セスキテルペンラクトンXTTは、マクロファージにおけるリポ多糖(LPS)による炎症反応を効果的に減弱します。XTTはIKKα/βを標的としてNF-κBシグナルを阻害し、MAPKの活性化に影響を与えず、 これにより体外で強力な抗炎症効果を発揮します。
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研究記事
セスキテルペンラクトンXTTは、マクロファージにおけるリポ多糖(LPS)による炎症反応を効果的に減弱します。XTTはIKKα/βを標的としてNF-κBシグナルを阻害し、MAPKの活性化に影響を与えず、 これにより体外で強力な抗炎症効果を発揮します。
核因子κB(NF-κB)カスケードの調節障害は炎症性疾患の進行と密接に関連しています。IκBキナーゼ(IKK)はNF-κB活性の中心調節因子として確立されており、炎症性病理の治療に魅力的な治療候補となっています。セスキテルペンラクトン1β-ヒドロキシル-5α-クロロ-8-エピ-ザンタチン(XTT)は強力な抗がん効果を持つことが確認されています。しかし、その抗炎症作用やその根本的な分子メカニズムは依然として不明です。本研究では、XTTがリポ多糖(LPS)活性化されたRAW264.7マクロファージにおける一酸化窒素(NO)およびプロスタグランジンE2(PGE2)の合成を著しく抑制しました。XTTはまた、LPS誘発mRNAの誘導性一酸化窒素シンターゼ(iNOS)、シクロオキシゲナーゼ-2(COX2)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、インターロイキン-1β(IL-1β)、インターロイキン-6(IL-6)のレベルを大幅に低下させました。さらに、XTTはLPS処理によって誘導されるiNOSおよびCOX2のタンパク質レベルをダウンレギュレーションしました。機構レベルでは、XTTはミトゲン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)カスケードの活性を著しく変化させませんでした。逆に、XTTはIKKα/βと相互作用することでLPS誘発によるリン酸化および阻害性κBα(IκBα)の分解を強く阻害し、NF-κBの核転座を阻害しました。これらのデータを総合すると、XTTはIKKα/βを標的化しNF-κBシグナルを阻害することで、体外で強力な抗炎症効果をもたらすことが示されています。これらの結果は、XTTが抗炎症薬の開発における有望なリード化合物として機能する可能性を示唆しています。直接的なIKKα/β阻害および治療可能性を検証するためには、さらなる生化学的および生体内研究が必要です。
炎症は、感染、組織損傷、その他の環境的課題に反応するための厳密に制御された生物学的プロセスです。急性炎症反応は一般的に保護的ですが、炎症経路の持続的な活性化は組織の恒常性を乱し、炎症性腸疾患(IBD)や関節リウマチ(RA)などの慢性疾患の発症や進行に寄与する可能性があります2。多くの細胞内シグナル伝達ネットワークが炎症調節に関与しており、その中でも核因子κB(NF-κB)経路は最も広く研究されているものの一つです。
NF-κBファミリーのメンバーであるp50、p52、p65(RelA)、RelB、c-Relは、免疫や炎症に関与する遺伝子の発現を調節する二量体転写因子として機能します。基礎条件下では、NF-κB二量体はκB(IκB)タンパク質阻害剤と結合することで細胞質内で不活性のままです。リポ多糖(LPS)や腫瘍壊死因子α(TNF-α)などの炎症性メディエーターによる刺激を受けると、IκBキナーゼ(IKK)複合体が活性化され、IκBαをリン酸化してユビキチン化と分解が進みます。この過程により、NF-κB複合体が核内に蓄積され、炎症性メディエーターおよびサイトカインの転写を開始する6。過剰または持続的なNF-κB活性化は、さまざまな炎症性および自己免疫疾患と密接に関連しているため、IKKシグナル伝達レベルでの薬理学的介入は大きな関心を集めています7,8,9。
天然産物は長らく薬開発において重要な供給源であり、抗炎症治療薬も含まれます。1β-ヒドロキシル-5α-クロロ-8-エピキサンタチン(XTT)は、キサンシウムシビリクムから分離されたセスキテルペンラクトンです11,12。これまでの研究では、XTTがROS媒介によるERK/p38 MAPK活性化およびグルタチオン枯渇によるJAK2/STAT3阻害を介して、ヒト肝細胞がん細胞における細胞増殖を抑制し、アポトーシスを引き起こすことが示されています13。しかし、XTTの抗炎症作用およびそれに関連する分子メカニズムはまだ十分に解明されていません。
現在の研究結果は、XTTが vitroで顕著な抗炎症効果を示すことを示しています。機構的調査により、XTTはIKKα/βと相互作用し、NF-κBシグナル伝達を抑制することで、活性化したマクロファージにおける炎症反応を抑制することが示されています。これらの発見は、XTTが抗炎症薬の開発における有望なリード化合物である可能性を示唆しています。
