褐色脂肪細胞およびAGPAT2欠損プレディポサイトの分化における外因性ミトコンドリア移動

サマリー

ヒトおよびマウス起源の外因性ミトコンドリアは、前脂肪細胞の分化によって内部化され、画像診断や遺伝学的手法を用いて脂肪形成分化全体を追跡できます。これらのミトコンドリアは内因性ミトコンドリアネットワークと物理的に相互作用しますが、成熟した茶色脂肪細胞に関連するマーカーの発現を増加させることはありません。

要約

ミトコンドリアは重要な信号伝達ハブであり、しかし、ミトコンドリアの質量膨張が分化に機械的に必要かどうかは依然として未解決の問題です。AGPAT2はリソホスファチック酸をリン酸に変換する触媒であり、その欠乏は脂肪組織の欠乏とミトコンドリア質量の減少を伴う脂肪形成の障害を引き起こします。ミトコンドリア質量の拡大が脂肪形成に与える影響は、外因性ミトコンドリアを分化する茶色脂肪細胞に移すことで評価されました。また、ミトコンドリア移植がAGPAT2欠損細胞の障害した脂肪形成を救う可能性があるかどうかも調査されました。ヒトおよびマウスのミトコンドリアは成功裏に移行し、分化するマウス前脂肪細胞の内因性ミトコンドリアネットワークに組み込まれ、褐色脂肪形成期を通じて持続しました。移植されたミトコンドリアを保持するためには脂肪形成分化が必要でした。ミトコンドリア移植は成熟した茶色脂肪細胞の分子マーカーや脂質滴の発現を変化させませんでしたが、脂質滴のサイズの相対的な分布には種依存的に影響を与えました。Agpat2^-/- 前脂肪細胞では、ミトコンドリア移植が脂肪形成を救うことに失敗し、このモデルではミトコンドリア質量の拡大だけでは脂肪ジストロフィーのメカニズムを逆転させるには不十分であることを示している。これらの結果は、外因性のヒトおよびマウスのミトコンドリアが分化する脂肪細胞のミトコンドリアネットワークに組み込むことは可能であるものの、脂肪生成プログラムに直接影響を与えないことを示しています。

概要

主な生物エネルギー的役割に加え、ミトコンドリアは細胞分化^を含む複数の細胞プロセスにおけるシグナル伝達ハブとして機能^します。茶色脂肪組織(BAT)は、その熱生成活性を支えるために顕著に高いミトコンドリア質量を持ち、全身のエネルギーバランスや肥満の病因に関与していること^{を示しています5。}ミトコンドリアの質量は生合成とミトファジーのバランスによって調節されますが、褐色脂肪細胞分化中のミトコンドリア質量の拡大が脂肪形成に機能的に必要か、単に過程の結果であるかは依然として不明です。

細胞間の生理学的ミトコンドリア移動は、in vitroおよびin vivoの両方で記録されており、肥満やインス^{リン抵抗性}に関連する脂肪組織機能障害を含む病理的条件下での組織適応に寄与しています^6,7。さらに、人工ミトコンドリア移植は受容細胞の呼吸能力を高めることが示されています⁸。これらの発見は、ミトコンドリア移動が細胞の代謝機能を変化させ、生物エネルギーストレス下での組織適応に寄与する可能性があるという概念を支持^{しています。}核およびミトコンドリアの転写プログラムを活性化して内因性ミトコンドリア生合成を刺激する薬理学的または遺伝的戦略と比較して、ミトコンドリア移動は直接小器官を受容細胞に届け、転写操作に依存しずにミトコンドリア質量を迅速に変化させることを可能にします(^12,13).このアプローチはミトコンドリア疾患の欠陥を修正するために重要ですが、薬理学的または遺伝的アプローチによる潜在的なオフターゲット効果なしにミトコンドリアの作用を研究することも可能にします¹⁴。

本研究では、外因性ミトコンドリア移動によるミトコンドリア質量の人工的増加が褐色脂肪細胞の分化に与える影響を調査しました。このアプローチにより、ミトコンドリア質量が脂肪形成プログラムに与える影響を直接評価することが可能となりました。これを実現するために、間葉幹細胞向けに開発されたミトコンドリア移植プロトコルを、ヒト肝細胞とマウス前脂肪^{細胞の両方を} ミトコンドリアドロインとして用いて適応されました。遺伝子解析技術と画像技術を組み合わせて、分化マウス細胞内のヒトミトコンドリアを追跡する方法が開発され、両起源のミトコンドリアが内因性ミトコンドリアネットワークに組み込まれ、脂肪生成分化の過程を通じて持続していることが示されました。

