堅牢なLUADバイオマーカーを特定し、その診断および予後性能を評価し、生物学的機能と免疫関連を探求し、臨床的に有用な予後ノモグラムを構築することを目的としました。

Protocol

1. データソースと前処理

1. R(バージョン4.1.3)で生データを処理;Windows 10 Pro)。
2. GSE115002については、Limma(バージョン3.52.3)を用いて分位元正規化を適用します。
3. TCGAの低発現遺伝子をフィルターしてください:CPMが0.5の遺伝子を>50%のサンプルで保持します≥。
4. GSE115002の低発現遺伝子をフィルタリング:平均シグナル>50の遺伝子を保持する。
5. log₂擬似カウント+1の式の値を変換します。
   注:LUAD遺伝子発現および臨床データは、TCGA-LUAD(バージョン33.0、GDCポータル、2025年8月7日ダウンロード)およびGSE115002(Agilent microarray、GEO、2025年8月7日ダウンロード)から取得されました。TCGA-LUADは535件の腫瘍と59件の正常サンプルを含みました。GSE115002 52の腫瘍と52の適合した正常サンプルが含まれていました。

2. 差異発現遺伝子の同定

1. TCGA RNAセクシークセイクにはDESeq2(バージョン1.36.0)、GSE115002にはLIMMA(バージョン3.52.3)を用い、差別発現解析を行います。ベンジャミニ・ホッホバーグ法を用いて調整済みP値(FDR)を計算します。
2. データセット間の比較可能性を確保するために、統一された|log₂FC|≥1.0は両コホートに適用されました。DEGはFDR < 0.05および|log₂FC|≥ 1.0。重複するDEGはVennDiagram(バージョン1.7.3)を用いて特定されました。 B3GNT3、 FERMT1、 SPP1 は、がん関連性が知られている一貫して上位調節されている候補として選ばれました。

3. 診断価値の評価

1. 各候補遺伝子に対してROC曲線を構築します。
2. ユーデン指数を使って最適なカットオフ値を決定します。
3. 各遺伝子のAUC、感度、特異度を計算してください。
4. 多変量ロジスティック回帰を用いて統合診断パネルを構築します。
   注:ROC解析にはpROCパッケージv1.18.0が使用されました。二項族を持つglm関数を用いて診断モデルを構築しました。

4. 生存分析

1. 中央値発現を用いて患者を高発現群と低発現群に階層化します。
2. 各遺伝子に対してカプラン–マイヤー生存曲線を生成します。
3. 生存差を比較するためにログランク検定を行います。
4. 単変量コックス回帰解析を実施します。
5. 多変量コックス回帰解析を実施してください。
6. 回帰モデルに臨床共変量を含めること。
7. シェーンフェルド残差を用いて比例ハザード仮定を検証します。
8. 3遺伝子リスクスコアを計算します。
   注:Survival v3.3.1およびsurvminer v0.4.9が使用されました。共変量には年齢、性別、Tステージ、Nステージ、Mステージが含まれていました。リスクスコアは次のように計算されました:
   リスクスコア = (0.328 × B3GNT3) + (0.331 × FERMT1) + (0.321 × SPP1)(1)

5. 遺伝子セットの豊かさと機能注釈

1. DEGを用いたGO濃縮解析を行います。
2. DEGを用いたKEGG経路濃縮解析を行います。
3. 遺伝子セットリッチ解析(GSEA)を実施します。
4. 候補遺伝子発現とピアソン相関による遺伝子の順位付け。
5. 調整済みP < 0.05を用いて有意な項を特定します。
   注:clusterProfiler v4.6.2はGOおよびKEGG解析に使用されました。GSEAにはFGSEA v1.22.0とMSigDBのHallmark v7.5が使用されました。

