研究記事

ヒトトランスクリプトミックデータの統合バイオインフォマティクス解析は、肺腺癌における3つの主要な診断および予後バイオマーカーを特定します

DOI：

10.3791/71214

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2026年6月30日

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1Department of Laboratory Medicine, The Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Medical Technology and Information Engineering, Zhejiang Chinese Medical University, 3Department of Laboratory Medicine, Fujian Nan'an Hospital, 4Department of Laboratory Medicine, Pujiang Tianxian Orthopedic Hospital, 5Department of Laboratory Medicine, People's Hospital of Dafang, 6Department of Laboratory Medicine, Fujian Medical University Union Hospital, 7Department of Laboratory Medicine, Fujian Pingtan Comprehensive Experimental Area Hospital, 8Medical Laboratory Center, Jinjiang Municipal Hospital, Shanghai Sixth People's Hospital, 9Medical Laboratory Center, Jinjiang Municipal Hospital, Teaching Hospital of Huaqiao University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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本研究は、TCGA-LUADおよびGEOのトランスクリプトミクスデータを用いて肺腺癌の診断および予後バイオマーカー GSE115002同定しました。 B3GNT3、 FERMT1、 SPP1 は上位調節され、腫瘍と正常組織を区別しました。これらの遺伝子は上皮-間葉系転移および免疫抑制に関連しています。遺伝子発現とTNM期を組み合わせたノモグラムでは、信頼できる予測価値が示されました。

要約

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肺腺癌(LUAD)は、世界でがん関連死の主な原因です。手術、標的治療、免疫療法の進歩にもかかわらず、高度なLUADの5年生存率は20%未満であり、早期発見と予後のための信頼できる分子バイオマーカーの緊急性を示しています。本研究では、著者らは、3つの一貫して上型調節されている遺伝子がLUADの効果的な診断および予後バイオマーカーとして機能する可能性があると仮説を立てました。著者らは、TCGA-LUAD(腫瘍535例、正常サンプル59例)およびGSE115002(腫瘍52例、正常サンプル52例)の2つの独立したコホートのトランスクリプトミックデータを解析し、発現遺伝子の差異をスクリーニングしました。3つのコア遺伝子、B3GNT3、FERMT1、SPP1は両データセットのLUAD腫瘍で一貫して過剰発現を示していました。これらの遺伝子は優れた診断性能を示し、TCGA-LUADではAUC値が0.95を超え、GSE115002では高い精度を示しました。生存分析により、各遺伝子の高い発現は全体および無疾患生存期間の短縮に有意に関連しており、多変量Cox回帰分析によりそれらの独立した予後価値が検証されました。機能豊か化解析により、これら3つの遺伝子は上皮-間葉質転移、細胞外マトリックスリモデリング、免疫抑制に関与しており、いずれもLUADの侵襲および転移と密接に関連していることが示されました。著者らはさらに、3つの遺伝子とTNM期を組み合わせた予後ノモグラムを構築し、コンコーダンス指数0.743を達成し、良好な予測性能を示しました。これらの発見は、B3GNT3、FERMT1、SPP1がLUADの診断および予後バイオマーカーとして有望であり、リスク階層化および管理における臨床応用を支持していることを裏付けています。

概要

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肺がんは世界のがん死亡率の主な原因であり、2020年には約180万人の死亡を招いています。肺腺癌(LUAD)は全肺がん症例の約40%を占めています2。手術、標的治療、免疫療法の進歩にもかかわらず、進行したLUADの5年生存率は依然として20%未満のままです3,4。早期発見と正確な予後のための信頼できる分子バイオマーカーが緊急に求められています。ハイスループットシーケンシングや、がんゲノムアトラス(TCGA)や遺伝子発現オムニバス(GEO)などの公開データベースにより、がんの系統的なトランスクリプトミックプロファイリングが可能となります。統合的クロスコホートバイオインフォマティクスは候補バイオマーカー発見の信頼性を向上させる5.