低ミトコンドリア質量に関連する脂肪形成異常をモデル化するために、1-アシルグリセロール-3-リン酸-O-アシルトランスフェラーゼ2(AGPAT2)欠損(Agpat2^-/-)マウス由来の茶色脂肪細胞を分化した。AGPAT2は脂肪組織で高発現し、グリセロ脂質生合成経路におけるリン酸の形成を触媒します。AGPAT2欠損症はヒトおよびマウスの両方で重度の脂肪ジストロフィーを引き起こし、白および茶色の脂肪形成モデルにおける脂肪形成を妨げ、ミトコンドリア質量の減少と関連しています16,17,18。外因性ミトコンドリアを分化する前脂肪細胞に組み込むことで脂質滴のサイズ分布がわずかに変化しましたが、成熟した茶色脂肪細胞マーカーの発現を増加させたり、Agpat2^-/-前脂肪細胞の脂肪生成障害を救ったりはしませんでした。

プロトコル

動物処置はチリ・カトリック大学の動物ケア・使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)で承認され、プロトコル210609003。本研究では、混合C57BL/6Jおよび129J遺伝子背景から派生した野生型および Agpat2^-/- P0.5の新生マウス(両性)を用いました。個人用防護具(PPE):実験用コート、安全メガネ、ニトリル手袋を着用してください。追加のプロトコル詳細は 補足ファイル1 、このプロトコルに必要なバッファについては 表1 を参照してください。

電子顕微鏡下での準備、パラホルムアルデヒド固定、核酸抽出中に発生するすべての有害化学廃棄物は、機関の環境衛生・安全(EHS)規制に準拠し、明確にラベル付けされた指定されたストリームに厳格に分けなければなりません。これらの試薬はいかなる状況でも、実験室のシンクや公共下水道に放出してはなりません。発生したすべての有害化学廃棄物は、機関のEHS分類に従って分離されなければなりません。

1. 細胞培養

1. 一次脂肪細胞の分離、分化、維持(iBAT)
   注:手順の簡単な説明は 補足ファイル1 、必要な解の構成は 表1 を参照してください。in vitro 褐色脂肪形成分化プロトコルの完全かつ詳細な説明はFigueroaら¹⁹に記載されています。
   1. Figueroaらが記述した外科的および酵素的消化手順を経て、新生児マウス(P0.5)の肩胛骨間茶色脂肪組織(iBAT)から前脂肪細胞を分離します。¹⁹。
   2. 分化カクテルおよび培地交換スケジュールに従って、茶色の脂肪細胞培養を分化し維持します。
      注:脂肪形成分化を成功させるためには、培養が90〜100%の合流に達してから脂肪生成誘導を開始することが極めて重要です。
2. HepG2培養
   1. HepG2細胞をDMEMで培養し、10%胎児用牛血清、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、0.25 μg/mLアンホテリシンBを補足します。細胞は5%_CO2の加湿インキュベーターで37°Cの温度を保ちます。
      注:これらの細胞はクラスターで増殖し、多層成長により高密度にもかかわらずサブコンフループのように見えることがあります。

2. ミトコンドリアの分離と伝達

1. ミトコンドリア分離
   注意:すべての工程は4°Cのバイオセーフティキャビネット内または氷の上で行ってください。準備は2時間以内に使いましょう。
   1. 100mm培養皿×10個6個^のドナー 細胞(HepG2または前脂肪細胞)をシード。細胞が80%(HepG2)または100%(前細胞)の合流に達するまで培養します。
   2. 100 nM MitoTracker Deep Red FMをFBSフリー培地で37°C、5%_CO2 インキュベーターで30分間染色します。
   3. 細胞を培養培地で2回洗い、余分な染料を除去してください。
   4. トリプシンで細胞を剥離し、懸濁液を採取し、300× g で4°Cで5分間遠心分離します。
   5. ペレットを1 mLのミトコンドリア分離バッファー(MIB)に再懸浮させ、BSA、プロテアーゼ阻害剤、リン酸酵素阻害剤を補足します。細胞膜を5回ツベルクリン注射器に通して破壊します。懸濁液をインスリン注射器で少なくとも10回通し、溶液が薄茶色で塊が見えなくなるまで均質化します。
      注:ウェスタンブロット分析では、総溶解液の50μLをアリコートし、-20°Cで保存してください。
2. 均質液を900 × g で4°Cで11分間遠心分離します。
   注:900 ×gス ピン後の上澄液が濁っていなければ、細胞溶解は不完全である可能性が高いです。
   1. 上清液と遠心分離機を10,000 × g で4°Cで10分間採取し、ミトコンドリアにペレットを投与します。ミトコンドリアペレットはMIBで3回洗い、BSAを補足してください。
   2. BSAフリーMIBを100μLで最終再懸浮液として行います。BCAタンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を定量します。
3. 前細胞におけるミトコンドリア移動アッセイ(MTA)
   1. 種子受容者の前脂肪細胞を、アッセイの24時間前に12ウェルプレート(顕微鏡用に18mmのカバースリップを含む)で5×⁵ 細胞/ウェルで採取。
   2. 単離したドナーミトコンドリアを、10 μgのミトコンドリアタンパク質を10^μg の比率で直接レシピ医培地に加えます。ミトコンドリアを分散させるために皿を優しく揺らします。分析前に、37°Cの加湿インキュベーターで5%のCO₂を含み、24〜120時間(分化1日目、3日目、5日目に相当)を培養します。