6. 相関とネットワーク解析

注:ピアソン相関法は正規分布遺伝子発現に用いられました。免疫細胞分数におけるスピアマン相関。PPIネットワークはSTRING(バージョン11.5、信頼度>0.7)を用いて生成され、Cytoscape(バージョン3.9.1)で可視化されました。免疫浸透はCIBERSORT(絶対モード、100の置換)を用いて推定されました。単細胞RNAシーケンシングはNSCLCの微小環境におけるニッチな転移を明らかにすることが示されており、これは免疫浸透解析に関連しています^21,22。統合的単細胞解析は、^LUADにおけるCD8+記憶細胞などの免疫細胞の役割をさらに解明^{できます。}

7. ノモグラムの構築と検証

注:ノモグラムの変数は多変量Cox有意性(P < 0.05)に基づいて選択されました:Tステージ、Nステージ、 B3GNT3、 FERMT1、 SPP1。ノモグラムはRMS(バージョン6.5.0)を用いて構築されました。内部検証では1000ブートストラップリサンプリングと置換が行われました。校正曲線および決定曲線解析(DCA)はrmda(バージョン1.7)を用いて実施されました。計算環境にはR 4.1.3、Windows 10 Pro、Bioconductor 3.15が含まれていました。分析スクリプトは、合理的な要望があれば https://github.com/[編集済み]/LUAD-biomarker-2025で入手可能です。

8. 統計分析

注:すべての統計検定は両面で行われました。P < 0.05は有意とされました。

Results

LUADにおける全域的な遺伝子発現変化

肺腺癌組織と正常肺組織のトランスクリプトミクス比較により、広範な遺伝子発現変化が確認されました。図1AはTCGA-LUADデータセットにおける差異発現遺伝子の火山プロットを示し、図1BはGSE115002データセットのそれらを示しています。TCGA-LUADコホート(図1A)では、1865遺伝子が有意にアップレギュレーションされ、1247遺伝子がダウンレギュレーションされました。GSE115002コホート(図1B)では、645遺伝子がアップレギュレーションされ、609がダウンレギュレーションされました。両データセットで合計421遺伝子が一貫してアップレギュレーションされていました。これらの重なり遺伝子のうち、B3GNT3、FERMT1、SPP1は図1Aおよび図1Bで腫瘍サンプルで著しく過剰発現していると標識されています。TCGA-LUADでは、B3GNT3の発現が正常組織と比べて約5倍、FERMT1が8倍、SPP1が10倍増加しました。同様のアップレギュレーションはGSE115002でも確認され、3つの遺伝子すべてが2倍以上の上昇を示しました。

B3GNT3、FERMT1、SPP1の診断性能

受信者の動作特性曲線解析を用いてB3GNT3、FERMT1、SPP1の診断性能を評価しました。図2AはTCGA-LUADコホートのROC曲線を示し、図2BはGSE115002コホートの曲線を示しています。これら3つの遺伝子はいずれも両コホートで高い診断精度を達成しました。TCGA-LUADコホート(図2A)では、曲線値下の面積はすべてのマーカーで0.95を超えていました。独立GSE115002コホート(図2B)でも、曲線値下の面積が同様に大きいことが観察されました。感度と特異度は最適カットオフ値で85%から95%の範囲でした。これらの結果は、各遺伝子が腫瘍と正常組織を優れた識別力で提供していることを確認しています。

B3GNT3、FERMT1、SPP1発現の予後的意義

図3のカプラン–マイヤー生存曲線は、各遺伝子の高い発現が両コホートで全生存期間の短縮と有意に関連していたことを示しています。 図3A–3Cは TCGA-LUADコホートにおける B3GNT3、 FERMT1、 SPP1 の総合生存曲線を示しています。図3D–3FはGSE115002コホートにおける対応する曲線を示しています。 B3GNT3、 FERMT1、 またはSPP1 発現が高い患者は、中央値生存期間が低下し、5年生存率が低かった。多変量回帰解析により、 SPP1 発現の高が独立した予後因子であることが確認されました。3つの遺伝子すべての発現が上昇すると、無病症生存期間の短縮とも関連していました。両コホートで一貫した傾向が見られ、 B3GNT3、 FERMT1、 SPP1 の過剰発現は肺腺癌における臨床的転帰を悪化させることが示されています。

