高高度の低酸素状態をシミュレートすると、ラットの創傷治癒が遅れる

サマリー

本研究は、高地低気圧性低酸素条件下での創傷治癒遅延モデルをラットモデルとして開発し、予備的に検証しました。

要約

高地低気圧状態は創傷の長期的な低酸素状態や治癒障害を引き起こす可能性がありますが、標準化されたモデルは依然として少なく存在します。本研究では、創傷遅延治癒モデルを開発し、制御された低圧システムを用いて高地低酸素症をシミュレーションすることで予備的に検証しました。ラットは3000m(気圧70.1 kPa、部分酸素圧14.7 kPa)から8000 m(大気圧:35.6 kPa、部分酸素圧:7.5 kPa)の模擬高度で飼育され、酸化ストレスおよび皮膚低酸素状態を評価しました。結果は、高度6000mの模擬で死亡リスクが増加し、5000m以下では耐性が観察されることを示しました。高度上昇は酸化ストレスの悪化と皮膚の低酸素症の増加と関連があり、傷の治癒に高度依存的な遅延、灌流の低下、コラーゲンの再形成抑制、炎症反応の悪化が見られた。血管再生因子のアップレギュレーションがあったにもかかわらず、微小血管密度は減少しました。全体として、本研究は高地低酸素症による慢性創傷のメカニズムおよび介入の調査に適したラットモデルを開発し、予備的に検証しました。

概要

皮膚創傷修復は、広く存在し重大な臨床的課題となっています。急性外傷からさまざまな治癒しにくい傷まで、これらの状態は医療システムや患者の生活の質に持続的な負担をかけています。1,2,3,4,5,6。創傷治癒は単一の出来事ではなく、高度に調整された重なり合う多段階のプロセスです。炎症細胞、間質細胞、角化細胞、微小血管系が、細胞外マトリックスと多様なシグナル伝達ネットワークの共同調節のもとでバリアを再構築し、組織を再構築します。.修復はエネルギー集約的で内部環境に極めて敏感であるため、酸化ストレスの高まり、免疫調節障害、微小循環灌流の障害など、全身代謝や生理状態の変化は複数のポイントで正常な修復カスケードを妨げ、炎症の長期化、再生不十分、異常な再構築を引き起こす可能性があります。9,11,12,13^。14、15。

酸素供給は創傷修復プロセスを制限する重要な要素であり、エネルギー代謝や細胞の移動・増殖に関与し、また低酸素シグナル伝達経路を通じて血管新生や炎症反応を調節します(^16,17,18)。初期創傷期の一時性低酸素は低酸素誘発因子を安定させ、適応的修復プログラムを開始します。しかし、低酸素症が過度または持続的になると、血管新生シグナルが補償的に上行しているものの、効果的な微小血管再建に翻訳できないことがあります。一方で、マクロファージの表現型切り替えや炎症性退行はバランスの崩れやすくなり、「低酸素-炎症-再血行不全」という悪循環を形成します^19,20,21,22。これは特に高地環境で重要であり、大気圧の低下は吸入酸素分圧を下げ、持続的な低酸素状態を引き起こし、創傷治癒障害や感染関連合併症のリスクを高めます(23,24,25,26)。

高地への曝露は、人間において著しい低酸素ストレス反応を引き起こします²⁷。高地環境は持続的な組織の低酸素症、不十分な灌流、創傷部位での炎症反応を引き起こす可能性があります²⁸。これらの病態生理的変化は、過剰な活性酸素種を促進し、プロテアーゼを活性化し、細胞老化を誘発し、同時に間葉幹細胞の機能を妨げることで治癒過程を妨げる可能性があります(^29,30)。高地曝露が人間の皮膚創傷治癒に与える影響を直接評価する研究は限られています。したがって、低気圧低酸素動物モデルの利用は、高度関連要因が創傷修復に与える影響の検証に役立ちます。

