急性骨髄性白血病の残存疾患を測定可能なLAIP/DfNおよびCD34+CD38(白血病幹細胞豊富集団)に対する多施設フローサイトメトリー

サマリー

本プロトコルは、白血病関連免疫表現型/異常性(LAIP/DfN)解析および表現型定義されたCD34⁺CD38⁻ 白血病幹細胞豊富集団を用いた急性骨髄性白血病の残存疾患測定可能な多施設流式サイトメトリーワークフローを記述しています。

要約

ELN 2025のガイドラインに基づき、急性骨髄性白血病(AML)臨床試験における治療反応評価には、測定可能残存疾患(MRD)の追跡調査が推奨されています。本研究の目的は、AML臨床試験に参加している30のフランス血液検査室を対象に、調和型MRDフロー方式を用いた患者の標準化された追跡調査を実施することでした。同様の結果を得るために、ネットワークはウェットラボ手順から臨床報告書までの推奨事項を確立しました。ELNの推奨に従い、各チューブに8色共通マーカーを義務付けた3チューブパネルを設計し、CD34⁺CD38⁻ 画分におけるバルクセルおよび白血病幹細胞(LSC)豊富集団における白血病関連免疫表現型/異常異常(LAIP/DfN)パターンを特定しました。CD34/CD38/CD45/CD117の骨格を用い、第1管の系統マーカー、第2管のLSC関連マーカー、第3管の単球および分化マーカーで完成させました。このパネルは8色、10色、12色の各フォーマットで使用可能で、複数の従来型フローサイトメータープラットフォームに実装されています。各プラットフォームに適合したフローサイトメーターの設定を提案します。

4つのプラットフォーム間の感度の調和は8ピークの虹色ビーズを用いて行われました。バルク溶解後に免疫染色が行われました。プラットフォーム間のバイアスを検出するため、4つのプラットフォームで新鮮な健康な骨髄サンプルを並行して染色指数をテストしました。定期的な骨髄品質管理サンプルが検査室間で共有され、プロトコルのすべてのステップを検証するために湿式外部品質評価(EQA)を行いました。最後に、センターで得られたデータ分析戦略の標準化が、MRD FCSデータファイルの共有によるドライEQAを用いて評価されました。この多中心アプローチの実現可能性には、機器の感度と試料準備の調和、分析オペレーターの訓練と体系的な教育が必要です。

概要

残存疾患(MRD)とは、治療中または治療後に残存し、形態学的に検出できない少数の白血病細胞を指します。特に骨髄内の芽胞が5%未満の完全寛解の場合に顕著です。臨床急性骨髄性白血病(AML)試験における治療反応評価には、ELN 2025ガイドラインに基づきMRDモニタリングが推奨されます^。逆転写酵素PCR(RT-qPCR)や次世代シーケンシング(NGS)などの分子生物学的手法に加え、マルチパラメトリックフローサイトメトリー(MFC)が一般的に用いられるアプローチです^。

特に臨床試験において一貫したMRD結果を得るためには、2つの戦略があります。MRD測定を単一の検査室に集中させるか、MRD判定に関わる異なる検査室間で再現性を確保するプロトコルを実装することです。サンプル数、試験の規模、検査室がサンプル量を大きくまたは小さい量で処理できる能力が、これらの戦略の選択を決定します。マルチセンター戦略を選択する場合、サイトメータープラットフォーム間の違いや、各施設間の比較分析の必要性に対処しなければなりません。

この目的のために、ELNの勧告および既存報告に基づき、30のフランス血液学研究所で実施された、白血病関連免疫表現型/異常と異なる(LAIP/DfN)解析と表現型定義されたCD34⁺CD38⁻白血病幹細胞(LSC)リッチ検出を組み合わせた標準化された多施設・マルチプラットフォームMRDフローアプローチを記述します。^3,4。

フローサイトメトリーは、診断時に患者の胞胎に特異的なマーカーの発現を含む白血病の「シグネチャー」であるLAIPを定義することを可能にします。治療後、MRDフローにより診断時に特定されたLAIPのモニタリングが可能になります。白血病性芽片は治療圧力の下で免疫表現型を進化・変化させることができるため、第二の戦略を体系的に実施する必要があります。それは、正常な造血と異なる特徴を持つ細胞を特定するDfNアプローチです。この技術は、病気の進行過程や治療中に胞盤に新たなマーカーが現れるかどうかも検出できます。

フランスのAMLフローグループでは、パネル設計が以前に発表されたHOVONの白血球-細胞パターン定義研究に基づいていました。普遍的なLSCまたはLAIPマーカーは存在しないため、LAIP、DfN、CD34⁺CD38⁻ LSC濃縮集団を同時に同定できる3チューブパネルを設計しました。CD34/CD38/CD45/CD117に基づく骨格がすべての管で使用され、1番目の管に系譜マーカー、2番目の管にLSC関連マーカー、3番目の管に単球系譜または分化マーカーを組み合わせて、単球芽細胞芽球を用いたAMLにおけるLAIP定義を完成させました。3本のチューブはすべて診断時および追跡サンプルで取得されます。

白血球形成の病態生理学を考慮すると、焦点は爆発体全体の研究から、最も未成熟な部分を白血病幹細胞豊富集団として特定することへと移っています。Dickらは、免疫不全マウスで白血病を発症する可能性のあるCD34⁺CD38⁻ LSCを記述することで白血病の異質性を示しました^5,6。診断および追跡時のLSC定量化において、ELN DAVIDワーキンググループ^1,7内で抗体パネルおよび分析戦略の標準化に取り組みが進められています。現在、HOVONとALFAの2つのパネルが、CD34⁺CD38^−空間8,9の造血幹細胞群とLSC濃縮集団を区別するために二項LSCマーカーを用いています。

ここで説明する方法は、標準化されたサンプル調製、共通抗体パネル設計、プラットフォーム適応感度設定、LAIP/DfNおよびCD34⁺CD38⁻ のLSC強化解析、外部品質評価、そして多施設AML MRDフローモニタリングのための調和済み臨床報告を組み合わせています。

プロトコル

このプロトコルは、フランス大学病院センターの倫理委員会の勧告とガイドラインに従っています。すべての患者はフランスの法律に従いインフォームド・コンセントに署名しました。この研究プロトコルは、ヘルシンキ宣言(HDF-AML天文台、CNIL 2214454v0)に従い、CHUリヨンの人間倫理委員会およびリールCHUの倫理委員会によって承認されました。同種移植の場合、ドナーはヨーロッパのインターネットベースのProMISEデータベースに含まれ、個人情報の収集に対するインフォームドコンセントが提供されました。データの抽出と分析は、地元の倫理委員会(CNIL2093819)に従って行われました。ネットワークレビューに使用されるすべてのFCSフローファイルはPythonスクリプトで完全に匿名化されました。

1. サイトメーターの設定

1. 8ピークのレインボービーズを使って各サイトメーターに適応したターゲット値を決定します。
2. 各マシン は表1に示された目標値に従って設定します。各チャネルが目標値±5%に達するようにしてください。この設定を体系的に検証し、各プラットフォームの縦断的な感度を維持しましょう。
3. 各抗体に対して単一染色チューブを用いて補償マトリックスを構築し、プラットフォームに応じて補償ビーズや細胞を使用します。
4. 設定および補償行列は、MRD LAIP/DfN、LSC、MonoGran(T1、T2、T3)として識別されたアッセイまたはプロトコルとして保存してください。AML MRD流量定量の取得にはこのアッセイまたはプロトコルを用いてください。