細胞増殖、EGFRシグナル伝達、免疫逃逸7など、多くの遺伝子や経路がLUADに関与していることが示されています。しかし、臨床応用に翻訳されたものはほとんどありません。遺伝子シグネチャーと臨床病理学的特徴、特にノモグラムを組み合わせたリスクモデルは、LUAD8の予後精度を向上させます。 B3GNT3、 FERMT1、 SPP1 は個別にがん進行に関連していますが、LUADにおける診断、予後、免疫微小環境調節の複合的価値は独立したコホート間で体系的に検証されていません。本研究は、これら3つの遺伝子を統合したクロスプラットフォーム解析として初めてLUADの統合バイオマーカーパネルとして提供し、臨床的に応用可能な予後ノモグラムを提供します。

B3GNT3はPD-L1を安定化し免疫回避を促進するグリコシルトランスフェラーゼをコードしています(9,10)。FERMT1(キンドリン-1)はインテグリンの活性化を調節し、非小細胞肺がん(NSCLC)における転移を促進します11,12。SPP1(オステオポンチン)は細胞外マトリックスの再構築、上皮-間葉転換(EMT)、および化学抵抗性を媒介します 13,14,15。概日リズムに関連する遺伝子はLUADの予後と診断を予測することも示されており、16は多オミクス統合タンパク質シグナルネットワークを通じてLUADの性差も明らかにされています。B3GNT3およびSPP1は分泌または膜局在であり、低侵襲バイオマーカーとしての利用を支持します。LUADの分類やバイオマーカーの同定は、重複する特徴選択手法を通じても達成可能であり、多重オミック相互作用は肺がんの進行において重要な機能的役割を果たします。包括的なマルチオミクス統合によって特定されたミトコンドリア遺伝子シグネチャーもLUAD予後や個別化治療に価値があります20。B3GNT3およびSPP1は分泌または膜局在であり、低侵襲バイオマーカーとしての利用を支持します。本研究は統合バイオインフォマティクスを用いて堅牢なLUADバイオマーカーを特定し、その診断および予後性能を評価し、生物学的機能と免疫関連を探求し、臨床的に有用な予後ノモグラムを構築することを目的としました。

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プロトコル

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1. データソースと前処理

  1. R(バージョン4.1.3)で生データを処理;Windows 10 Pro)。
  2. GSE115002については、Limma(バージョン3.52.3)を用いて分位元正規化を適用します。
  3. TCGAの低発現遺伝子をフィルターしてください:CPMが0.5の遺伝子を>50%のサンプルで保持します≥。
  4. GSE115002の低発現遺伝子をフィルタリング:平均シグナル>50の遺伝子を保持する。
  5. log2擬似カウント+1の式の値を変換します。
    注:LUAD遺伝子発現および臨床データは、TCGA-LUAD(バージョン33.0、GDCポータル、2025年8月7日ダウンロード)およびGSE115002(Agilent microarray、GEO、2025年8月7日ダウンロード)から取得されました。TCGA-LUADは535件の腫瘍と59件の正常サンプルを含みました。GSE115002 52の腫瘍と52の適合した正常サンプルが含まれていました。

2. 差異発現遺伝子の同定

  1. TCGA RNAセクシークセイクにはDESeq2(バージョン1.36.0)、GSE115002にはLIMMA(バージョン3.52.3)を用い、差別発現解析を行います。ベンジャミニ・ホッホバーグ法を用いて調整済みP値(FDR)を計算します。
  2. データセット間の比較可能性を確保するために、統一された|log₂FC|≥1.0は両コホートに適用されました。DEGはFDR < 0.05および|log₂FC|≥ 1.0。重複するDEGはVennDiagram(バージョン1.7.3)を用いて特定されました。 B3GNT3、 FERMT1、 SPP1 は、がん関連性が知られている一貫して上位調節されている候補として選ばれました。

3. 診断価値の評価

  1. 各候補遺伝子に対してROC曲線を構築します。
  2. ユーデン指数を使って最適なカットオフ値を決定します。
  3. 各遺伝子のAUC、感度、特異度を計算してください。
  4. 多変量ロジスティック回帰を用いて統合診断パネルを構築します。
    注:ROC解析にはpROCパッケージv1.18.0が使用されました。二項族を持つglm関数を用いて診断モデルを構築しました。