固定高度での従来の動物モデルでは創傷治癒の遅れが報告されています。しかし、高度依存的な影響、低気圧状態への長期曝露の安全性閾値、局所皮膚低酸素症の直接的な証拠は依然として不明である²⁶。さらに、治癒障害の体系的な評価が不足しており、その基礎となるメカニズムや介入対象の特定に関する研究が制限^{されています。}本研究では、低気圧制御システムに基づく皮膚創傷モデルを開発し、制御条件下での高高度低気圧低酸素をシミュレートしました。段階的な模擬高度曝露戦略を用い、まず持続的な低気圧曝露の安全範囲を定義し、全身指標を通じて低気圧低酸素の生物学的影響を評価しました。重要なのは、低気圧環境が実際に局所的な皮膚酸素供給制限を引き起こすことを生体内でさらに検証したことです。その後、持続的な低気圧性低酸素が高度依存的に創傷閉合を遅らせ、組織学的変化や主要経路異常を伴うことを示しました。全体として、本研究は高地低酸素に関連する慢性創傷の動物モデルプラットフォームを開発し、予備的に検証し、メカニズムの解明とその後の治療戦略の体系的評価を可能にしました(³²)。

プロトコル

動物を対象としたすべての実験手順は、中国電子科学技術大学(第106142025091534170号)および陸軍医科大学(第4号)の倫理委員会によって審査・承認されました。AMUWEC20265509)。本研究に関わる実験設計および解析のグラフィカルワークフローは 図1に示されています。さらに、本研究で使用される試薬および装置は 材料表に記載されています。

実験動物と倫理的声明
本研究は、中国の成都大樹実験動物有限公司から購入した雄のスプラグ・ドーリー(SD)ラットを用いました。すべての動物は実験前に標準条件下で7日間の順応期間を経ました。

参加および除外基準
動物の対象基準は以下の通りです:生後6〜8週のオスSDラット、体重200〜250g、健康に見える正常な行動、皮膚病変や感染症がないこと。

動物除外基準は以下の通りです:創傷モデル後に明らかな感染が認められた創傷;非標準的な治癒や裂傷を伴う傷、実験中の死亡、または麻酔による事故死。

データポイント除外基準は以下の通りです:広範なかさぶた、毛髪の詰まり、または不均一な照明を伴う創傷画像;動きのアーティファクトを示すレーザースペックルコントラストイメージング(LSCI)画像;明らかなしわ、断片化、または欠損した標的部位を示す組織切片;血清サンプルは明らかな溶血を示し、過剰露出または誤った抗体局在を伴う免疫蛍光(IF)または免疫組織化学(IHC)画像

除外の取り扱い:
除外されたすべての動物またはデータポイントについては、各グループの最終有効なサンプルサイズがすべての評価解析でN≥3であることを補足実験で再取得しました。

低圧制御システムと高地低酸素環境のシミュレーション
低気圧制御システムを用いて高高度低酸素環境のシミュレーションが確立されました。このシステムは、異なる高度に対応する大気圧を正確に再現することでキャビン空気圧を正確に調整し、周囲の酸素分圧を下げ、制御された低酸素曝露を誘発します(図2A)。

キャビン圧力は3000m、4000m、5000m、6000m、7000m、8000mの高度をシミュレートするように調整され、詳細なパラメータは 表1に示されています。実験を通じて、SDラットは実験の割り当てに応じてグループに分類されました。キャビン運用中は、内部圧力、温度、湿度を継続的に監視し、圧力以外の環境条件が標準的な実験室の居住環境と同等であることを確認しました。居住環境は22〜24°Cの気温、相対湿度50〜60%、12時間の明暗サイクル、そして標準的な食事と飲料水の無料アクセスを提供していました。

低気圧曝露の安全性評価と生存分析
持続的な低気圧曝露の安全範囲を評価するため、ラットは個別に番号付けされ、コンピュータ生成の乱数列(ExcelのRAND関数)を用いて実験群にランダムに割り当てられました。この割り当ては、その後の動物ケア、データ収集、またはアウトカム評価に関与していない研究者によって実施されました。高地勾配への曝露を含む動物実験に基づき、各グループのサンプル数は^12,33と設定されました。ラットは標高500mの標準的な対照群と、3000m、4000m、5000m、6000m、7000m、8000mの模擬標高グループに分けられました。各グループのラットはそれぞれの環境に30日間連続して飼育されました。2日ごとに、低圧制御システムはケージの清掃や食料・水の供給のために30分間海面レベルまで一時的に復旧されます。減圧および再減圧時には、気圧外傷のリスクを最小限に抑えるため、圧力変動率は約300 m/分に維持されます。この期間中、すべてのラットの一般的な状態や死亡事象が毎日観察・記録されました。生存曲線はカプラン・マイヤー法を用いてプロットされ、対数ランク検定でグループ間の生存差を比較しました。