3. ミトコンドリアの酸素消費量とMTA効率

1. ミトコンドリア呼吸計法
   1. 外部循環水浴を25°Cに設定し、測定を開始する前にチャンバージャケット内の安定した熱平衡を確保してください。
   2. 機器の取得ソフトウェアを使って2点液体位相校正を行います。
      1. 空気飽和校正(ハイポイント):チャンバーに500μLの空気飽和脱米ネラル水を加えます。磁気攪拌器を60rpmに設定し、信号が安定するまで記録します(>1,500 mV)。
      2. ゼロ酸素校正(ローポイント):チャンバーに少量(~3 mm)直径の亜硫酸ナトリウムを加え、残った空気を押しのけます。信号が安定した基準値(基底信号の約1%、約20 mV)まで下がるまで記録します。
   3. リアルタイム録画を開始します(総実行時間:~10分)。
   4. 安定した線形測定値が得られるまで3分間記録します。
   5. 分離ミトコンドリアを200μLのミトコンドリアアッセイバッファー(MAS)²⁰に再懸浮し、5 mMグルタミン酸と2.5 mMマラ酸を補完します。
      注:本研究では、全ミトコンドリアのペレットを2枚の100mm細胞プレートから抽出しました。
   6. サスペンションをオキシグラフチャンバーに移し、チャンバーのシールプランジャーをしっかり閉じて気泡が残らないようにします。
   7. 酸素消費量を3分間記録してください。
   8. 150μMのADPを加えてミトコンドリア連帯呼吸を誘発し、ATP合成連役呼吸を3分間測定します。
   9. 各呼吸相に対応する安定した線形区間を手動で定義します。ソフトウェアが自動計算した傾き値を抽出し、酸素消費率(nmol∙^mL-1∙^min-1)で表します。
      注意:プレート間チャンバーの清掃では、1mLの脱灰水でチャンバーを2回洗い、内部を完全に乾燥させてください。次のプレートに進む前にチャンバーに100μLのPBSを加えます。
2. フローサイトメトリー
   注意:検査中は細胞および生体エネルギーの完全性を保つため、すべてのサンプルを氷に保管してください。
   1. ミトコンドリアを単離し、2.2節に記載されたように、35mm培養皿でミトコンドリア移転アッセイ(MTA)を実施し、事前にMitoTracker Deep Red FMで標識されたドナー細胞を使用します。
   2. 培養培地を吸引し、細胞単分子層を1mLの無菌PBSで一度洗浄します。
   3. 0.25%トリプシンEDTAを500μL加え、37°Cで培養し、顕微鏡で完全な細胞剥離が観察されるまで培養します。
   4. 1mLの完全成長培地(DMEMと10% FBS)を加えてトリプシンを中和します。全量を15 mLの円錐形チューブに移し、遠心分離機で300 × gで4°Cで5分間投与します。
   5. 吸引によって上清液を廃棄し、細胞ペレットを保持します。ペレットを500μLの氷のように冷たいPBSに優しくピペッティングして再懸浮させます。
   6. 640nmレーザーを搭載したフローサイトメーターを使ってサンプルを解析します(フローサイトメトリーの取得および解析の詳細は 補足ファイル1 を参照)。
      1. 前方散乱(FSC)と側散乱(SSC)プロットを用いて細胞集団を定義し、デブリや細胞二重線を除外するためのゲート戦略を適用します。
      2. 遠赤色チャネル(670/30nm発光フィルター)の蛍光強度を定量化し、内部化されたMitoTracker標識ミトコンドリアを検出します。
      3. Floreada.io を用いて解析を行います(ゲーティングプロトコルの詳細は 補足ファイル1 を参照)。
         注意:背景自己蛍光の基準を設定するために陰性対照(MTAなしの受容細胞)を含めてください。
3. 共焦点顕微鏡および電子顕微鏡
   1. 生細胞イメージングアッセイ
      1. P0.5新生マウスから派生した一次前細胞細胞を、セクション1で詳述した特定の細胞密度および培地要件に従い、18mmのカバースリップを含む12ウェルプレートに種子を投与します。