2. ウェットラボ手順

1. 骨髄吸引
   1. 診断時およびモニタリング時点(MRD1、MRD2、MRD3、MRD4、再発時を含む)で1〜2mLのEDTA骨髄を採取します。
   2. 24〜48時間以内にチューブを基準流量ラボに送ってください。
2. 形態学的検査のための骨髄塗抹診断の準備
   1. 骨髄吸引液をガラススライドに一滴垂らします。カバースリップや他のスライドでサンプルを優しく広げます。
   2. 30分乾燥後、メイ・グリュンヴァルト・ギームザ(補足ファイル1)で染みを塗ります。
3. バルク溶解
   1. 骨髄サンプル1〜2 mLに15 mLのNH₄Cl溶解液を加えます。優しく混ぜて室温で10分間孵育させます。
   2. 450 × gで室温で5分間遠心分離し、上清液を捨てます。
   3. 細胞ペレットを10 mLのPBS/0.1% BSAに再懸濁させます。室温で450× gで5分間遠心分離し、上清液を捨てます。
   4. 細胞ペレットをPBS中の30 ×¹⁰ 6 WBC/mL濃度で再懸濁します。
4. 細胞懸濁液の免疫染色
   1. プラットフォームに応じてモノクローナル抗体をT1、T2、T3のチューブに分散させます(表2)。抗体表内の各抗体のクローン、体積、カタログ参照、供給者を記載してください。
      注意:ブリリアントバイオレット染料を使用する各チューブには、抗体を加える前にブリリアントステインバッファーを使用してください。
   2. 100μLの細胞懸濁液に、1チューブあたり2〜3×10、⁶ 個の溶解細胞を追加します。抗体とともに細胞を暗闇の室温で15分間培養します。
   3. 細胞を3mLのPBSで洗浄します。450 gで5分間遠心分離機で×、上清液を捨てます。
   4. 染色された細胞を300μLのPBSに再懸濁します。
      注意:混合抗体カクテルまたは検証済みの乾燥抗体チューブを使用する場合があります。

3. フローサイトメーター取得

1. MRDアッセイまたは取得プロトコルを開き、MRD LAIP/DfNおよびLSC測定用の適応設定と補償マトリックスを開いてください。
2. 診断時およびMRD追跡サンプルで各チューブに最低50万から100万の白血球を採取し、MRD細胞のクラスタリングと低レベルMRDの信頼性を高めます。
   注意:LSC測定には、LSC定量に十分な感度を得るためにチューブ2で最低1,000,000の白血球を取得してください(LOQ 0.002%、LOD 0.001%)^10,11。
3. 診断およびMRDサンプルのFCSデータファイルを保存してください。取得日と患者同定を記録し、追跡後のMRDおよびLSC分析を容易にします。

4. 分析戦略

1. 共通のテンプレートと共通のドットプロットシーケンスを使用し、各センターで使用される解析ソフトウェアに適応したあらかじめ定義された調和ゲーティング戦略を取り入れます。
2. LAIP、DfN、LSC解析の3つのアプローチを用いてゲーティング戦略を適用し、CD34⁺CD38^-分数で白血病細胞を特定します。
3. 好塩基球、形質細胞状樹状細胞、血母細胞、形質細胞、赤血球芽細胞、血小板塊、破片、未溶解赤血球など、潜在的な非特異的事象および正常な生理学的集団を特定し排除します。

5. LAIP/DfNおよび生理集団の定義

1. LAIPを一括で捉えるには、FSC-WとFSC-Hを組み合わせた単一セルゲートを描画します。
2. FSCとSSCの比較に基づいてライブセルゲートを描いてください。
3. CD45の^暗/SSCに爆風ゲートを描いてください。
4. CD34/CD117を使ってプリミティブマーカーゲートを描きます。
5. 固定二パラメータドットプロットを用いて、LAIP1、LAIP2、LAIP3、LAIP4、LAIP5、LAIP6、LAIP7、LAIP8を含む関連するLAIPゲートを描きます。
6. 生理学的個体群
   1. ゲートヘマトゴンは以下の配列を用いています:生細胞、FSC/SSCドットプロットのMNC、CD19/SSCドットプロット、CD34/CD38ドットプロット。CD45/SSCを使ったバックゲート。
   2. 以下の配列を用いたゲート好塩基球:生細胞、FSC/SSCドットプロット上のMNC、CD123/CD45RA(CD123⁺⁺CD45RA^-)、CD19⁺ 血細胞を除く。CD45/SSCを使ったバックゲート。
   3. 以下の配列を用いたゲート形質細胞状樹状細胞:生細胞、FSC/SSC点プロット上のMNC、CD123/CD45RA(CD123⁺⁺CD45RA⁺)、CD19⁺ ヘマトゴンを除く。CD45/SSCを使ったバックゲート。
   4. 赤血球芽細胞、血小板塊、破片、未溶解の赤血球をCD36/CD45ドットプロットを用いて同定します。CD45/SSCおよびFSC/SSCを使ったバックゲート。
7. LAIPアプローチ
   1. ブール演算子を用いてCD34⁺またはCD117⁺ プリミティブAMLでMRDを定義します:LAIP1、LAIP2、LAIP3、LAIP4、LAIP5、LAIP6、LAIP7、LAIP8で、クリーンでないCD36ブ^ライト+/CD45、単一セル、ライブセル、CD34^+/CD117^+/ プリミティブマーカーAND(CD45/SSCブラストゲートまたはMNC CD34⁺)(図1)。
   2. CD34-CD117-AMLにおけるMRDは、ブール演算子を用いて次のように定義します:LAIP1、LAIP2、LAIP3、LAIP4、LAIP5、LAIP6、LAIP7、LAIP8で、クリーンでないCD36^BRIGHT+/CD45、単一セル、ライブセル、CD34CD117およびCD45/SSCブラストゲート(図2)。
8. DfNアプローチ
   1. LAIPアプローチと同じテンプレートを使用し、参照骨髄サンプルに定義された空白部分を適用します(表3)。
   2. 異常細胞群が^{ログスケールで}正常細胞から0.5世紀分離した場合に異常集団を定義します。
   3. DfNを一括で捕獲するには、FSC/SSCを使って生細胞を採取してください。
   4. FSCピーク/SSC面積に基づいてダブルセットを除去して単一セルを描画します。
   5. FSC/SSCを使ってMNCゲートを描画します。
   6. CD45/CD36/SSCを使ってリンパ球を除去するためにクリーンアップゲートを適用します。
   7. CD45/CD36を使って赤血芽細胞やゴミを除去するためにクリーンアップゲートを適用します。
   8. 2つの入力ゲート、CD34⁺/CD45/SSCおよびCD117⁺/CD45/SSCを用いて、以前の出版物^12,13に従って空ボックスを定義します。
   9. 各DfNの空欄は、交差系譜マーカー用のリンパ球や、失われ、減少、過剰発現マーカー用の正常骨髄前駆体を含む内部対照集団に基づいて描画します。
   10. 空の箱を、再生骨、炎症性、健康なドナー骨髄などの参照骨髄サンプルと比較してください。

6. LSC CD34⁺CD38^-の定義

1. 正常な造血幹細胞における二項発現と発現不在のLSCマーカーに基づき、診断時にLSC富む細胞をCD34⁺CD38^- 領域で同定します。
2. LSC入力ゲートを以下のゲートシーケンスでMNC34⁺ として定義します:生細胞、単一細胞、MNCおよびCD34+(CD45/CD34^ド ットプロット)。
3. CD38蛍光マイナス1(FMO)レベルに基づく厳密な閾値を用いてCD34⁺CD38^- 分率(P6)を定義します。
4. チューブ1のP6分画におけるLSCリッチ細胞をブール演算子を用いて次のように定義します:P6CD7⁺ またはP6CD33⁺ またはP6CD19⁺ またはP6CD56⁺ およびクリーンでないCD36^bright+ および単一細胞および生細胞、MNC、MNC CD34⁺。
5. チューブ2のP6分画におけるLSCリッチ細胞をブール演算子を用いて次のように定義します:P6CD45RA⁺ または P6MIX⁺ または P6CD123⁺ であり、非クリーンなCD36^bright+ および単細胞および生細胞、MNC、MNC CD34⁺。
6. CD36を使って最終MRD LSCゲート内の非特異的イベントをクリーンアップします(図3)。