血清酸化ストレス関連マーカーの検出
低気圧曝露21日目には、麻酔下のラットから静脈血液サンプルを採取しました。常温で放置した後、血清は遠心分離(1,000 × g 、4°Cで15分間)で分離され、-80°Cで保存して後回の使用に備えました。乳酸脱水素酵素(LDH)、マロンジアルデヒド(MDA)、および超酸化物ディスムターゼ(SOD)の血清レベルは、対応するアッセイキットを用いて測定されました。

皮膚組織の低酸素状態の評価
低酸素検出キットは皮膚組織の低酸素症評価に使用されました。簡単に言うと、低気圧曝露の4日目と7日目に、ラットに腹腔内注射(60 mg/kg)を投与しました。ラットは注射から1時間後に安楽死させられ、背中の皮膚組織を分析のために採取しました。詳細な安楽死手順は以下の通りです。アメリカ獣医医師会の安楽死に関するガイドラインによれば、動物は誘導チャンバーに入れられ、4〜5%のイソフルランを含む酸素を用いて麻酔を誘発しました。動物が意識を失った後、イソフルラン濃度は2〜3%に下げられ、少なくとも10分間維持されます。頸椎脱臼を確認法として行う前に、心拍と呼吸が停止していることを確認しなければなりません。組織サンプルは液体窒素でクライオ保存され、-80°Cで保存され、その後の使用に備えました。切片はクライオスタット用マイクロトームで準備されました。IF染色は組織内の低酸素領域を標識するために行われました。

すべての蛍光画像は自動スライドスキャナーで取得されました。蛍光パラメータの設定は以下の通りです:DAPI(励起波長365 nm ± 10 nm、発光波長440 nm± 40 nm)、Cy3(励起波長542–566 nm、発光波長579–611 nm)、およびCy5(励起波長628 nm、発光波長692 nm)。低酸素信号はImageJソフトウェアを用いて定量的に解析されました。

ラットにおける全層皮膚創傷モデル
持続的な低気圧状態下での皮膚創傷治癒の変化を評価するため、まずラットをグループ化し、それぞれの環境に順応させてから創傷モデリングを行いました。ラットは個別に番号付けされ、正常酸素対照群または低圧曝露群のいずれかにランダムに割り当てられ、3000m、4000m、5000mの高度をコンピュータ生成の乱数列(ExcelのRAND関数)でシミュレートしました。このランダム化は、その後の創傷創設、術後ケア、アウトカム評価に関与していない研究者によって実施されました。各グループの詳細なパラメータは以下の通りです。ノルキシックコントロール群は海抜500m(大気圧:101 kPa、部分酸素圧:21 kPa)に位置していました。3000m群(70.1 kPa、14.7 kPa)、4000m群(61.6 kPa、13.1 kPa)、そして5000m群(54 kPa, 11.3 kPa)です。

7日間の適応期間後、SDラットは麻酔され、2%イソフルランの吸入による麻酔維持が行われました。同時に、標有された手術部位にエピネフリンを含む5%リドカイン(希釈比:1:100,000)の局所浸潤注射を施し、術中期期鎮痛と止血効果を提供します。生検パンチ(基部に直径10mmの円形ブレード)を使い、皮膚の切開を行います。生検パンチをラットの背側皮膚に押し当て、円形の刃が徐々に皮膚を切り裂き、表面の皮下筋膜に到達するように優しく回転させます。生検パンチを取り除くと、直径約10mmの規則的な円形皮膚切開が形成されます。

創傷創設後、各グループのラットは元の環境に戻され、実験終了点まで維持され、創傷治癒全体があらかじめ定められた酸素条件下で進行するようにしました。

創傷治癒過程のマクロ評価
傷の写真は、均一な照明と一定の撮影距離のもと、創傷後形成日目0、2、4、6、8、10、12、14日に撮影されました。創傷面積は画像Jを用いて測定されました。各時刻で得られた創傷画像は画像Jにインポートされ、スケールバーに応じて較正され、創傷マージンは手動で輪郭を描いて創傷面積³⁴を決定しました。創傷治癒率は次のように計算されました:創傷治癒率(%) = (初期創傷面積 − 現在の創傷面積)/初期創傷面積 × 100%。