4. 生存分析

  1. 中央値発現を用いて患者を高発現群と低発現群に階層化します。
  2. 各遺伝子に対してカプラン–マイヤー生存曲線を生成します。
  3. 生存差を比較するためにログランク検定を行います。
  4. 単変量コックス回帰解析を実施します。
  5. 多変量コックス回帰解析を実施してください。
  6. 回帰モデルに臨床共変量を含めること。
  7. シェーンフェルド残差を用いて比例ハザード仮定を検証します。
  8. 3遺伝子リスクスコアを計算します。
    注:Survival v3.3.1およびsurvminer v0.4.9が使用されました。共変量には年齢、性別、Tステージ、Nステージ、Mステージが含まれていました。リスクスコアは次のように計算されました:
    リスクスコア = (0.328 × B3GNT3) + (0.331 × FERMT1) + (0.321 × SPP1)(1)

5. 遺伝子セットの豊かさと機能注釈

  1. DEGを用いたGO濃縮解析を行います。
  2. DEGを用いたKEGG経路濃縮解析を行います。
  3. 遺伝子セットリッチ解析(GSEA)を実施します。
  4. 候補遺伝子発現とピアソン相関による遺伝子の順位付け。
  5. 調整済みP < 0.05を用いて有意な項を特定します。
    注:clusterProfiler v4.6.2はGOおよびKEGG解析に使用されました。GSEAにはFGSEA v1.22.0とMSigDBのHallmark v7.5が使用されました。

6. 相関とネットワーク解析

注:ピアソン相関法は正規分布遺伝子発現に用いられました。免疫細胞分数におけるスピアマン相関。PPIネットワークはSTRING(バージョン11.5、信頼度>0.7)を用いて生成され、Cytoscape(バージョン3.9.1)で可視化されました。免疫浸透はCIBERSORT(絶対モード、100の置換)を用いて推定されました。単細胞RNAシーケンシングはNSCLCの微小環境におけるニッチな転移を明らかにすることが示されており、これは免疫浸透解析に関連しています21,22。統合的単細胞解析は、LUADにおけるCD8+記憶細胞などの免疫細胞の役割をさらに解明できます。

7. ノモグラムの構築と検証

注:ノモグラムの変数は多変量Cox有意性(P < 0.05)に基づいて選択されました:Tステージ、Nステージ、 B3GNT3、 FERMT1、 SPP1。ノモグラムはRMS(バージョン6.5.0)を用いて構築されました。内部検証では1000ブートストラップリサンプリングと置換が行われました。校正曲線および決定曲線解析(DCA)はrmda(バージョン1.7)を用いて実施されました。計算環境にはR 4.1.3、Windows 10 Pro、Bioconductor 3.15が含まれていました。分析スクリプトは、合理的な要望があれば https://github.com/[編集済み]/LUAD-biomarker-2025で入手可能です。

8. 統計分析

注:すべての統計検定は両面で行われました。P < 0.05は有意とされました。

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結果

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LUADにおける全域的な遺伝子発現変化

肺腺癌組織と正常肺組織のトランスクリプトミクス比較により、広範な遺伝子発現変化が確認されました。図1AはTCGA-LUADデータセットにおける差異発現遺伝子の火山プロットを示し、図1BはGSE115002データセットのそれらを示しています。TCGA-LUADコホート(図1A)では、1865遺伝子が有意にアップレギュレーションされ、1247遺伝子がダウンレギュレーションされました。GSE115002コホート(図1B)では、645遺伝子がアップレギュレーションされ、609がダウンレギュレーションされました。両データセットで合計421遺伝子が一貫してアップレギュレーションされていました。これらの重なり遺伝子のうち、B3GNT3、FERMT1

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ディスカッション

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ノモグラムはTCGA-LUADコホートに基づく多変量Cox回帰解析を用いて構築されました。予測因子には、病態的T期、病態的N期、およびB3GNT3、FERMT1、SPP1の遺伝子発現状態(中央値発現に基づく高・低に分類)が含まれます。各患者に対して、各変数の個別スコアを合計して「総得点」値を生成します。これは推定される1年、2年、3年の生存確率に対応します。総スコアが高いほど死亡リスクが高いことを示します。このツールは個別化された生存予測を提供し、LUADのリスク階層化を支援します。機械学習はLUADの予後と治療における多様な細胞死パターンを明らかにするために用いられており、これによりノモグラムモデルの最適化がさらに可能となります。

本研究では、統合バイオインフォマティクス解析...