7. CD34⁺集団におけるCD38^-閾値の定義

1. CD38チャネルを十分に高く設定し、CD38^- 集団とCD38^+/ の集団を良好な解像度で区別できるようにします。
2. P6をCD34⁺CD38^-、P7をCD34⁺CD38^の低値、P8をCD34⁺CD38^の高値と定義します。
3. CD38チャネル設定をCD38ブライト集団を基準にし、各プラットフォームの測定範囲に応じて最も明るい形質細胞とヘマトゴンを特定します。
4. CD38 FMOアプローチを用いて、アイソクローニックCD38対照群で検証されたCD34⁺CD38^- 集団(P6)を定義します。
5. 血虫陰性レベルを用いてCD34⁺CD38^低 集団(P7)を定義します。
6. 血液細胞陽性レベルと血漿細胞陰性レベル(図4)を用いてCD34⁺CD38^高集団(P8)を定義します。
7. CD38-FMOやアイソクローニックCD38制御などの堅牢な手法を用いて、調和群全体で同じCD38^閾値レベルを用います。
8. LSCリッチ細胞を定義するために、CD34⁺CD38^- 分画の少なくとも1つの異常免疫表現型を用いてください。CLL1/TIM3/CD97/CD45RA/CD123のようなLSCマーカーや、CD7/CD19/CD56/CD33のような系譜マーカーを含めてください。
9. 以下の閾値を適用してください:アッセイ感度LOQ10-4およびLOD10-5;診断時のLSC陽性率はCD45/SSC胚芽の1%≥;MRD追跡におけるLSC陽性率は白血球数≥0.01%でした。

8. 調和された臨床フローレポート

1. 各結果には以下の情報を記載してください:骨髄の質、MRD識別に用いられた戦略、LAIPの記述、LODおよびLOQ、閾値、結果の解釈。
2. ヘモジディションと骨髄の代表性
   1. 各MRDフロー臨床報告でヘモジルトを評価し、結果の堅牢性を評価します。
   2. 該当する場合は、先述の血液希釈法のいずれかを用いてください(表4^{)7,14,15,16,17,18,19,20,21}。
   3. 補完的なアプローチとして、参照骨髄サンプルで観察された予想比と比較して、観察されたCD34/WBC45比率を用いて骨髄の代表性を算出します(図5)。
   4. 以下の式を使います:
      P: 純度% = 100 × (n/L - s) / (m - s)
      s:正常末梢血中のMNC CD34⁺ 細胞の割合:0.0005
      m:正常骨髄中のMNC細胞CD34⁺ の割合:0.035
      L: MRD患者サンプル中の白血球45⁺ 白血球の数
      n: MRD患者サンプル中のMNC CD34⁺ 細胞数
   5. 骨髄の代表性をサンプルの品質評価として報告してください。この値はMRDの結果を正規化するために使わないでください。
   6. 骨髄の代表性を次のように解釈します:100%から10%、骨髄中のCD34⁺ 細胞の割合に影響が低い;MRD結果の解釈に注意すべき10%から1%;<1%は解釈不能な結果です。
3. 診断時のLSC定量化
   1. LSCリッチ細胞の同定に用いられたプロファイル、例えばCD34⁺CD38-CD90-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺を報告してください。
   2. 診断時にLSC結果をCD45/SSC胚盤からの観察パーセンテージとして報告してください。
   3. LSCは総胚盤胞の1%≥予後不良の基準値として使います。
4. LAIP/DfNによる続報MRD
   1. MRDを識別するために使用されたLAIPプロファイルを報告してください。例えば、CD34⁺CD38^dim+CD13^+/-CD33⁺⁺CD117^+CD7+。
   2. 分析の感度を、技術的な閾値とLAIPプロファイルの堅牢性値の間で参照骨髄サンプルと比較して最も感度が低い値として報告します。
   3. 獲得した白血球イベントのうち最低でも50個の細胞クラスターを定量の限界として用いてください。例えば、50万個の白血球細胞の場合、LOQは0.01%(1 × ^10-4)です。
   4. LAIP/DfNの結果は陽性、陰性、検出可能だが臨床閾値以下、または検出不可と報告してください。
   5. LAIP/DfN陽性率は≥0.1%と報告し、これは総CD45⁺ 白血球の割合で表されます。
   6. LAIP/DfNのネガティブさは<0.1%と報告してください。
   7. 検出可能だが閾値未満の結果については、代表値と感度閾値を報告します。
   8. 検出できない結果については、結果が解析感度閾値より劣っていることを報告し、必要に応じてヘモジルト、低いLAIP特異性、技術的閾値不足などのコメントを加えます。
5. LSCによる追跡MRD
   1. LSCリッチ細胞の同定に用いられたプロファイル、例えばCD34⁺CD38-CD90-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺を報告してください。
   2. 獲得した白血球イベントのうち最低でも20個の細胞クラスターを定量の限界として用いてください。例えば、1,000,000個の白血球細胞の場合、LOQは0.002%(2 × ^10-5)です。
   3. LSCの結果は陽性、陰性、検出可能だが臨床閾値以下、または検出不可と報告してください。
   4. LSC陽性率は≥0.01%と報告し、これは総CD45⁺ 白血球の割合で表されます。
   5. LSCのネガティブさは<0.01%と報告してください。
   6. 検出可能だが閾値未満の結果については、代表値と感度閾値を報告します。
   7. 検出不能な結果については、結果が解析感度閾値より劣っていることを報告し、必要に応じて血液溶解、低いLSC特異性、技術的閾値不足などのコメントを追加してください。
6. MRDフロー解釈を過去の監視時点と統合します。治療中の表現型プロファイルの調節およびMRDフローの動態(再陽性、増加、安定性、減少を含む)を示します。
7. 結果を、参照フロー検査室の期間に基づき臨床フローレポートを用いて、依頼する臨床医および研究者に送信します。
8. 調和済み臨床フローレポートは以下の項目を用いて要約します:骨髄の質、MRD同定戦略、LAIPの記述、LODおよびLOQ、閾値、MRD陽性、陰性でLOD値付き、または検出可能だが定量化できないMRDの解釈。

結果

プラットフォームミラーリング

CANTOとNAVIOSの初期の2プラットフォーム比較では、あらかじめ定められた目標MFI値に到達するために、補正されていない8ピークレインボービーズを取得して電圧設定を調整しました。参照CANTOプラットフォームのターゲット値は、以下の変換を用いて2番目のNAVIOSプラットフォームに移置されました:new MFI target = reference MFI target/256²²。プラットフォーム間のバイアスを検出するために、10件の新鮮なEDTA再生骨髄サンプルを並行してテストしました。陽性と陰性集団間の染色指数はサンプルとプラットフォーム間で比較され、同等の分離が示されました(補足ファイル図S3)。

調査期間中、プラットフォームは8色および10色構成からLYRICおよびDxFLEXの12色および13色構成へ段階的にアップグレードされました(補足ファイル1)。ミラーリングは8ピークの虹色ビーズと、同じパネルで採取した染色された健康な骨髄を用いて4つのプラットフォームに拡張されました。ピークの重複は、表現の対数スケールのみを調整することで確認されました。定義された設定を適用した後、セル染色パターンは重なり、主な違いは対数スケールでのセルクラウドの移動でした(図6 および 補足ファイル-図S4および図S5)。

フローラボを通じた品質評価と再現性

初期の標準作業手順の実施とプラットフォームアップグレード時の更新後、参加センター間で共有された新鮮な参照骨髄サンプルを用いて、定期的に湿式外部品質評価(EQA)が実施されました。ウェットEQAを用いてウェットラボ手順、プラットフォーム設定、共通ゲート解析戦略の検証を行いました。報告された集団には、WBC CD45⁺分母に含まれるMNC CD34⁺細胞と、WBC CD45⁺分母に含まれるP6 CD34⁺CD38⁻細胞が含まれていました。結果はzスコアおよび/または図示的表現で分析されました(図7)。