創傷微小循環の評価
創傷治癒7日目に、創傷部位の微小循環血流をLSCIシステムを用いて評価しました。検査前に、ラットは2%イソフルランを吸入して麻酔し、体温を維持するために温度管理された手術台に固定されました。背側の創傷部分は完全に露出しており、レーザースペックルプローブは傷口の約20cm上に垂直に配置されていました。プローブの出力は110 mW、サンプリング周波数は30 Hz、露光時間は3秒に設定されていました。暗い条件下で、創傷部位の血流灌流疑似カラー画像を取得します。LSCIソフトウェアを使って、血流灌流の擬似カラー画像で創傷部位を手動で輪郭を描き出します。ソフトウェアはその部位の血流灌流値を3秒単位(任意の単位[A.U.])で自動的に計算します。最後に、灌流値を適切なソフトウェアにエクスポートしてプロットを行います。

組織学的染色およびコラーゲン再構築解析
動物は指定された時期に安楽死され、傷や周囲の皮膚組織は収穫、固定、脱水、パラフィン埋め込み、切片化が行われました。ヘマトキシリンおよびエオシン(HE):創傷幅、再上皮化範囲、再生された表皮厚の評価に用いられます。マッソンの三色染色:コラーゲン繊維の沈着評価とコラーゲン体積分数の計算に用いられます。シリウスレッドステイン:偏光顕微鏡下でコラーゲンタイプI(COL I)とコラーゲンタイプIII(COL III)を区別し、COLI/COL III比率を計算するために使用されます。

免疫組織化学的染色
パラフィン切片は脱ワックス、再水化、抗原回収を経て、IHCまたはIF染色を行った。一次抗体は4°Cで一晩インキュベートされ、その後対応する二次抗体を追加しました。特定の抗体情報およびそれに対応する希釈は材料表に記載されています。IHC切片はDABで開発され、IF切片は核^35,36に対してDAPI染色を用いた蛍光二次抗体を用いた。すべての画像は同じ条件下で取得され、ImageJソフトウェアで定量化されました。

統計解析
すべてのデータは平均±標準偏差として提示されています。統計解析はGraphPad Prismソフトウェアを用いて実施されました。複数グループ間の単一時点比較には一方移動分散解析(ANOVA)を適用し、有意な全体差異が検出された場合は、その後のグループ間分析にTukeyの多重比較検定が用いられた。複数の時点にわたる創傷治癒データについては、治療群と時間を独立した要因として含めて、主効果およびそれらの相互作用を評価するために二方向ANOVAを実施しました。同様に、Tukeyの多重比較検定を用いた事後分析も実施されました。統計的検出力をさらに評価するため、G*Powerソフトウェアで主要評価項目(創傷治癒14日目)に基づく事後検能分析を実施しました。

生存分析ではカプラン・マイヤー法を用いて生存曲線をプロットし、対数ランク検定でグループ間の生存差を比較しました。複数群間のペアワイズ比較では、ボンフェローニ補正を適用し、複数比較によるタイプIエラーのリスクを制御しました。すべての統計検定は両側で、P < 0.05は統計的に有意とされました。

創傷面積測定、組織学的および免疫組織化学的定量解析、LSCI解析を含むすべてのアウトカム評価は、研究グループの割り当てを盲検化された単一の研究者によって実施されました。

結果

低圧による持続性低酸素症の安全範囲の検証
カプラン・マイヤー生存分析では、模擬高度が上昇するにつれて生存曲線が徐々に下降し、死亡事象は6000m群で最初に観測されました(図2B)。ボンフェローニ補正とのペアワイズ比較では、対照群と6000mから8000m群の間で統計的に有意な生存率差は認められませんでした。30日目時点で、対照群、3000m群、4000m群、5000m群、6000m群、7000m群、8000m群の最終生存率はそれぞれ100%、100%、100%、100%、83.33%、75.00%、58.33%でした。30日間の曝露期間中に高度≤5000mの模擬高度に曝露されたラットでは有意な生存リスク増加は観察されませんでした。これらの生存データに基づき、その後の研究における実験上限が定められました。標高5000mは比較的安全な閾値として選ばれました。なぜなら、この高度以下では死亡が起きていないからです。一方、より高い高度(≥6000m)は重大な死亡リスクを伴い、創傷治...