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この研究は確立された商業細胞株のみを対象とし、ヒト参加者、臨床サンプル、動物実験は含まれていませんでした。したがって、機関倫理の承認やインフォームド・コンセントは必要ありませんでした。すべての実験は機関の実験室安全ガイドラインに従って実施されました。有害試薬は指定された排気フードで取り扱い、適切な個人防護具(PPE)が使用されました。化学廃棄物および生物廃棄物は機関の規則に従って処分されました。プロトコルで使用される化学物質、キット、試薬は 材料表に記載されています。
1. 細胞培養
RAW264.7マウスマクロファージ、HeLaヒト子宮頸がん細胞、HEK293Tヒト胚性腎細胞は中国科学院細胞バンク(中国上海)から購入されました。すべての細胞は、10%胎児用牛血清(FBS)と1%ペニシリン・ストレプトマイシンを含むDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)で維持されました。培養環境は37°C、CO₂5%、飽和湿度に設定されました。
2. 細胞生存率アッセイ
細胞生存率はCell Counting Kit-8(CCK-8)アッセイ で 評価されました。RAW264.7セル(2.5 ×10 4 セル/ウェル)を96ウェルプレートにプレートし、37°Cで一晩培養しました。 その後、細胞はLPSの有無にかかわらず24時間、異なる濃度のXTTで処理されました(0.5 μg/mL)。LPS濃度と治療期間は、予備実験で中程度の炎症反応を誘導しつつ有意な細胞毒性を生じさせないよう最適化されました。その後、各ウェルに10μLのCCK-8試薬が追加され、プレートは2時間にわたり37°Cで維持されました。マイクロプレートリーダーを用いて540 nmの吸収度を測定しました。
3. 細胞培養培地中のNOおよびPGE₂レベルの測定
RAW264.7細胞は24ウェルプレートに2.5 × 105 セル/ウェルでプレートされ、37°Cで一晩培養されました。 細胞はLPS刺激の2時間前にXTTで事前処理され、さらに24時間はTNF-α(15 ng/mL)で投与されました。2時間の治療前期間は、炎症挑戦前にXTTと細胞標的の十分な相互作用を可能にするために選ばれました。培養培地中の一酸化窒素(NO)およびプロスタグランジンE₂(PGE₂)のレベルは製造元のプロトコルに従って定量化されました。
4. 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)
RAW264.7細胞(2×10 個6細胞)を6ウェルプレートに一晩かけてプレートし、LPSチャレンジ(0.5 μg/mL)を行う前に2時間異なる用量のXTTで前処理しました。全RNAは製造元の指示に従いTRIzol試薬を用いて分離されました。RNA濃度と純度は分光光度計で評価され、A260/A280比>1.8のサンプルが下流解析に使用されました。
総RNA(2μg)はcDNA合成キットを用いて20μLの最終反応体積でcDNAに逆転写されました。定量的リアルタイムPCRは、SYBRグリーン化学を用いてリアルタイムPCR検出システム上で実施されました。プライマー配列は以下の通りです。
INOSフォワード:5′-GGA TCT TCC CC CCA ACC A-3′
INOS 逆方向:5′-AAT CCA CAA CTC GCT CCA AGA TT-3′
COX2フォワード:5′-CAA CAC CTG AGC GGT TAC-3′
COX2リバース:5′-GTT CCA GGA GGA TGG AGT-3′
IL-1β 前方:5′-GCC TTG GGC CTC AAA GGA AAG AAT C-3′
IL-1β逆:5′-GGA AGA CAC AGA TTC CAT GGT GAA G-3′
IL-6フォワード:5′-TGG AGT CAC AGA AGG AGT GGC TAA G-3′
IL-6 逆:5′-TCT GAC AGT GAG GAA TGT CCA C-3′
TNF-αフォワード:5′-CAC GCT CTT CTG TCT-3′
TNF-α 逆方向:5′-GGC TAC AGG CTT GTC ACT C-3′
GAPDH フォワード:5'-TGC ACC ACC AAC TGC TTA(ゴール-3')
GAPDH逆方向:5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3′
PCR増幅手順は、95°Cで5分間の初期変性、その後95°Cで15秒、60°Cで30秒の39サイクルで実施されました。相対遺伝子発現レベルは、GAPDHを内部対照として2−ΔΔCt 法を用いて算出しました。
5. ウェスタンブロッティング
処理後、RAW264.7細胞はプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むRIPAバッファーで均質化されました。これらの阻害剤は、タンパク質分解や脱リン酸化を防ぐため、使用直前に新鮮に調製されました。総タンパク質レベルはBCAアッセイキットを用いて定量化しました。同量のタンパク質を10%のドーデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロース膜に移しました。移植後、膜はTBSTで調製された5%脱脂乳でブロッキングを行い、その後4°Cで一次抗体(希釈1:1,000)で一晩プローブしました。 次に、室温で1時間間、ホースラディッシュ過酸化酵素結合の二次抗体(1:5,000希釈)で膜を探査しました。タンパク質バンドは化学発光検出システムを用いて検出され、バンド強度は密度定量 解析で 解析されました。