機能豊化解析

機能豊化解析の結果は図4にまとめられています。図4AはTCGA-LUADコホートにおけるGOおよびKEGG濃縮を示し、図4BはGSE115002コホートにおける濃縮を示しています。アップレギュレーションされた遺伝子は、細胞周期進行、細胞外マトリックスの組織、局所癒着、がん性シグナル伝達において強く豊かに示されました。ダウンレギュレーションされた遺伝子は正常な上皮分化およびp53シグナル伝達と関連していました。これらの観察は、3つの候補遺伝子が肺腺癌における増殖、浸潤、免疫調節障害を促進する経路に関与していることを示しています。

共表現ネットワーク

B3GNT3、FERMT1、SPP1に関連する共発現ネットワークは図5に示されています。 図5AはTCGA-LUADコホートのネットワークを示し、図5BはGSE115002コホートのネットワークを示しています。ノードは遺伝子を表し、エッジは相関係数を表します。これら3つの主要な遺伝子はECMリモデリング、免疫調節、細胞骨格組織遺伝子と共にクラスタリングされます。これらの発見は、これら3つの遺伝子の過剰発現が免疫抑制性腫瘍微小環境と関連していることを示唆しています。

予後ノモグラムの実施

予後ノモグラムは 図6に示されています。このモデルは、病態的なT段階、病理的N段階、 B3GNT3、 FERMT1、 SPP1 の発現レベルを統合して構築し、LUADにおける1年、2年、3年の総生存期間を予測しました。各変数にポイントが割り当てられ、合計ポイントは予測された生存確率に対応します。モデルはコンコルダンス指数0.743を達成し、良好な予測性能を示しました。較正曲線は予測生存確率と実際の生存確率のほぼ一致を示しました。意思決定曲線分析により臨床的純利益が確認されました。このノモグラムは、従来のTNM病期診断を超えた個別化生存予測を向上させます。

まとめると、本研究は B3GNT3、 FERMT1、 SPP1 がLUAD病原の中核分子として注目されます。これらの過剰発現は浸潤性腫瘍の表現型、間質の再形成、免疫回避と相関しています。マルチオミクス統合を通じて、これらの遺伝子が診断、予後、患者層別化にどれほど価値があるかを実証しました。今後の研究では、免疫療法反応への予測的関連性を探り、LUADにおける治療標的としての潜在能力を評価する必要があります。

図1:LUAD腫瘍と正常組織における差異発現遺伝子のボルケーノプロット。 (A) TCGA-LUADデータセット。(B) GSE115002データセット。赤は有意に上位調節された遺伝子を示します。青色は遺伝子のダウンレギュレーションを示します。 B3GNT3、 FERMT1、 SPP1 は一貫して上型調節されているとラベル付けされています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:LUADと正常組織を区別するための B3GNT3、 FERMT1、 SPP1 のROC曲線。 (A) TCGA-LUADコホート。(B)GSE115002コホート。AUC値は高い診断精度を示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:B3GNT3、FERMT1、SPP1発現レベルによって層別化されたKaplan–Meierの全体生存曲線。 (A–C) TCGA-LUADコホート。(A) B3GNT3、(B) FERMT1、(C) SPP1。(D–F)GSE115002コホート。(D) B3GNT3、(E)FERMT1、(F)SPP1。各遺伝子の高い発現は両ホートの全体的な生存期間の短縮と有意に関連しています。対数ランク検定による心拍数値とP値も提供されています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:DEGのGOおよびKEGG濃縮解析が3つの主要遺伝子と相関しています。 (A) TCGA-LUADコホート。(B) GSE115002コホート。濃縮の用語には、生物学的プロセス(BP)、細胞成分(CC)、分子機能(MF)、KEGG経路が含まれます。アップレギュレーションされた遺伝子は増殖、ECMの再構築、がん性シグナル伝達に富んでいます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5: B3GNT3、 FERMT1、 SPP1に関連する遺伝子共発現ネットワーク。 (A) TCGA-LUADコホート。 (B) GSE115002コホート。ノードは遺伝子を表し、エッジは相関係数を表します。これら3つの主要な遺伝子はECMリモデリング、免疫調節、細胞骨格組織遺伝子と共にクラスタリングされます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図6:病態T期、病態N期、 B3GNT3、 FERMT1、 SPP1 発現を統合した予後ノモグラムによるLUADの1年、2年、3年全生存期間の予測。 各変数にポイントが割り当てられ、合計ポイントは予測された生存確率に対応します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