2017年以降、5回のウェットEQAラウンドが実施され、それぞれ22、15、17、26、25の研究所が参加しました。白血球CD45⁺中の%CD34⁺CD38⁻細胞および白血球CD45⁺中の%MNC CD34⁺細胞の結果は以下の通りです:EQA1、平均値は0.015%および1.01%(標準差0.09%および0.24%);EQA2、0.09%および1.02%(標準差0.046%および0.36%);EQA3は0.097%および1.46%(標準差0.024%および0.32%)、EQA4、0.024%および2.16%(標準差0.015%および0.59%);EQA5は0.027%および1.9%(標準差0.008%および0.45%)でした。

MRD分析戦略のセンター間標準化に対応するため、ウェットEQAはドライEQAとドライEQAを組み合わせ、診断、MRDフォローアップ、参照骨髄用に共有FCSファイルを用いました。地域解析データの90%以上が、2±SDに基づく中央集権区間内に含まれていました。DryEQA2017は23研究室中22研究室で95.6%と91.3%、DryEQA2024は25研究室中24研究室で100%含まれていました(図8)。白血球CD45⁺の%MRD LAIPおよび白血球CD45⁺の%MRD LSC CD34⁺CD38⁻に対して2回のドライEQA検査を実施しました。DryEQA2017の平均LAIP値は11.9%(標準差1.35%)、平均LSC値は0.16%(標準差0.05%)でした。DryEQA2024では平均MRD LAIP値が0.35%(標準差0.26%)、平均MRD LSC CD34⁺CD38⁻値が0.18%(標準差0.06%)を示しました。

LAIP/DfNおよびLSC戦略を用いたマルチモーダルAML MRD流量測定の例

MRDを定量化するために、3つのアプローチが体系的に用いられました。最初のアプローチは、診断時の白血病芽球のLAIP地図作成をブールゲートを用いて確立し、この地図作成を骨髄サンプルの追跡に適用しました(図9A)。2つ目のアプローチは、DfN解析を用いて、正常な骨髄分化によって定義された「空の箱」領域に見られない非定型発現パターンを持つ異常細胞を特定しました(図9B)。3つ目のアプローチは、二分LSCマーカーとブールゲーティングを用いてCD34⁺CD38⁻ 分画のLSCリッチ細胞を定量化しました(図10)。

参考骨髄サンプル

合計135件の参照骨髄サンプルが調査され、そのうち25件は健康なドナー骨髄サンプル、34件は炎症性骨髄サンプル、76件は再生中の骨髄サンプルです。健康なドナー骨髄は、中央値年齢31歳、21歳から49歳の範囲を持つ健康なドナーから採取されました。細胞減少症(貧血、好中球減少症、血小板減少症を含む)で紹介された患者から炎症性骨髄を採取し、骨髄吸引液では血液学的悪性腫瘍は認められませんでした。中央値年齢は52歳で、25歳から82歳の範囲でした。AMLの異なる化学療法経過時点(誘導後や統合後を含む)で骨髄再生を得られ、NPM1またはCBF転写物の分子MRD評価は陰性でした。中央値年齢は54歳で、18歳から65歳の範囲でした。

これらのサンプルの質は顕微鏡検査によって検証されました。希釈されていない骨髄サンプル中のCD34⁺細胞の理論的理論的パーセントもBrooimansの公式を用いて算出され、すべてのサンプルで>90%の結果が得られました。これらのサンプルは、LAIP/DfNおよびLSC分析の閾値を設定し、血液溶解および純度の公式を算出するために用いられました。骨髄の状態に応じたマーカー発現MFIの変動を、健康なドナー、炎症性、再生中の骨髄サンプルについて調査しました(補足ファイル図S6)。参照値は、白血球からの%MNC CD34⁺、MNC CD34⁺の%P6 CD34⁺CD38⁻、MNC CD34⁺の%P7 ^{CD34+CD38 dim}、およびMNC CD34⁺の%P8 CD34^{+CD38高濃度}(補足ファイル図S6)を含みます。

感度と直線性の評価

LAIP/DfNおよびLSC特異的ゲートの感度は、再生骨、炎症性、健康なドナー骨髄を含む一連の異常事象サンプルの異常事象数を測定することで評価されました。健康な骨髄中の既知数の芽球を連続希釈して、MRD測定の定量限界と線形性を検証しました(図11および図12)。