6. 免疫蛍光アッセイ
HeLa細胞は6ウェルプレートにシードされ、TNF-α刺激(15 ng/mL)を30分間行う前に4時間、XTT(8 μM)で事前処理されました。この4時間の前潜伏期間は、NF-κB活性化前のターゲットへの関与を最大化するために選ばれました。細胞は4%パラホルムアルデヒドで15分間固定され、0.25%トリトンX-100で室温で15分間透過させられました。2%の牛血清アルブミン(BSA)と10%のヤギ血清(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈してブロッキングした後、細胞は抗p65一次抗体(1:250希釈)で4°Cで一晩培養され、その後TRITC結合二次抗体(1:1,000希釈)で室温で1時間プローブしました。核はDAPI(0.5 μg/mL)で暗闇で5分間カウンターステインされました。蛍光顕微鏡を用いて蛍光画像を撮影しました。HeLa細胞は、細胞質と核の比率が大きいため、p65の核転座の可視化を容易にするため選ばれました。
7. 細胞質および核の分画
HeLa細胞は4時間のXTTでプレインキュベートされ、その後TNF-α(15 ng/mL)で30分間刺激されました。細胞は採取され、冷たいPBSで洗浄され、製造元の指示に従い市販の核および細胞質タンパク質抽出キットを用いて細胞質および核タンパク質抽出のために処理されました。すべての処置はタンパク質の完全性を保つために氷上で行われました。
8. セルラー熱シフトアッセイ(CETSA)
CETSAは前述の通り実施されました。約1×10個の7 HeLa細胞を採取し、プロテアーゼ阻害剤を含む500μLの冷たいPBSに再懸濁させ、その後液体窒素中で3回の凍結・解凍サイクル で 溶解しました。細胞溶解液は20,000 × gで4°Cで15分間遠心分離されました。 得られた上清液は均等に2つのグループに分けられ、室温で1時間のXTT(100μM)またはDMSOのいずれかで処理されました。XTT(100μM)はCETSA実験における検出感度向上のために適用されました。サンプルは7本のチューブに分けられ、指定された温度で3分間加熱され、その後室温でさらに3分間培養されました。免疫ブロッティング解析のために可溶性タンパク質分画を収集しました。
9. 分子ドッキング
分子ドッキング解析は前述の通りに実施されました。IKKβの結晶構造(PDB ID: 3BRTおよび4KIK)はタンパク質データバンク(PDB)から取得されました。タンパク質構造はPyMOL(バージョン2.3.4)で前処理され、水分子、元の配位子、不純物を除去し、その後水素原子の付加が行われました。ガスタイガー充電が計算され、AutoDock Tools(バージョン1.5.6)を用いてアクティブポケットが特定されました。その後、タンパク質構造はPDBQT形式で保存されました。
XTT構造はChem3D(バージョン15.1)で生成され、エネルギー最小化 によって 最適化されました。セミフレキシブルドッキングはAutoDock Vina(バージョン1.1.2)を使用して行われました。グリッドボックスはアクティブなポケットを完全に覆うように設計され、その他のパラメータはデフォルト設定のままにされました。結合エネルギーが最も低く、構造が最も安定したドッキングポーズが分析のために選ばれました。結合エネルギーが−5 kcal/mol未満であれば、公開された基準に基づき強い結合親和性を示すと考えられました。さらにPyMOLは結合モードの可視化、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、潜在結合部位の評価にも用いられました。
10. 統計解析
すべての統計解析はGraphPad Prism 5.0ソフトウェアを使用して実施されました。データは3つの独立した実験からの平均±標準誤差(SEM)として提示されます。統計的有意性は一方向分散分析(ANOVA)を用いて評価し、その後ダネットの事後検定を行った。p < 0.05の値は統計的に有意とされました。
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XTTはLPSまたはTNF α刺激されたRAW264.7マクロファージにおけるNOおよびPGE₂産生を阻害しました
XTTの抗炎症効果が細胞毒性と独立しているかどうかを明らかにするため、LPSの有無にかかわらずXTT治療後のRAW264.7細胞生存率を評価しました。0.5〜8μMの濃度では細胞生存率の著しい低下は検出されず、実験条件下で良好に耐容性があったことが示唆されています(図1)。これらの発見に基づき、2〜8μMの濃度が後続解析のために選定されました。
LPSによる刺激は培養培地中のNOおよびPGE₂の蓄積を著しく増加させました。XTTの前処理は両方の反応を濃度依存的に減弱しましたが、刺激されていない細胞にはほとんど効果がありませんでした。RAW264.7細胞にTNF-αを照射した場合も、NO産生の類似の減少が観察されました。さらに形態学的検査により、LPS曝露後に拡散増加と偽足形成を特徴とする活性化された形態...