Discussion

ノモグラムはTCGA-LUADコホートに基づく多変量Cox回帰解析を用いて構築されました。予測因子には、病態的T期、病態的N期、およびB3GNT3、FERMT1、SPP1の遺伝子発現状態(中央値発現に基づく高・低に分類)が含まれます。各患者に対して、各変数の個別スコアを合計して「総得点」値を生成します。これは推定される1年、2年、3年の生存確率に対応します。総スコアが高いほど死亡リスクが高いことを示します。このツールは個別化された生存予測を提供し、LUADのリスク階層化を支援します。機械学習はLUADの予後^{と治療における}多様な細胞死パターンを明らかにするために用いられており^、これによりノモグラムモデルの最適化がさらに可能となります。

本研究では、統合バイオインフォマティクス解析を用いてLUADにおけるB3GNT3、FERMT1、SPP1が堅牢な診断および予後バイオマーカーとして同定されました。これら3つの遺伝子はすべて腫瘍内で一貫して過剰発現し、腫瘍と正常組織を高い精度で区別し、生存率の低い予測を行い、EMT、マトリックスリモデリング、免疫回避に関連する経路を調節します。統合ノモグラムは、TNMのステージングを超えたリスク層分けを改善します。B3GNT3は、糖^{鎖化によって}PD-L1を安定化させることで免疫回避を促進し^ます。FERMT1はインテグレインシグナル伝達と細胞運動性を高め、浸潤と転移を促進します^11,12。SPP1はEMT、血管新生、M2マクロファージ分極の分泌ドライバーとして機能します(13,14,15)。これらは、侵襲性と免疫抑制を特徴とする攻撃的なLUADサブタイプを定義します。

以前の研究では、LuadにおけるB3GNT3、FERMT1、またはSPP1の個別の役割が報告されています。本研究は、独立したトランスクリプトムコホート全体でこれら3つを統一パネルとして検証し、TCGAおよびGEOのデータの両方で診断および予後性能が確認された初めてのものです。LUADバイオマーカーに関する最近の研究は、予後や免疫療法の指針における免疫関連遺伝子シグネチャーの価値を支持しています。統合バイオインフォマティクスと機械学習を用いた最近の研究では、LUADの診断と予後に関する複数の遺伝子シグネチャーが特定されています^21,22。これらのアプローチは、3遺伝子パネルと同様に、臨床的層化におけるトランスクリプトームベースのバイオマーカーの価値を強調しています。

細胞外マトリックスのリモデリングは積極的なLUADの中核的特徴であり、ECM関連のシグネチャーは独立した予後因子として検証されています。FERMT1およびSPP1が局所癒着およびECM–受容体相互作用と密接に関連しているという私たちの発見は、LUAD進行におけるマトリックスリモデリングの重要な役割をさらに支持しています。学際医学(IMed)^21,23で報告されているCHAF1Bおよびユビキチン関連遺伝子シグネチャーと同様に、私たちの3つの遺伝子は免疫浸潤と密接に関連しており、予後および予測マーカーの両方として機能する可能性があります。LUADバイオマーカーの同定の代替戦略には、単一細胞RNAシーケンシング、空間トランスクリプトミクス、機械学習に基づく特徴選択、プラズマプロテオームプロファイリング24^、25、26などがあります。ランダムフォレストやLASSOのような機械学習アルゴリズムは、バイオマーカー選択をさらに洗練させることができます。qPCR、IHC、ELISAを用いたウェットラボ検証は、臨床翻訳27,28,29,30の確認に不可欠です。