図1:チューブ1における原始マーカー(CD34⁺/CD117⁺)を用いたAMLにおけるMRD LAIP解析のゲーティング戦略。 第1行:時間の逐次ゲート、FSCとSSCに基づく生細胞、FSC-WとFSC-Hに基づく単一細胞、CD45上の白血球CD45⁺ 細胞とSSCの比較、CD45の^dim/SSCでの芽胞、FSC-A/SSC-Aの単核細胞(MNC)、CD45対CD34のプロット上のMNC CD34⁺ 細胞、CD34とCD117のプロット上の原始マーカーゲート。第2および第3行:最も関連性の高いLAIPゲート(LAIP1–LAIP8)を定義するために使われる固定バイパラメトリックドットプロット。MRD LAIPは次のブール戦略を用いて定義されました:時間、生細胞、単一細胞、そして(爆発またはMNC CD34⁺)、原始マーカー(CD34^+/−CD117^+/−)、LAIP1、LAIP2、LAIP3、LAIP4、LAIP5、LAIP6、LAIP7、LAIP8。図示されたケースでは、MRDは白血球CD45⁺の6.8%であり、健康な骨髄では0.04%±0.03でした。右:定量化に使われた最終MRDゲートのバックゲート化、非特異的イベント、赤血芽細胞、破片のクリーンアップ。略称:AML = 急性骨髄性白血病;MRD = 測定可能な残存疾患;LAIP = 白血病関連免疫表現型;FSC = 前方散乱;SSC = 側散乱;白血球=白血球;MNC = 単核細胞;hBM = 健康な骨髄。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:チューブ3の成熟芽泡(CD34⁻CD117⁻)を用いたAMLにおけるMRD LAIP解析のゲーティング戦略。 第1列:時間の連続ゲート、FSCとSSCに基づく生細胞、FSC-W対FSC-Hに基づく単細胞、CD45上の白血球CD45⁺ 細胞とSSCの比較、CD45^dim/SSCの胞胞、FSC-A/SSC-Aの単核細胞(MNC)、CD45対CD34のプロット上のMNC CD34⁺ 細胞、そしてCD34対CD117のプロットにおける成熟胚芽ゲーティング。
第2および第3行:最も関連性の高いLAIPゲート(LAIP1–LAIP8)を定義するために使われる固定バイパラメトリックドットプロット。MRD LAIPは次のブール戦略を用いて定義されました:時間、生細胞、単一細胞、芽細胞、CD34⁻CD117⁻ 芽泡、LAIP1、LAIP2、LAIP3、LAIP4、LAIP5、LAIP6、LAIP7、LAIP8。図示されたケースでは、MRDは白血球CD45⁺の15%であり、健康な骨髄では0.09%±0.02でした。
右:定量化に使われた最終MRDゲートのバックゲート化、非特異的なイベントのクリーンアップを可能にする。略称:AML = 急性骨髄性白血病;MRD = 測定可能な残存疾患;LAIP = 白血病関連免疫表現型;FSC = 前方散乱;SSC = 側散乱;白血球=白血球;MNC = 単核細胞;hBM = 健康な骨髄。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:正常造血幹細胞(nHSCs)および白血病幹細胞(LSC)富む細胞(CD34⁺CD38⁻ 分画におけるゲーティング戦略)(チューブ2)。 (A) 正常な造血幹細胞(nHSC)、および (B) CD34⁺CD38⁻ 画分(チューブ2)における白血病幹細胞(LSC)が豊富に存在する細胞。第1列:時間の連続ゲーティング、FSCとSSCに基づく生細胞、FSC-Wに基づく単細胞対FSC-H、CD45上の白血球CD45⁺ 細胞とSSCの比較、CD45dim/SSCでの芽胞、FSC-A/SSC-Aの単核細胞(MNC)、CD45対CD34プロットのMNCCD34⁺ 細胞。
2行目から4行目:固定バイパラメトリックドットプロットでP6(CD34⁺CD38⁻)、P7(^CD34+CD38低値)、P8(CD34⁺CD38^高値)を定義し、MIX(CLL1/TIM3/CD97)、CD123、CD45RAなどの最も関連する二項LSCマーカーも含まれます。MRD LSCは以下のブール戦略を用いて定義されました:時間、生細胞、単細胞、芽胚、MNC、MNC、CD34+およびP6、(P6 LSC MIX⁺ またはP6 LSC CD123⁺ またはP6 LSC CD45RA⁺)。
右:定量化に使用された最終MRD LSCゲートのバックゲート化により、非特異的イベントのクリーンアップが可能になりました。
(A) 健康な骨髄サンプル中のnHSC:nHSC(紫色イベント)はCD34⁺CD38⁻、MIX⁻ (CLL1/TIM3/CD97)、CD45RA⁻、CD123⁻、CD117⁺、HLA-DR⁺、CD36⁻、CD90⁺でした。nHSC CD34⁺CD38⁻ の比率は白血球CD45⁺の0.02%を占め、LSC CD34⁺CD38⁻ 細胞は陰性でした。報告されたアッセイ閾値はLOQ 0.0001%およびLOD 0.001%でした。
(B) AMLサンプル中のLSCリッチ細胞:LSCリッチ細胞(オレンジイベント)はCD34⁺CD38⁻、MIX⁺ (CLL1/TIM3/CD97)、CD45RA⁺、CD123⁺、CD117⁺、HLA-DR⁺、CD36⁻、CD90⁺でした。LSC CD34⁺CD38⁻ の割合は白血球CD45⁺の3.7%を占めていました。略称:nHSCs = 正常造血幹細胞;LSC = 白血病性幹細胞;MNC = 単核細胞;白血球=白血球;SSC = 側散乱;MIX = CLL1/TIM3/CD97;HLA-DR = ヒト白血球抗原-DR;LOQ = 量化の限界;LOD = 検出限界。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:CD38蛍光マイナス1(FMO)チャネルを用いたCD34⁺集団におけるCD38⁻閾値の定義。第1列:参照集団のゲート化、CD45/SSC、MNC CD19⁺細胞、MNC CD34⁺細胞の芽胞を含む。
2列目:CD38 FMOチャンネルの信号レベル。最初の行は芽細胞、2行目はMNC CD19⁺ 細胞、3行目はMNC CD34⁺ 細胞を示しています。オレンジ色の線はP6 CD34⁺CD38⁻ ゲートを定義する閾値を示しています。
3列目:CD38 PE-Cy7信号レベル。最初の行は芽細胞を示し、2行目はP8 CD34^+CD38高値を定義するCD38ヘマトゴン値のMNC CD19⁺細胞を示し、3行目はオレンジ色でP6 CD34⁺CD38⁻細胞、緑色でP7 CD34⁺CD38^低細胞を示しています青いセル。略称:FMO = 蛍光マイナス1;MNC = 単核細胞;SSC = 側散乱;PE-Cy7 = フィコエリスリン-シアニン 7;P6 = CD34+CD38− 分数;P7 = CD34+CD38低分率;P8 = CD34+CD38高分率。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:MNC CD34⁺ 細胞に基づく骨髄サンプルの代表性評価。 (A) MNC CD34⁺ 細胞のゲート戦略および計算に用いられるパラメータ: n、MNC CD34⁺ 細胞数; L、白血球CD45⁺ 細胞数; s、正常末梢血中のMNCCD34⁺ 細胞の割合;および m.は、基準正常な骨髄で観察されるMNC CD34⁺ 細胞の割合です。(B) 末梢血(PB)による骨髄(BM)希釈がBMサンプル中のCD34⁺ 細胞の起源に与える影響の概略的表示。(C) BM純度の解釈に用いられる基準。略称:BM = 骨髄;PB = 末梢血;MNC = 単核細胞;白血球=白血球。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図6:4つのフローサイトメータープラットフォームにおける発現パターンの比較。
正常な骨髄(BM)サンプルは、4つのサイトメータープラットフォームで同時に、各プラットフォームとスケール調整の設定を用いて検査しました。最初の行はCD45/CD33ドットプロット上のMNC細胞を示しています。2行目には、原始マーカーCD34/CD117ドットプロット上のMNC細胞が示されています。3行目にはCD34/CD38ドットプロット上の胚胎細胞が示されています。4行目はCD45RA/CD90ドットプロット上のP6 CD34⁺CD38⁻ 細胞を示しています。略称:BM = 骨髄;MNC = 単核細胞;P6 = CD34⁺CD38⁻ 分数。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図7:参加フローラボにおけるウェットラボEQAの再現性。(A) バイオリンプロット:5回のウェットラボEQAラウンドおよび参加フローラボにおける白血球CD45⁺細胞の%P6 CD34⁺CD38⁻細胞分布を示す。(B) 白血球CD45⁺細胞における%MNC CD34⁺細胞の分布を示すバイオリンプロット。5つの湿式実験室EQAラウンドおよび参加フロー実験室にまたがる分布。略称:EQA = 外部品質評価;P6 = CD34+CD38− 分数;白血球=白血球;MNC = 単核細胞。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図8:LAIP/DfNおよびLSC MRD測定のドライEQA評価。(A) 8色パネルグループからの6つの共有FCSファイルを用いてLAIP/DfNおよびLSC MRD測定のためのドライEQA2017演習。これにはAML診断、AML MRD、チューブ1 LAIPおよびチューブ2 LSC解析の正常骨髄参照ファイルが含まれます。この演習は23の参加研究所と共有されました。(B) 12色パネル群からの6つの共有FCSファイル(AML診断、AML MRD、チューブ1 LAIPおよびチューブ2 LSC分析の正常骨髄参照ファイルを含む)を用いたLAIP/DfNおよびLSC MRD測定のための乾式EQA2024演習。この演習は24の参加研究所と共有されました。(C) 湿式EQA2025中に測定した白血球CD45⁺細胞における%MNC CD34⁺細胞と%nHSC P6 CD34⁺CD38⁻細胞のプラットフォーム間比較(25の参加研究所と共有)。期待値はMNC CD34⁺細胞で1.6%、nHSC P6 CD34⁺CD38⁻細胞で0.02%でした。略称:EQA = 外部品質評価;LAIP = 白血病関連免疫表現型;DfN = 正規と異なる;LSC = 白血病性幹細胞;MRD = 測定可能な残存疾患;FCS = フローサイトメトリー標準;AML = 急性骨髄性白血病;MNC = 単核細胞;nHSC = 正常造血幹細胞;白血球=白血球。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図9:LAIP/DfNアプローチを用いた代表的なMRD測定。 (A) LAIP/DfN法を用いたMRD測定の例。左側は診断サンプルの白血病細胞のLAIP地図作成を示し、右側は追跡サンプルに同じLAIP地図を適用したもので、MRD集団は黒で示されています。(B) DfN法を用いたMRD測定の例。各ドットプロットのペアは、健康な骨髄(hBM;正常、左プロット)とMRD追跡骨髄サンプル(DfN、右プロット)を比較します。「空ボックス」領域は正常な骨髄上で定義され、追跡サンプルでこの空白ボックス内の白血病細胞の存在が評価され、異常な集団は黒で示されます。略称:MRD = 測定可能な残存疾患;LAIP = 白血病関連免疫表現型;DfN = 正規と異なる;hBM = 健康な骨髄。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図10:診断および追跡時のCD34⁺CD38⁻LSC濃縮細胞の代表的な測定値。(A) AML診断サンプルにおけるLSC濃縮細胞測定の例。左側はLSC濃縮プロファイルを示し、オレンジ色の集団はCD34^+CD38−分画内でMIX(CLL1/TIM3/CD97)、CD123、CD45RA、CD117、HLA-DR、CD36を発現しています。
(B) 同じ患者の追跡サンプルで、同じ免疫表現型プロファイルを持つMRD LSCリッチ細胞(オレンジ集団)が持続している。略称:LSC = 白血病幹細胞;AML = 急性骨髄性白血病;MRD = 測定可能な残存疾患;MIX = CLL1/TIM3/CD97;HLA-DR = ヒト白血球抗原-DR。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図11:LSC検出の解析感度。(A) LSC検出における空白極限(LOB)の評価。左側は、5つの健康な骨髄サンプルから取得された5つのFCSファイルを統合したCD34⁺CD38⁻イベントの定量化(5,148,000件の白血球イベント取得)を示しています。右側は、CD45/SSCドットプロット上でバックゲートされたLSCブールゲートに属するイベント数(14イベント)を示しており、LOBは<0.0005%(5×^10-6)に対応します。(B) LSC定量化のための線形性の評価。左側は、健康な骨髄サンプルにおいてLSC富む細胞のスパイクインによる連続的な希釈を示しています。右側は測定されたMRD値と理論値との相関を示しており、定量極限(LOQ)は2×^10-5(0.002%)に対応しています。略称:LSC = 白血病幹細胞;LOB = 空白の上限;FCS = フローサイトメトリー標準;白血球=白血球;MRD = 測定可能な残存疾患;LOQ = 量化の限界。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図12:MRD LAIP測定の線形性と定量範囲。(A) 健康な骨髄における異なるLAIPを用いた芽胞を連続希釈することでMRD LAIP定量化の線形性評価を行い、測定されたMRD値と理論値の相関を示し、異なるLAIPおよびLOQに応じて変動するLOQ<0.1%)。(B) 異なるLAIPによる定量範囲。赤い線は0.1%の臨床閾値を示しています。LOQはすべてのLAIP検査で臨床基準に達しました。略称:MRD = 測定可能な残存疾患;LAIP = 白血病関連免疫表現型;LOQ = 量化の限界。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