ディスカッション

高地の環境は組織の低酸素症、血液灌流の減少、炎症反応を引き起こし、創傷治癒を妨げ、その結果として活性酸素種の過剰産生、プロテアーゼ活性化、細胞老化、間葉幹細胞の機能障害を促進します 27,28,29,30.現在の人間の高高度影響に関する研究の限界を踏まえると、高地低酸素を模倣する標準化された動物モデルの開発は非常に重要です。

生存分析により、30日間最大5000mまでの連続曝露は死亡リスクを有意に増加させなかったのに対し、高高度では累積的な生存リスクが生じることが示されました。高度≥6000mで模擬されたグループの死亡は、主に最初の数日間に集中していました。これは高地病23,37,38と

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
自動スライドスキャナー	オリンポス	VS200	組織切片スキャン
牛血清アルブミン(BSA)	サービスバイオ	GC305010	IHC/IF用のブロッキング試薬
CD206抗体	プロテインテック	18704-1-AP	M2マクロファージの検出(希釈1:200)
CD31抗体	アブカム	AB182981	微小血管密度の検出(希釈1:800)
CD86抗体	華碧	ER1906-01	M1マクロファージの検出(希釈1:200)
CK19抗体	華碧	ET1601-6	再上皮化の評価(Dilution 1:200)
DAB基板キット	ZSGB-BIO	ZLI-9018	IHC染色のためのクロモジェニック基質
FITC結合ヤギ抗ウサギIgG	サービスバイオ	GB22303	IFに対する蛍光二次抗体(希釈1:100)
G*パワー	ドイツ・デュースブルク・エッセン大学	www.gpower.hhu.de	統計的検出力の計算
GraphPad Prismソフトウェア	GraphPadソフトウェア	https://www.graphpad.com/	統計解析とグラフ生成
ヘマトキシリン染色溶液	J&Kサイエンティフィック	LM10N13	H&E染色
HIF-1&α;抗体	バイオス	BS-0737R	低酸素関連シグナルの検出(希釈1:100)
HRP結合ヤギ抗ウサギIgG	サービスバイオ	GB23303	IHCの二次抗体(希釈1:100)
低圧制御システム	上海玉炎インスツルメンツ有限公司	LP-1500	高地の低気圧性低酸素症を段階的にシミュレートするために使用
ヒューポキシプローブ-1キット	ヒューポキシプローブ社	HP1-100	生体内での低酸素検出に使用
IF555 チラミド信号増幅キット	サービスバイオ	G1233	蛍光信号増幅の強化に使用
IL-10抗体	華碧	HA722032	抗炎症サイトカイン検出(希釈1:100)
IL-1とベータ;抗体	華碧	HA723965	炎症促進サイトカイン検出(希釈1:100)
ImageJソフトウェア	米国国立衛生研究所(NIH)	https://imagej.net/ij/download.html	画像定量化
イソフルラン	RWDライフサイエンス株式会社	R510-22-16
Ki-67抗体	華碧	HA721115	ケラチノサイト増殖の検出(希釈1:400)
レーザースペックル血流イメージングシステム	RWDライフサイエンス株式会社	RFLSI ZW	評価血液灌流
LDHアッセイキット	南京建成生物工学研究所	A005-1-2	血清LDH測定
マッソンSトリクローム染色キット	サービスバイオ	G1006-100ML	コラーゲン沈着分析
MDAアッセイキット	南京建成生物工学研究所	A003-1-1	脂質過酸化評価
シリウスの赤いステインキット	サービスバイオ	G1078-100ML	コラーゲンI/III分化
SODアッセイキット	南京建成生物工学研究所	A001-1-1	血清SOD活性測定
TNF-およびα;抗体	華碧	ER65189	炎症促進サイトカイン検出(希釈1:200)
VEGF-A抗体	華碧	ET1604-28	血管新生関連シグナル伝達の検出(希釈 1:200)