      2. ミトコンドリアを単離し、セクション2で指定したMitoTracker Deep Red FMで標識されたドナー細胞を用いてミトコンドリア移転アッセイ(MTA)を実施します。
      3. ミトコンドリアの取り込みを可能にするため、37°Cの加湿インキュベーターで24時間_CO2 濃度5%を保温します。
      4. FBSフリー培養培地でストックを希釈して、70 nMのMitoTracker Green作業液を準備します。
      5. 12ウェルの培地から培養培地を吸引し、70 nMのMitoTracker Green溶液に置き換えます。プレートを37°Cで加湿インキュベーターで25分間培養し、5%の_CO2 を含んでミトコンドリアネットワーク全体を抑制します。
      6. 染色液を取り除き、カバースリップを温かい完全な培地1mLで2回洗います。
      7. 取得時の背景自己蛍光を最小限に抑えるため、最終体積をフェノールレッドフリーの完全培地に置き換えます。
      8. カバースリップまたはプレートを共焦点顕微鏡ステージに移します。顕微鏡のインキュベーションチャンバーを一定の環境37°C、_CO25%に設定します。
      9. 適切な励起/放出設定を用いて、遠赤(MitoTracker Deep Red FM)と緑(MitoTracker Green)チャンネルの両方で即時に画像を撮影してください。詳細は 補足ファイル1 を参照してください。
         注意:蛍光色体の光漂白を防ぐため、染色および取り扱いの手順はすべて暗い環境で行ってください。ミトコンドリア形態の最適な分解能を得るために、高開口(NA)オイルイマージョン対物レンズ(60倍または100倍)を使用します。
   2. 固定細胞を用いた共焦点免疫蛍光アッセイ
      注:細胞固定の後、有毒なパラホルマルデヒドおよびグルターアルデヒド溶液は非ハロゲン化有機物として分類されます。核酸抽出副産物は厳格な分離が必要です。フェノール/クロロホルム混合物はハロゲン化有機物として処分され、グアニジニウム系バッファーは腐食性有機物として分類されます。
      1. P0.5新生マウスから派生した一次前細胞を、セクション1で説明した12mmのカバースリップを含む12ウェルプレートに種子化します。
      2. ミトコンドリアを単離し、セクション2に指定された手順に従ってミトコンドリア移植アッセイ(MTA)を実施します。
      3. 培養液を24時間培養してミトコンドリアの取り込みを促します。
      4. 補足ファイル1に記載されたプロトコルに従い、必要なバッファー組成については表1を参照して茶色脂肪形成分化を誘導します。
      5. 分化7日目(168時間)に細胞を固定します。培養培地を吸引し、1ウェルあたり500μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を加えます。室温で20分間培養します。
      6. カバースリップは1枚の井戸に1mLの氷冷PBSを加えて2回洗います。カバースリップを0.05%サポニン、0.2%BSAを含むPBSで室温で1時間培養することで、細胞を透過化・遮断します。皿を軌道シェーカーに置き、優しく攪拌します。
      7. 細胞を1mLのPBSで2回洗浄します。核と脂質の滴を同時に染色します。ブロッキング/透過バッファーにHoechst 33342 1 μg/mLとBODIPY 1 μg/mLを塗布します。室温で30分間培養し、プレートを光から守ります。
      8. カバースリップを氷で冷めたPBS1mLで2回洗います。カバースリップをきれいなガラススライドに取り付けてください。スライドに10μLのマウントタントを塗布し、カバースリップセル側を下にしてマウントメディウムに置きます。試料は室温の暗い環境で一晩乾燥させてからイメージングを行います。