フルオロ クローム	ピーク	LYRIC12c	ピーク	DxFlex13c	ピーク	NAVIOS10c	ピーク	カント8c
FITC	P8	44618	P6	89916	P7	104	P8	56316
体育	P8	84008	P6	110652	P7	136	P8	88803
ECD	x	x	P6	153011	P7	150	x	x
PerCPcy5,5 /PEcy5,5	P7	63610	P6	101791	P7	85	P7	75717
PC7/PEcy7	P8	32412	P6	21381	P8	88	P8	32003
装甲兵員輸送車	P7	111628	P6	192708	P6	181	P7	143946
AA700/AP CR700	P7	25958	P6	237374	P7	182	x	x
A7A750/ APCH7	P8	77444	P6	158729	P7	150	P8	98311
BV421	P6	62031	P6	239208	P6	268	P6	68315
KO/V500	P7	159941	P6	293917	P6	179	P7	124919
BV605	P7	31688	P6	65337	x	x	x	x
BV711/ V660	P8	21816	P6	12107	x	x	x	x
BV786	P8	17560	P6	3795	x	x	x	x

表1:8ピーク虹色ビーズを使用した各プラットフォームのターゲット値。 各サイトメータープラットフォーム(Canto、Lyric、Navios、DxFlex)ごとに具体的な目標値が示されています。保持ピークは、爆細胞で観測されたMFIに近い位置に選ばれました。これは特にPMTベースのサイトメーターで重要であり、PMT電圧の上昇とともに信号強度が線形に増加しません。対照的に、APDベースのサイトメーターでは信号強度が利得とともに線形に増加するため、すべての検出器で同じピークを使用可能にしますが、PMTベースのサイトメーターでは各チャネルごとに異なるピークが必要です。略語:MFI = 中央値蛍光強度;PMT = 光電子増倍管;APD = 雪崩フォトダイオード。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

第8章C節 /NAVIOS 8c

FITC

体育

ECD

PerCPC y5,5

PECy7

装甲兵員輸送車

APC-R700 /AA700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

チューブ1 LAIP 8c

CD7 5μL /CD56 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

チューブ2 LSC 8c

CD90 5μL

MIX3(2 0.5μL/Ac)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3サップル メンテール グラン8c

CD15 5μL

CD56 5μL

HLADR 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD11b 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3補足 エンテア - モノス8c

CD36 5μL

CD64 5μL

CD14 10μL

HLADR 5μL

CD34 5μL

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97 +TIM3+ CLL1

リリック 10-12c

FITC

体育

ECD

PerCPCy5,5

PECy7

装甲兵員輸送車

APC-R700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

チューブ1LAIP 12c

CD7 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR(5μL)

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD56 5μL

CD10 2μL

CD36 2μL

チューブ2 LSC 12c

CD90 5μL

MIX3(2. 5μL/Ac)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD200 5μL

CD19 5μL

CD36 2μL

T3サップル メンテール 12c-モノス

CD15 5μL

CD64 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD14 5μL

CD11b 5μL

CD36 2μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

NAVIOS 10c

FITC

体育

ECD

PEcy5,5

PECy7

装甲兵員輸送車

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV711

BV786

T1 ナビオス 10c

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T2ナヴィオス10c

CD90 5μL

MIX3(2.5) μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3サップル メンテール 10cモノス

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD11b 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

DxFLEX 10 -12/13C

FITC

体育

ECD

PEcy5,5

PECy7

装甲兵員輸送車

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV650

BV786

T1 DxFLEX 12-13c

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD36 5μL

CD10 2μL

/

T2 DxFLEX 12-13c

CD90 5μL

MIX3(2.5) μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

/

CD200 5μL

HLADR snv786 (3μL)

T3サップル メンテール 12c モノス

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD64 5μL

CD11b 5μL

/

表2:AML MRD、LAIP/DfNおよびLSC分析のための抗体パネル構成。この表は、サイトメータープラットフォームに応じた8色、10色、12色、13色のパネル構成をまとめています。チューブ1はLAIP/DfN解析、チューブ2はCD34^+CD38−のLSCリッチ細胞解析、チューブ3は単球細胞/顆粒細胞分化マーカーに使用されます。抗体体積と蛍光色素の割り当ては各プラットフォームごとに示されています。MIX3はCD97、TIM3、CLL1に対応します。略称:AML = 急性骨髄性白血病;MRD = 測定可能な残存疾患;LAIP = 白血病関連免疫表現型;DfN = 正規と異なる;LSC = 白血病性幹細胞;MIX3 = CD97/TIM3/CLL1。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

骨髄系前駆体における正常発現マーカーの完全な喪失

CD13++CD33-/CD34+ またはCD117+

CD13-CD33++/CD34+ またはCD117+

CD13+HLADR-/CD34+

CD13+CD117+CD34-

骨髄系前駆体における系統間リンパ系統マーカーの発現

CD7+CD13+/CD34+ またはCD117+

CD7+CD33+/CD34+またはCD117+

CD56+CD13+/ CD34+またはCD117+

CD56+CD33+/CD34+またはCD117+

CD19+CD117+/ またはCD13+、CD33+

骨髄前駆体の過剰発現

CD34++/CD117+

CD117++/CD13+CD33+

骨髄系前駆体の発現低下

CD38loCD34+CD33+CD117+

表3:LAIPベースのDfN「空箱」定義。 この表には、異常な骨髄系前駆体集団を特定するために用いられるあらかじめ定義された異常(DfN)「空の箱」パターンが一覧化されています。分類には、正常発現マーカーの完全な喪失、系統間リンパ系マーカーの発現、マーカー過剰発現、骨髄前駆体のマーカー発現の低下が含まれます。略称:LAIP = 白血病関連免疫表現型;DfN = 正常と異なる。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