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開示事項

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著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。

謝辞

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この研究は、福建中医大学付属人民病院の林宇輝氏が主導した2024年福建中医薬大学大学レベルプロジェクト(助成金番号:XB2024012)の支援を受けました。福建省科学技術イノベーションのための共同基金(助成番号:2025Y9530)は、福建省晋江市立病院(上海第六人民病院)の陳曉廷が主導しています。

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材料

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この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
公開利用可能なデータセットTCGA-LUAD データセットThe Cancer Genome Atlas (TCGA) Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/); 535 LUAD 腫瘍サンプル、59 隣接する正常肺組織サンプル (RNA シーケンスカウント/FPKM 値 + 臨床データ: 生存率、TNM 病期)差異発現、生存率、およびノモグラム分析のための転写蓬および臨床データ; プライマリ研究コホート
GSE115002 データセットGene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE115002); Agilent マイクロアレイ、52 LUAD 腫瘍組織、52 一致した隣接する正常肺組織 (治療未経験の原発腫瘍)差異発現、診断性能、および免疫浸潤分析のための独立検証コホート
バイオインフォマティクスソフトウェア & プログラミング環境R プログラミング言語バージョン 4.1すべての転写蓬、統計、およびグラフィカル分析のためのコアプラットフォーム
R パッケージ (差異発現)DESeq2, limmaDESeq2: TCGA RNA-seq 生のカウント差異発現分析; limma: GSE115002 マイクロアレイ正規化および差異発現分析 (Benjamini-Hochberg FDR 補正)
R パッケージ (診断分析)pROCROC 曲線の構築、AUC (95% CI) の計算、診断性能評価のための最適カットオフの決定 (Youden の指標)
R パッケージ (生存分析)survival, survminerKaplan-Meier 生存曲線の生成、ログランク検定、単変量/多変量 Cox 比例ハザード回帰 (HR + 95% CI); 中央値遺伝子発現による患者層別化
R パッケージ (機能エンリッチメント)clusterProfiler, fgseaclusterProfiler: GO (BP/CC/MF) および KEGG 経路エンリッチメント分析 (調整済み P < 0.05); fgsea: MSigDB ハルマーク/KEGG 遺伝子セットの GSEA (FDR < 0.25)
R パッケージ (ノモグラム構築 & 検証)rms予後ノモグラムの開発 (遺伝子発現 + TNM 病期の統合); Harrell の C インデックスの計算、バイアス補正のためのブートストラップ再サンプリング (1000 回)、校正プロットの生成
R パッケージ (統計 & 可視化)ggplot2, ComplexHeatmap, corrplot火山プロット、バブルプロット (エンリッチメント)、ヒートマップ (免疫浸潤相関)、散布図 (遺伝子共発現) の生成; Pearson/Spearman 相関分析
バイオインフォマティクスデータベース & ツール (ネットワーク/免疫分析)STRING データベース信頼スコア > 0.7B3GNT3/FERMT1/SPP1 および一次相互作用の構築のためのタンパク質-タンパク質相互作用 (PPI) ネットワーク
Cytoscape-PPI および遺伝子共発現ネットワークの視覚化 (相関強度によるエッジの重み付け、ハブ遺伝子の識別)
免疫分解アルゴリズムCIBERSORTLUAD サンプルにおける免疫細胞浸潤量の推定 (M2 マクロファージ、CD8+ T 細胞、好中球、NK 細胞など)；候補遺伝子発現との相関
その他のツールMicrosoft Office/LaTeX-原稿の準備、図の組み立て、表の書式設定、統計結果の編集
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