      9. 共焦点顕微鏡で画像を取得してください。HoechstとBODIPYの発光スペクトルに合わせて校正された2つの蛍光チャネルを使用します。追加の画像診断については 補足ファイル1 を参照してください。
      10. ImageJ v1.54sを使って脂質滴分析を行います。脂質滴チャネルを開き、 Freehand選択 ツールと ROIマネージャー ツールを使って個々の滴を手動で識別し、 Analyze |命令を測定 してください。
      11. RStudio v4.5.2環境内の 補足ファイル2 に提供されているRスクリプトを使って、結果データを処理・解析します。
          注意:代表的なサンプリングを確保するために、カバースリップにつき1枚だけ10倍倍で5枚の画像を撮影してください。提供されたスクリプトとの互換性を確保するために、Rバージョン4.5.2以降を使用してください。
   3. 透過電子顕微鏡(TEM)
      注:電子顕微鏡副産物では、非常に有毒な四酸化オスミウムおよびヒ素を含むカコジレートナトリウム緩衝剤を有毒な重金属廃棄物として収集する必要がありますが、酢酸ウラニルは施設の放射線安全プロトコルの下で放射性重金属廃棄物として別途管理されます。
      1. セクション2から分離されたミトコンドリアを10,000 × g で4°Cで10分間遠心分離し、コンパクトなペレットを得ます。
      2. ペレットを固定するには、0.1 Mのカコジレートナトリウムバッファーに2.5%のグルターアルデヒドを加えて固定します(pH 7.0)。4°Cで2時間培養します。
         注意:グルターアルデヒドのストック溶液を常に取り扱い、化学煙幕内で初期の固定作業を行うこと。目を保護するためにニトリル手袋とゴーグルを着用してください。加熱されたグルターアルデヒドは非常に刺激的な蒸気を放出するため、加熱源との接触は避けてください。
      3. ミトコンドリア製剤を0.05 Mのナトリウムカコジル酸バッファーで3×10分間洗浄し、バッファー交換の間にペレットを保持するために遠心分離機で短時間処理します。
      4. 試料に1%水溶液の四酸化オスミウム(OsO₄)を加えて後定着します。室温で15分間孵化します。
         注意:四酸化オスミウムは、認証済みの完全に機能する化学換気フード内でのみ開封・取り扱いする必要があります。白衣、安全ゴーグルまたはフルフェイスシールド、厚手または二重ニトリル手袋を着用してください(水しぶきが起きたらすぐに手袋を交換してください。OsO₄ は時間とともに薄いニトリルを貫通します)。
      5. サンプルを二重蒸留水で3分×5分洗います。ペレットに1%の水性ウラニル酢酸塩で15分間染めます。
         注意:使い捨てのプラスチック裏面のベンチペーパーで作業してください。放射性染色用にラボの特定のエリアを割り当ててください。二重手袋、白衣、安全ゴーグルを着用してください。処置後は必ず手をよく洗ってください。
      6. 調製液をグラデッドエタノール系列で脱水します。ペレットを30%、50%、70%、95%、100%のエタノールでそれぞれ5分間ずつキュベーキングします。
      7. ミトコンドリアの分画を埋め込む。1:1のエポン/エタノール溶液で30分間培養し、その後純粋なエポン樹脂で1時間培養します。
      8. サンプルを埋め込み型に移し、60°Cのオーブンで48時間重合します。
      9. 樹脂ブロックをウルトラミクロトームに取り付け、超薄い断片(80nm)を切断します。
      10. 区画をグリッドに集めましょう。グリッドに1%の水性酢酸ウラニルで4分間染めます。二重蒸留水ですすいでください。
      11. レイノルズのメソッド²¹の後に、シエン酸鉛で5分間染めます。しっかりすすいでください。TEMを使ってグリッドを可視化します。レイノルズ法およびTEM画像取得の詳細については 補足ファイル1 を参照してください。