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セスキテルペンラクトンは、抗菌、抗炎症、解熱、解毒など多様な薬理学的活性を持つ天然産物の一群です15。過去の研究では、Xanthium sibiricumから単離されたキサンタノリド型セスキテルペンラクトンであるXTTが、ヒト肝細胞がん細胞において強力な抗増殖およびプロアポトーシス効果を示すことが示されています13。本研究では、LPS刺激されたRAW264.7マクロファージにおけるXTTの抗炎症特性を評価し、分子メカニズムのさらなる探究を行った。活性化されたマクロファージは炎症性メディエーターやサイトカインを産生し、炎症シグナル伝達を増幅します。この生物学的特徴に沿って、LPS刺激はNOおよびPGE₂産生を増加させた一方、XTTはiNOSおよびCOX2発現を同時に減少させ、16,17,18,19を挙げました。
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著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。
この研究は中国国家自然科学基金(番号82004031)、四川省伝統薬研究計画(番号2024MS566)、および中国国家重点研究開発計画(番号2023YFC3504402)の支援を受けました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Enhanced chemiluminescence reagent D20A2:D21A2:D22A2:D23A2: D24A2:D25A2:D26A2:D27A2:D28A2: D29A2:D30A2:D29 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P90720 | luminescent signal detection |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibodies | Signalway Antibody (Nanjing) | L30118 | specifically binds to the primary antibody |
| p65 primary antibody | Bioworld | BS4139 | specifically recognizes NF-κB p65 subunit protein |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | SCR_018042 |
| 0.45 μM Ployvinylidence fluoride membrane | Millipore | PR05509 | adsorb protein molecules |
| 1β-hydroxyl-5α-chloro-8-epi-xanthatin | Chengdu Institute of Biology | natural monomeric compounds | |
| All-in-One cDNA Synthesis SuperMix | Bimake (Shanghai) | B24408 | reverse-transcribe |
| BAY11-7082 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | SF0011 | IκB/IKK inhibitor |
| Bcl2 antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 32012 | AB_3751037 |
| Bicinchoninic Acid (BCA) kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0010S | total protein quantification |
| CCK-8 agent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C0038 | cell viability measurement |
| Chemiluminescence detection system | Millipore, Bedford, USA | P90720 | acquire and process luminesence signals |
| COX-2 antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 33345 | AB_3676692 |
| DMSO | Sangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd. | A100231-0500 | solubilize compounds |
| GAPDH antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 41549 | AB_3751036 |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | image acquisition and analysis |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | gradient annealing temperature |
| Griess agent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | S0021S | NO quantification |
| Human cervical carcinoma HeLa cells | The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | SCSP-504 | Human-derived cells |
| Human TNF-α | Novus Biologicals | 210-TA | pro-inflammatory cytokines |
| iNOS antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 48309 | AB_2943634 |
| Laser Confocal Inverted Microscope | Olympus | FV1000 | SCR_016840 |
| LPS ( E.coli 055:B5) | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd | L6529 | establish inflammatory models |
| Murine macrophage RAW264.7 cells | The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | SCSP-5036 | Mouse-derived cells |
| Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0027 | separate cytoplasmic and nuclear proteins |
| PD98059 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1177 | MEK inhibitor |
| P-ERK (Thr202/Thr185) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 12548 | detect the phosphorylation level of ERK protein |
| p-IKKα/β (Ser176/Ser177) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 11931 | AB_3751034 |
| p-IκBα (phospho-Ser32)antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 13776 | AB_3751033 |
| p-JNK (T183/T221) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 13371 | AB_3718662 |
| p-p38 MAPK (Thr180) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 11581 | AB_3751032 |
| Prostaglandin E2 Parameter Assay Kit | R&D Systems | KGE004B | AB_2894942 |
| PS1145 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S7691 | specific IKK inhibitor |
| Rapid SDS-PAGE Gel Preparation Kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | protein separation |
| Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 | SCR_018064 |
| RIPA buffer | Bimake (Shanghai) | P0013C | cell lysis |
| SB203580 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1076 | p38 MAPK inhibitor |
| SP600125 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1460 | JNK inhibitor |
| SYBR Green | Bimake (Shanghai) | B21202 | For real-time quantitative |
| TRITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | A0568 | AB_2893016 |
| TRITC-conjugated second antibody | Beijing Baiao Leibo Technology Co., Ltd. | ZN1992 | AB_3751143 |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | total RNA isolation |
| Vinculin antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 41534 | AB_3751035 |