本研究は後ろ向き設計、公開トランスクリプトムデータへの依存、外部の臨床検証の欠如により制約があります。ノモグラムの検証は内部ブートストラップ再サンプリングに限定されていました。大量のトランスクリプトミックデータでは細胞レベルの発現を解消できません。機構的因果性には関数実験が必要です。免疫浸潤との相関は計算的反畳み込みに基づいており、慎重に解釈する必要があります。今後の研究では、IHC、qPCR、血清ELISAを用いて前向きコホートでこれらのバイオマーカーを検証することが期待されます。単細胞および空間的トランスクリプトミクスは細胞源と空間分布を明らかにします。免疫療法および標的療法反応の予測価値を評価する必要があります。 B3GNT3、 FERMT1、 SPP1 の治療的標的化は、LUAD治療の新たな戦略を提供する可能性があります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Publicly Available Datasets	TCGA-LUAD Dataset	The Cancer Genome Atlas (TCGA) Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/); 535 LUAD tumor samples, 59 adjacent normal lung tissue samples (RNA-sequencing count/FPKM values + clinical data: survival, TNM staging)	Transcriptomic and clinical data for differential expression, survival, and nomogram analysis; primary study cohort
	GSE115002 Dataset	Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE115002); Agilent microarray, 52 LUAD tumor tissues, 52 matched adjacent normal lung tissues (treatment-naïve primary tumors)	Independent validation cohort for differential expression, diagnostic performance, and immune infiltration analysis
Bioinformatics Software & Programming Environment	R Programming Language	Version 4.1	Core platform for all transcriptomic, statistical, and graphical analyses
	R Packages (Differential Expression)	DESeq2, limma	DESeq2: TCGA RNA-seq raw count differential expression analysis; limma: GSE115002 microarray normalization and differential expression analysis (Benjamini–Hochberg FDR correction)
	R Packages (Diagnostic Analysis)	pROC	Construction of ROC curves, calculation of AUC (95% CI), optimal cutoff determination (Youden’s index) for diagnostic performance assessment
	R Packages (Survival Analysis)	survival, survminer	Kaplan–Meier survival curve generation, log-rank test, univariate/multivariate Cox proportional hazards regression (HR + 95% CI); patient stratification by median gene expression
	R Packages (Functional Enrichment)	clusterProfiler, fgsea	clusterProfiler: GO (BP/CC/MF) and KEGG pathway enrichment analysis (adjusted P < 0.05); fgsea: GSEA for MSigDB Hallmark/KEGG gene sets (FDR < 0.25)
	R Packages (Nomogram Construction & Validation)	rms	Development of prognostic nomogram (integration of gene expression + TNM stage); Harrell’s C-index calculation, bootstrap resampling (1000 repetitions) for bias correction, calibration plot generation
	R Packages (Statistical & Visualization)	ggplot2, ComplexHeatmap, corrplot	Generation of volcano plots, bubble plots (enrichment), heatmaps (immune infiltration correlation), scatter plots (gene co-expression); Pearson/Spearman correlation analysis
Bioinformatics Databases & Tools (Network/Immune Analysis)	STRING Database	Confidence score > 0.7	Construction of protein–protein interaction (PPI) networks for B3GNT3/FERMT1/SPP1 and first-degree interactors
	Cytoscape	-	Visualization of PPI and gene co-expression networks (edge weighting by correlation strength, hub gene identification)
	Immune Deconvolution Algorithm	CIBERSORT	Estimation of immune cell infiltration abundance (M2 macrophages, CD8+ T cells, neutrophils, NK cells, etc.) in LUAD samples; correlation with candidate gene expression
Other Tools	Microsoft Office/LaTeX	-	Manuscript preparation, figure assembly, and table formatting; statistical result compilation