4. 分子定量化

1. ミトコンドリアDNA(mtDNA)標準曲線
   1. HepG2細胞を5つの100mm培養皿に種子化します。培養物を80%の合流点に達するまで培養します。
   2. 第2節に記載された技術的手順に従い、採取した細胞からミトコンドリアを分離します。
   3. 4.2.6節に記載されている酸-グアニジニウム-フェノール-クロロホルム法を用いて、得られたミトコンドリアペレットから全DNAを抽出します。DNA濃度を測定し、純度((A₂₆₀/_{A 280} および(A₂₆₀/A₂₃₀ 比率)をマイクロボリュームUV-Vis分光光度計で評価します。
   4. ヌクレアーゼフリー水を希釈剤として連続希釈系列を準備します。DNAストックを希釈して、反応体積あたり1、^10-1、^10-2、^10-3、^10-4、^10-5 ngの最終量を得ます。次の段階に進む前に、各希釈を5秒ほどボルテックスして完全な均質性を確保します。
      注意:標準曲線の濃度範囲は、特定の試料濃度と最終的なPCR反応量に基づいて調整してください。
2. 受容細胞におけるヒトmtDNAの検出
   1. P0.5新生マウスから派生した一次前細胞を、セクション1で指定された密度および培地条件に従い、60mmの培養皿に種子を投入します。
   2. ドナーのHepG2細胞からミトコンドリアを分離し、セクション2に詳述されたミトコンドリア移植アッセイ(MTA)を実施します。
   3. 培養物を37°C、_CO25%で24時間培養します。
   4. 第1節で説明した培地交換プロトコルに従い、24〜120時間(1日目、3日目、5日目)に茶色脂肪形成分化を誘導します。
   5. 培地を吸引し、2mLの氷で冷たいPBSで細胞を2回洗浄します。
   6. 酸-グアニジニウム-フェノール-クロロホル^ム法を用いて全DNAを抽出します。
      注意:有害なフェノール蒸気の吸入を避けるため、必ずフルーム内でアリクォートと相分離を行いましょう。二重ニトリル手袋か、耐薬剤の重手袋を使いましょう。
   7. 相分離を行い、間相の上にある水相全体を廃棄します。
      重要なステップ:水相を完全に除去し、汚染を防ぎ、下流qPCRのDNA純度を高く保つこと。
   8. 初期抽出試薬1mLあたり100%エタノール0.3mLを加えます。チューブにキャップをして、反転で力強く混ぜます。
   9. 室温で3分間放置し、2,000× g で4°Cで5分間遠心分離してDNAを完成させます。
   10. フェノール・エタノール上清液を別のチューブに移し、タンパク質分離の可能性があります。DNAペレットを抽出試薬1mLあたり、0.1 Mのクエン酸ナトリウム(10%エタノール、pH 8.5)1 mLに再懸濁します。
   11. 室温で30分間置き、数回優しく逆さまにし、2,000 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清液は捨てる。
   12. クエン酸ナトリウム洗浄の手順をさらに2回繰り返します。
   13. 得られたペレットを、初期抽出試薬1mLあたり75%エタノール2mLで洗浄します。
   14. 室温で20分間置き、遠心分離機で2,000 × g で4°Cで5分間置きます。
   15. 上澄液を捨て、ペレットを10分間自然乾燥させます。8 mM NaOHを0.3〜0.6 mLに加え、ペレットが消えるまで上下にピペットで繰り返し移動してDNAを溶溶化します。
   16. 12,000 × g で4°Cで10分間遠心分離機で不溶性のゴミを除去します。上清液を無菌チューブに移し、HEPESを使ってpHを7〜8に調整します。
   17. マイクロボリュームUV-Vis分光光度計を用いてDNA濃度と純度((A(260)/A(280)および(A(260)/A(230)比率)を測定します。
   18. ヌクレアーゼフリー水でテンプレートを希釈し、総DNA15ngに仕上げます。セクション4.3に指定された光学的96ウェルプレートを用いてヒトmtDNAの定量的リアルタイムPCR(qPCR)を実施します。
   19. 増幅結果を対数回帰モデルを適用して解析します。
       注意:DNA濃度および対応する閾値サイクル(Ct)値を変数として使用し、対数回帰解析を実施してください。
3. 遺伝子発現のためのRT-qPCR
   1. 細胞の準備と分化
      1. セクション1.1に詳述されている60mm培養皿中のP0.5新生マウス由来の種子一次前脂肪細胞。
      2. ミトコンドリアを単離し、セクション2の手順に従ってミトコンドリア移動アッセイ(MTA)を行います。培養を24時間培養してください。
      3. 第1節のプロトコルに従い、分化後1日目、3日目、5日目にサンプリングして24〜120時間にわたり茶色脂肪形成を誘導します。
   2. 総RNA分離
      1. 培地を取り出し、1×106^{細胞ごとに} 1mLの酸性グアニジニウムフェノールクロロホルム抽出試薬を直接皿に加えます。分解液が均一になるまでピペッティングを繰り返して均質化します。
         注意:有害なフェノール蒸気の吸入を避けるため、必ずフルーム内でアリクォートと相分離を行いましょう。二重ニトリル手袋か、耐薬剤の重手袋を使いましょう。
      2. 使用した抽出剤試薬1 mLに対してクロロホルムを0.2 mL添加します。チューブをしっかりキャップし、手で15秒激しく振る。室温で3分間放置し、12,000 × g で遠心分離機で4°Cで15分間置きます。
      3. 上部水相を慎重に新しいヌクレアーゼフリーチューブに移します。インターフェーズとの接触は避けてください。サンプルは冷蔵保存してください。