Holdrinetら17
Broolmansら15
骨髄純度 = (1 − (GRMO/GRSG) × (GBSG/GBMO)) × 100	>80%
Björlund ほか19	GPA>15%
	CD3 < 20%
ローケンら18	CD16高血圧 <30%
Theunissenら20頁;Dworzak ほか21
フローまたはCtr DIL細胞学的特徴:PNN<40%、Ebl >5%、Ly<20%	CD16++ CD11b++ < 40%
	GPA>5%
	CD3 < 20%
BM純度%:MNC 34+/WBC45+	BM純度100-10%

表4:AML MRDフロー報告のための骨髄希釈制御法。表は、AML MRDフロー臨床報告に用いられる骨髄希釈および代表性管理法の公開データを要約しています。MRD結果の解釈を支援するために、少なくとも1つの希釈制御法を適用すべきです。CD34/WBC45⁺の骨髄純度アプローチは補完的な品質評価として含まれています。略称:AML = 急性骨髄性白血病;MRD = 測定可能な残存疾患;BM = 骨髄;白血球=白血球;CD45⁺白血球中のCD34/WBC45⁺ = CD34⁺細胞。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル1:追加背景、プラットフォーム調和、骨髄参照、予後支援資料。 この補足ファイルには、LSCの同定、AML表現型の異質性、プラットフォーム間ミラーリング、プラットフォーム固有の最適化、参照骨髄マーカー発現プロファイル、縦断パネルの進化、診断時のLSC定量に用いられる予後閾値に関連する支持図と表が含まれています。これらの資料は、CD34⁺CD38⁻ LSC濃縮細胞評価の根拠、プラットフォーム調和の技術的基盤、参照骨髄背景、パネル移動、臨床閾値選択の解釈に用いられるデータを含む、多施設MRDフローサイトメトリーのワークフローに追加の文脈を提供します。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

プロトコルの重要なステップ

サンプルの質は正確なMRDおよびLSC定量に不可欠です。新鮮な骨髄サンプルは室温で輸送し、理想的には24〜48時間以内に処理し、^{必要に応じて採集}後72時間以内に処理してください。ヘモジリュテーションは各時点で評価され、臨床フローレポートに含めるべきです。臨床医は、誘導後、統合後、標的免疫療法、アザチジン/ベネトクラックスなどの軽度治療、または同種移植片などの治療時点を明確にすべきです。分化の状況は治療や時点と密接に関連しており、MRD解釈に統合することが重要です。縦断的追跡中は、同じ機器感度と解析信頼性を維持し、レインボーコントロールビーズを用いたターゲット値の定期的なチェック、定期的なEQA、そして研究全体を通じてFCSファイルの共同レビューを行うべきです。

MRD流量定量の標準化とセンター間信頼性の高い水準は、フローグループでの定期的なウェブベースの教育トレーニングを通じて維持されています。月に少なくとも1回のウェブトレーニングセッションが実施され、これらの期間中に100件以上のMRD LAIP/DfN、MRD LSC、または診断LSCの定量化が議論・レビューされました。この継続教育は重要です。なぜなら、フローデータの解釈には高度な資格を持つ生物学者が必要であり、特に低レベルのMRD、生理学的背景集団、再生する骨髄、治療中の表現型スイッチに関しては重要です。

CD34⁺CD38⁻ LSC富む集団の定量化も重要なステップです。正常な造血幹細胞やLSCを捉える普遍的なマーカーはありません。HOVONグループは、関連する「二分法的」LSCマーカーセットを含む8色パネルを用いたLSCモニタリングをAML診断とフォローアップに導入しました。³。二分マーカーとは、正常な造血幹細胞では発現しないが、LSC豊富な集団では陽性発現を示すものと定義され、淡い、中間、高、異質、または二峰性のパターンを示します。CLL1、TIM3、CD97などの特定の二項LSCマーカーを1つのチャネルに混合させることに関心があります。なぜなら、1つだけ陽性でもLSCリッチ細胞を検出できるからです。他のマーカーは特定のチャネルで別に使用すべきであり、その発現は骨髄の状態(再生骨髄やストレス骨髄を含む)によって正常な造血幹細胞と重複すること^がある。LSCリッチ細胞の完全な定義は、CD34⁺CD38⁻分画におけるマーカーの異常発現を含むブール演算子に基づいています。これは表現型上の定義であるため、集団はすべてのサンプルで機能的に証明されたLSCとしてではなく^、LSC豊富細胞として解釈されるべきです。このLSCパネルは、過剰な芽胞を持つMDS患者およびAML MRC患者にも同じプロトコルで適用可能です。

方法の改良とトラブルシューティング

プラットフォームやパネルの進化段階では、特に8色から10色パネルから12色から13色パネルへ移行する際に、標準化・調和のアプローチをラボネットワーク内で維持しなければなりません。機械の進化により、臨床研究全体を通じて共通の抗体の骨格と表現型異常検出における感度を維持する必要性が高まっています。プラットフォーム進化の過程で、骨格中の抗体のフルオロクロムは安定し、すべての機械で共通しています(CD34/CD38/CD45/CD117)。しかし、一部のチャネルでは機械固有の光学バンクのためにフルオロクロームの変更が必要であり、調和アプローチが必要です。PMT検出器サイトメーターからAPD検出器サイトメーターに切り替える際には、高波長におけるAPD検出器の高い感度を考慮しなければなりません。したがって、場合によっては特定の抗体に対する蛍光色素の選択を調整し、同じ染色指数を維持しチャネル間の過度な拡散を防ぐ必要があり、最適化アプローチを採用する必要があります。現在の臨床サイトメーターは12色から13色のパネルに対応しており、LAIP検出の特異性を高め、MRDゲート内の汚染細胞を除去するマーカーの追加により解釈性を向上させています。しかし、これにより解析²³の複雑さも増します。

8色パネルから12色パネルへのアップグレードにより、一部ではMRD評価の感度と特異性が向上しました(補足ファイル1)。チューブ1では、HLA-DR、CD36、CD10、CD56をCD7から分離して追加しました。チューブ2にはHLA-DR、CD36、CD200、CD19が追加されました。3号管にはCD4、CD64、CD38、CD36、CD14が追加されました。HLA-DRは現在、各チューブでCD38と体系的に組み合わせられており、LAIPおよび変化した分化パターンのより明確な定義を提供します。現在は各チューブに体系的に含まれているCD36は、赤血球芽細胞、赤血球、血小板、デブリの同定や最終的なMRDゲートの精緻化における重要なマーカーです。LSCチューブ内のCD19も血母の特定に役立ちます。単球と顆粒球の分化マーカーを一つのチューブに組み合わせることで、単球および顆粒細胞の分化パターンをより明確にし、異常を識別してLAIPの特定に役立ちます。8色パネルから10色パネルに移行した際、主な改善はLAIP検出によるもので、特にチューブ1のCD7から分離されたHLA-DRとCD56、チューブ2のHLA-DRとCD19の導入により挙げられます。10色パネルから12色パネルに移行した際、各管にCD36を追加し、ブラストゲートとLSCゲートの清掃が向上し、チューブ1のCD10とチューブ2のCD200で完了しました。これは検出限界を超えて定量限界以下で低レベルのMRD患者に特に有用でした。総合すると、臨床閾値0.1%でMRD陽性の患者のほとんど≥8色パネルで既に特定されていました。しかし、チューブ内でより多くのマーカーを使用することで、特にELN 2025ガイドラインに記載されている低レベルのMRDにおいて、MRD評価の特異性と解釈が向上しました。

手法の限界

マルチセンターのアプローチを選ぶのは難しいことがあります。この概念の実現可能性には、AML臨床試験でMRDフローを導入する前に必須のステップが必要です。すなわち、機器感度とサンプル準備の調和、分析オペレーターの研修と体系的な教育^です。プラットフォームが進化するにつれて、マルチセンター・マルチプラットフォーム戦略は、結果の堅牢性と再現性を維持するために適応しなければなりません。これには、同じパネルと設定を同じプラットフォームタイプに標準化することが含まれます。ハーモナイゼーションは、複数のプラットフォームで同じパネルをハーモナイズされた設定で使用すること、そして各プラットフォームに合わせてパネルや特定設定を用いる最適化。