      4. 抽出剤1 mLに対してイソプロパノール0.5 mLを加えます。逆回転で優しく混ぜ、室温で10分間培養します。
      5. 12,000 × g で4°Cで10分間遠心分離し、RNAをペレット化します。上澄液は逆さまにして捨てます。
      6. RNAペレットを75%エタノール1mLで洗浄します。渦を一時的に発生させ、遠心分離機として7,500× g で4°Cで5分間過ごします。
      7. 上清液を捨て、RNAペレットを室温で10分間自然乾燥させます。ペレットをヌクレアーゼフリー水30μLに再懸浮させます。サンプルを60°Cで15分間培養し、完全に溶解させます。
      8. マイクロボリュームUV-Vis分光光度計を用いてRNA濃度と純度(A₂₆₀/_{A 280} 比率)を測定します。
      9. アガロースゲル電気泳動でRNAの完全性を確認しましょう。
   3. DNase処理
      1. 各RNAサンプルに10× DNaseバッファー0.1とDNase酵素1 μLを加えます。ピペッティングで優しく混ぜます。反応を37°Cで30分間培養します。
      2. スラリーが均質になるまで、DNase不活化試薬をフリックまたはボルテックスで再懸浮させます。不活化試薬(RNAサンプルの0.1体積または2μL、どちらか大きい方)を加え、十分に混ぜます。室温で5分間孵育します。この期間中にチューブを3回はじいて試薬を懸濁状態に保ちます。
      3. 遠心分離機は10,000 g で1.5分間×。RNAを含む上清液を新しいチューブに移します。
         重要なステップ:DNase不活化試薬が持ち越されないように注意してください。これはその後のcDNA合成を阻害します。
   4. 逆転写(RT)
      1. 処理済みRNAを定量し、ヌクレアーゼフリー水で希釈して、20μL反応あたり最大2μgの総RNAを使用します。
      2. メーカーの指示に従って、RTマスターミックスを氷で準備してください。混合物を反応チューブに分散し、RNAサンプルを加えます。
      3. サーマルサイクラーに読み込み、キットメーカーの指定通りに逆転写プログラムを実行します。
   5. 定量リアルタイムPCR(qRT-PCR)
      1. セクション4.3.4で生成されたcDNAをPCRテンプレートとして使用してください。ヌクレアーゼフリー水でcDNAを希釈し、10 μL反応あたり20 ngの作動濃度にします。試薬は全部冷やしておけ。
      2. SYBR Green、プライマー、ヌクレアーゼフリー水を含むマスターミックスを準備してください。ピペッティング損失のための余剰体積も含めてください。反応混合物を光学qPCRプレートの各ウェルに10μLずつ注ぎます。
      3. プレートを光学接着フィルムで密封し、遠心分離機で短時間液体を底部に集めます。プレートをリアルタイムPCR機器にロードし、高速サイクルモードで増幅を行います。
      4. 閾値サイクル(Ct)値を決定し、ΔΔCt法を用いて相対的な定量化を行います。ラン終了時に融解曲線解析を含めて増幅特異性を検証します。
         注意:標的mRNAの存在量を内因性管理遺伝子として 36B4 mRNAレベルに正規化してください。qPCRプレートはセットアップから2時間以内に実行してください。それ以外の場合は、密封されたプレートを4°Cで保存してください。
4. ウェスタン・ブロット
   1. BCAアッセイを用いて、全細胞抽出物およびミトコンドリア抽出物からのタンパク質濃度を定量します(セクション2.1.8および2.1.12を参照)。
   2. サンプルごとに30μgのタンパク質を準備し、適切な量のSDS-PAGサンプルローディングバッファー(例:Laemmliバッファー)を追加します。
   3. 試料を95°Cで5分間加熱して変性させます(膜タンパク質の場合は特定の温度要件に従います)。
   4. サンプルをポリアクリルアミドゲルのウェルに積み込みます。染色剤の前面がゲルの底に達するまで、一定電圧(例:80–120 V)でナトリウムドデシル硫酸塩–ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によってタンパク質を分離します。
   5. PVDF膜を100%メタノールに1分間浸けて活性化し、その後転移バッファーで平衡させます。
   6. トランスファーサンドイッチを組み立て、ゲルと膜の間に気泡がないようにします。
   7. タンパク質を400 mAで2時間かけて電気ブロットでPVDF膜に移します。プロセス全体を通じてシステムを4°Cに保ちます。
   8. 非特異的結合部位を遮断するには、トリスバッファード生理食塩水(0.1% Tween 20(TBS-T)を含む5%無脂肪ミルクに1時間室温で培養します。
   9. 膜を一次抗体(ブロッキング溶液で1:1,000比1,000で希釈)で一晩、4°Cで穏やかに攪拌して培養します。
   10. 膜をTBS-Tで3×15分洗ってください。
   11. ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体を室温で2時間インキュベートします。
   12. 膜をTBS-Tで3回洗い、最後に1×TBSで5分間洗います。
   13. 強化化学発光(ECL)基質を用いてタンパク質バンドを可視化します。デジタルイメージングシステムを使って信号をキャプチャします。
       注意:ターゲットタンパク質の分子量に基づいてポリアクリルアミドゲルの割合(例:8%、10%、または12%)を調整してください。電気転写装置に能動冷却システムがない場合は、1時間ごとに氷容器を交換し、チャンバーを氷浴に浸したまま保ちます。視覚化が遅れた場合は、4°Cの1×TBSに膜を保存します。

結果

ミトコンドリア抽出と構造的および呼吸器の完全性

ミトコンドリア質量の増加が褐色脂肪形成に与える影響を評価するため、未分化の前脂肪細胞でミトコンドリア移動アッセイ(MTA)を実施しました(図1A)。ミトコンドリアは一次マウス前脂肪細胞(mMito)およびヒト肝臓肝G2細胞株(hMito)から単離されました。ウェスタンブロット解析により、両製剤とも全細胞抽出物と比較してミトコンドリアマーカーTOMM20が非常に高濃度で示されました(図1B)。透過電子顕微鏡(TEM)による分離分画解析により、保存されたクリスタを持つ明確な二重膜構造が確認され、完全なミトコンドリア形態と一致しました(図1C)。オキシメトリーアッセイでは、ミトコンドリア製剤を培地に加えた後の酸素濃度曲線に負の傾きが現れ、ADP補給後にさらに増加し...

ディスカッション

脂肪形成におけるミトコンドリア移動の生物学的意味

私たちの結果は、ヒトおよびマウスの両方からの外因性ミトコンドリアを分化する前脂肪細胞の内因性ミトコンドリアネットワークに組み込むことができるものの、ミトコンドリア質量の人工的な増加だけでは茶色の脂肪生成プログラムを推進するには不十分であることを示しています。これらの発見は、茶色脂肪形成に特徴的なミトコンドリアの拡大が、機構的制限要因や主要な駆動要因ではなく、細胞分化の結果であることを示唆しています。これらの観察は、多能性幹細胞での従来の研究とは異なり、MTAは分化を有意に促進したり代謝再プログラミングを誘導したりしました^23,24。本研究では、マウスミトコンドリアを、以前はコミット型前脂肪細胞と特徴づけていたBATの間質血管画率(SVF)から分離^{しました。}我々のデータ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100 mm plate	SPL Life Science	10101SPL
10x Tris/Glycine Buffer	BioRad	1610734
12 mm glass coverslips	Marienfeld	111520
12-well plate	SPL Life Science	30012SPL
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution	Invitrogen	28908
18 mm glass coverslips	HART	-
24-well plate	SPL Life Science	30024SPL
3,3'5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)	Sigma	T6397
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Calbiochem	410957
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	1610158
35 mm plate	SPL Life Science	20035SPL
6-well plate	SPL Life Science	30006SPL
60 mm culture dish	SPL Life Science	20060SPL	一次的脂肪前駆細胞およびDNA/qPCR実験に使用。サプライヤー/カタログは提供されていません
AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder	Maestrogen	02102-250
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01
Actrapid 100 UI/mL (Insulin)	Novo Nordisk	A10AB01
ADP	Merck	117105
Agarose	FERMELO BIOTEC	FER00AL200G	RNA完全性の検証に使用。サプライヤー/カタログは提供されていません
Ammonium Persulfate	BioRad	1610700
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7074
Anti-rat IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7077
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
Axio Observer inverted microscope stand	Carl Zeiss	431007-9901-000	補足的な方法から追加
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	D49328
BD Cytometer Setup and Tracking beads	BD Biosciences	-	補足的な方法から追加。カタログは提供されていません
BD FACSDiva Software v8.0.3	BD Biosciences	-	補足的な方法から追加
BD LSRFortessa X-20 cell analyzer	BD Biosciences	-	既存のエントリーを補足ファイルに合わせて標準化
BioRender	BioRender	-	図1のワークフローの作成に使用
Blotting-grade blocker	BioRad	170-6404
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A1470
CaCl2	Calbiochem	208291
cDNA Reverse Transcription Kit	Invitrogen	4374966
Cell Strainer 100 μm, nylon	Falcon	352360
Cell Strainer 40 μm, nylon	Falcon	352340
Collagenase type II	Gibco	17101-015
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM Powder, High Glucose, Pyruvate	Thermo Scientific	12800017
DMEM/F-12, no phenol red	Thermo Scientific	21041025
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062
DMSO	Sigma	D8418	誘導培地の溶媒。サプライヤー/カタログは提供されていません
EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)	Electron Microscopy Sciences	14120
Ethanol absolute	Merck	100983
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA)	Merck	324626
FAST SYBR MASTER MIX	Thermo Scientific	4385612
FCCP	Sigma	C2920
Fetal bovine serum	Capricorn Scientific	BS-16A
Floreada.io	Floreada.io	-	フローサイトメトリ分析ソフトウェア
Fluoromount-G	Thermo Scientific	7984-25
GAPDH Antibody	Santa Cruz	sc-32233
Glucose	Gibco	15023-021
Glutamate	Sigma	G1626
Glutaraldehyde 25% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16210
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Invitrogen	62-6520
GraphPad Prism v10.6.1	GraphPad Software	-	統計的/対数回帰分析ソフトウェア
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X	Thermo Scientific	78442
HEPES	Biological Industries	41-122-100
Histone H3 (1G1)	Santa Cruz	sc-517576
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
ImageJ v1.54s	NIH	-	脂肪滴画像分析ソフトウェア
Immun-Blot PVDF Membrane	BioRad	1620177
Indomethacin	Sigma	I7378
Insulin syringe	Cranberry	AAJECIN3	細胞のホモジネーションに使用。サプライヤー/カタログは提供されていません
KCl	Calbiochem	529552
KH2PO4	Calbiochem	529568
KHCO3	Sigma	60339
LAMP-1 Antibody	Abcam	ab25245
Lane Marker Reducing Sample Buffer	Thermo Scientific	39000
Malate	Sigma	M1000
MgCl2	Calbiochem	208291	ミトコンドリアアッセイ溶液の構成要素。サプライヤー/カタログは提供されていません