ヘモジルションはMRD流量定量において最も難しく重要なポイントの一つです。本プロトコルで記述されたCD34/WBC代表性の公式は、骨髄サンプルの補完的な品質管理指標として使用すべきであり、MRD結果の正規化には使用すべきではありません。その解釈は骨髄再生、治療効果、残留疾患、より軽度の治療法などによって影響を受ける可能性があります。同様に、CD56、CD123、CD45RAのようなマーカーも単独のDfNやLSCマーカーとして解釈すべきではありません。これらは完全なゲート戦略、クリーンアップゲート、参照骨髄背景、臨床文脈の中で解釈されるべきです。

既存または代替手法と比較した手法の重要性

ELN 2025のガイドラインによると、MRDはAML患者における主要な予後指標であり、評価の手法や時期に関わらず重要な指標です。異なるMRDフロー技術やマーカーの使用は非常に補完的です。LAIP/DfNおよびLSC解析を含むマルチモーダルMRDは、標準化されたネットワーク内で結果の統一された報告を行う場合に有用です。MRD評価により、治療的反応と再発の定義がより明確になります。多施設・多モーダルMRDフローは、分子MRDとともに、新たな標的治療、第一・第二選択治療、異体移植、低強度治療を含むますます複雑化する治療環境の中で、将来の臨床試験において戦略的な役割を果たすでしょう。

特定の研究分野での重要性と応用の可能性

HOVONおよびALFAグループは、AML診断時にCD34⁺CD38⁻ を豊富にした集団の定量化が臨床的影響をもたらすと報告しました(補足ファイル1)。定量化方法に基づいてLSCの臨床的に有意な閾値を定義することが極めて重要と考えられます。ここで述べた方法を用いて以前報告されたように、LSC閾値≥1%は不利な結果と関連していました(補足ファイル1)²⁶。AML管理においては、MRD、LSCモニタリング、クローナル造血の差別統合が治療解釈の洗練に役立つ可能性があります。主な課題は、追加治療が必要な可能性のあるMRDと、安定した前白血病クローン(²⁷でない可能性)を区別することです。2025年のEHA/ELNガイドラインでは、AMLフォローアップのために、芽胚の割合を計算するための統合報告システムが最近推奨されました^。MRDの結果と形態学的比較を統合し、芽球の調和評価を行い、AML患者の反応カテゴリーを定義するための臨床試験での一貫した報告を促進するはずです。

HOVON研究およびALFA/FILO BIG1研究のいずれも、LAIP/DfNとLSCアプローチを組み合わせたスコアにより、患者はLAIP⁻/LSC⁻、LAIP^+/LSC⁻、LAIP⁻/LSC⁺の4つのグループに分類でき、3年間の総生存率は^3、26、29で異なることが示されています.全体として、これらの結果はMRDのLAIP/DfNおよびLSCの状態の予後臨床的影響を示しています。異種造血幹細胞移植の文脈では、CD34⁺CD38⁻LSCリッチ細胞の存在が、胚芽胞の総数が5%未満でも移植後の失敗の予測因子として報告されています³⁰。これらの臨床データはMRDフロー戦略の関連性を支持していますが、現行のプロトコルは技術ワークフローの標準化とセンター間の報告に重点を置いています。

展望として、スペクトルフロー技術は多次元フローサイトメトリーアプローチで同時にテストされるマーカーのパネルを拡大し、モニタリングされたLAIPの特異性を高め、造血再生による生物学的背景ノイズを低減する可能性があります。ここで提案されているプラットフォーム、パネル、センター間のスペクトルフローの再現性評価は、臨床実装において困難となるでしょう。FlowSOM、t-SNE、UMAPなどの新しい教師なし解析アルゴリズムは、正常な造血と白血病区画の区別を容易にする可能性があり、CD34⁺CD38⁻のLSC濃縮分から発芽バルクまでを識別できる可能性があります。LSCフラフをより深く捉えることは、患者由来の異種移植モデルにおける着着のモニタリングを改善するのに役立つ可能性があります^31,32。ELNワーキンググループはこれらの新しいアプローチの検証と調和のために設立されました。^33,34。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗体（CANTO 8C-LYRIC12C）	蛍光色素	会社	カタログ番号
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7	FITC	BD Bioscience	332773
CD13	PE	BD Bioscience	347406
CD33	PerCPCy5,5	BD Bioscience	333146
CD117	BV421	BD Bioscience	563856
CD38	PeCy7	BD Bioscience	335825
CD34	APC	BD Bioscience	345804
CD45RA	APCH7	BD Pharmingen	560674
CD19	APCH7	BD Bioscience	641395
CD45	V500	BD Bioscience	560777
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PerCPcy5.5	BD Pharmingen	558714
CD15	FITC	BD Bioscience	332778
CD64	PE	BD Pharmingen	558592
CD11b	BV711	BD Bioscience	740771
CD4	APCH7	BD Bioscience	641398
HLADR	APC-R700	BD Horizon	565127
CD56	BV605	BD Horizon	562780
CD14	BV605	BD Horizon	564054
CD200	BV605	BD Biosciences	562853
CD10	BV711	BD Biosciences	740770
CD36	BV786	BD Biosciences	745554
CD19	BV711	BD Biosciences	563036
抗体（NAVIOS 10C/DxFlex 12C/13C）	蛍光色素	会社	カタログ番号
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7 FITC	FITC	BC iotest	A07755
CD13	PE	BC iotest	A07762
CD33	PC5.5	BC iotest	B36289
CD117	SNV428	BC iotest	C76813
CD38	PEcy7	BDBioscience	335825
CD34	APC	BC iotest	IM2472
CD45RA	APCH7	BDBioscience	560674
CD19	AA750	BC iotest	A94681
CD45	KromeOrange	BC iotest	B36294
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PC5.5	BC iotest	B20022
HLADR	ECD	BC iotest	B92438
CD36	AA700	BC iotest	B46022
CD19	ECD	BC iotest	A07770
CD4	PE	BC iotest	A07751
CD11b	BV650	Bdhorizon	569704
CD14	AA750	BC iotest	B92421
HLADR	SNV786	BC iotest	C78087
CD56	AA700	BC iotest	B92446
CD64	BV605	Bdoptibuild	569172
CD36	BV605	BD Horizon	563518
CD10	BV650	Bdoptibuild	745390
CD15	FITC	BD	332778
CD200	BV650	Bdoptibuild	743085
BD FACSCanto II  (8-color, blue/red/violet)		BD Bioscience	338962
BD FACSLyric 3-Laser 12-Color Instrument		BD Bioscience	662383
BC NAVIOSNavios 10 Colors, 3 Lasers, B5-R3-V2 Configuration		Beckman Coulter	B47905
BC DxFLEX  13-Colors, 13 Detectors, 3 Laser,  B5-R3-V5		Beckman Coulter	C78505
BC Kaluza Software v 3.1		Bekman Coulter	A82959
BD FACSuite Software v1.6		BD  Bioscience	651360
BD FACSDiva software v 8.0.3 (Win 7 32 bit OS)		BD  Bioscience	659523
BD CST Beads		BD  Bioscience	656505
Multicolor COMPBEADS		BD  Bioscience	552843
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks), 3.0 - 3.4 µm		BD  Bioscience	559123
ClearL Lab Compensation Beads		Beckman Coulter	B99883
PharmLyse NH4Cl 100ml10x conc		BD  Bioscience	555899
DPBS, 1X		CORNING	21-031-CV
Brillant Stain Buffer Plus		BD  Bioscience	566385
MGG (May-Grünwald-Giemsa)		Sigma Aldrich	1014242500