マウスの脳内皮NAD+ 代謝のリアルタイム2光子イメージング

サマリー

このプロトコルは、生体マウスにおける脳内皮ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド代謝のリアルタイムモニタリングを可能にし、内皮標的バイオセンサー発現、頭蓋ウィンドウプレゼン、二光子イメージングを用いています。

要約

我々は、頭蓋窓二光子顕微鏡および内皮標的蛍光NAD⁺センサーを用いて、生体マウスの脳微小血管内皮細胞におけるニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド(NAD⁺)バイオセンサーチャネル応答のリアルタイム可視化ワークフローを提示します。このプロトコルには、(1) AAV-X1.1を用いて脳血管内皮内皮内で選択的にNAD⁺センサーを発現するアデノ関連ウイルス(AAV)媒介の発現(血管内皮カデリン)、(2) 安定した3 mm×3mmの皮質頭蓋窓の外科的準備、(3) 920 nm励起グリーンセンサーチャネル信号と1040 nm励起された血管内テトラメチルホダミン(TMR)–デキストランを同時に捕捉する二重波長の二光子イメージングが含まれますリファレンスチャンネル。TMR–デキストランチャネルは血管内腔の参照を提供し、血管選択、運動評価、血管完全性評価を支援します。応用例として、飲水、経口経口投与、または静脈内投与後の内皮センサーチャネル蛍光の変化を説明します。このプロトコルは、重要なステップ、推奨されるウイルス用量および抗体価の考慮事項、トラブルシューティング、定量分析戦略を強調し、研究室が脳血管NAD⁺バイオセンサーチャネルの動態をin vivoでモニタリングし、健康および疾患における神経代謝の研究を可能にします。 

概要

ニコチナミド・アデニンジヌクレオチド(NAD⁺)は、酸化還元バランス、ミトコンドリア活性、DNA修復、ストレス応答性シグナル伝達の中心的な補因子です。脳血管系において、内皮NAD⁺恒常性は受動的な代謝表示ではなく、バリアの完全性、血管張り、神経血管の結合を能動的に調節する役割としてますます認識されています1^。内皮NAD⁺代謝の障害は、加齢に伴う血脳関門(BBB)漏れや神経血管恒常性の障害と関連しており、生きた脳組織内で直接内皮代謝動態を解消できる方法の必要性を強調しています^。

現在用いられているNAD⁺の定量化手法の多くは、エンドポイント生化学的測定、固定組織染色、または体外センサーの読み取りに依存しています。有益ではあるものの、これらの方法は微小血管構造を完全な保存できず、動物内での時間経過による急速な変化を容易に識別できず、異質な脳組織に適用した場合の細胞型特異性も限定的です。これに対し、慢性頭蓋窓2光子イメージングは、生体マウスの皮質微小血管を高い空間的・時間的解像度で繰り返し可視化できるため、定義された生理学的または薬理学的介入の下で代謝応答性の内皮シグナルを監視するのに適しています^3,4,5。

このプロトコルの全体的な目標は、生体内での脳内皮NAD⁺動態のリアルタイムモニタリングのためのエンドツーエンドワークフローを提供することです。この手法は、内皮標的で強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)ベースのNAD⁺センサーを全身的に送達し、腺関連ウイルス(AAV)-X1.1にパッケージされ、Cdh5プロモーターによって駆動されます。また、安定した3mm×3mmの頭蓋窓による^{光学アクセス6,7,8}、そして血管内テトラメチルホダミン(TMR)–デキストラン参照チャネル¹を用いた二重波長の2光子イメージングを組み合わせています.センサーのメカニズムは次のように解明されています:Cambronneら。LigA-cpVenus 細胞質 NAD⁺ バイオセンサーは、逆応答型の cpVenus ベースのセンサーです。NAD⁺結合により、標準的な488 nm励起表示におけるcpVenus/eGFP様蛍光が減少し、405 nm励起チャネルは比率正規化の基準となります。したがって、生の緑色蛍光はNAD⁺濃度の直接的な正の指標として解釈すべきではありません。この2光子実装では、緑色センサーチャネル信号を取得するために920 nm励起を用い、TMR–デキストラン血管参照チャネルには1040 nm励起が用いられています。したがって、現在の920/1040 nmの取得は、校正済みの488/405 nm比比計測定とは同等ではありません。Cambronneらのバイオセンサーは、細胞内NAD⁺動態の監視に広く検証されており、現在の二重波長イメージング構成と互換性があるため選ばれました。FiNadのような新しい指標はNAD⁺動態のモニタリングに代替手法を提供しますが、その実装には現在TMR–デキストラ血管参照標識に用いられている赤色蛍光チャネルの修正が必要です。カンブロンセンサーは有限のダイナミックレンジ内でNAD⁺の利用可能性の相対的な変化を報告し、セルラーおよびサブセルラー用途で検証されています。しかし、信号解釈は発現レベル、pH、光漂白、光経路変動の影響を受ける可能性があり、絶対的なNAD⁺定量には校正または直交生化学的検証が必要です。AAV-X1.1が選ばれたのは、内皮熱帯型AAV変異体が中枢神経系血管を効率的に伝達することが報告されているためです。^6,7。AAV9、AAV-BR1、AAV-ENT、AAV-X1.1など複数のAAV血清型をCAGまたはCdh5駆動の強化緑色蛍光タンパク質発現を報告者として比較した結果、AAV-X1.1は検査された血清型の中で最も良好な血管関連発現パターンを示しました。その後、Cdh5プロモーターは、vib6における内皮選択的トランスジーン発現を示す以前の報告と一致し、血管内皮細胞へのトランス遺伝子発現をさらに制限するために用いられました。

異域外NAD⁺アッセイと比較して、このアプローチは血管ネットワークを保持し、同一動物内で縦断的測定が可能であり、内皮代謝信号と血管腔のリファレンスを同時に評価できます。このワークフローは、加齢、炎症ストレス、BBB機能障害、ニコチンアミドモノヌクレオチド(NMN)投与(^{9、10、11、12、13})などの代謝介入への迅速な反応の研究に特に有用です。この方法は、実験課題が生マウスの皮質微小血管の繰り返しの可視化や内皮センサーチャネル信号の相対的な変化を必要とする場合に最も適しています。追加の比率計量較正や生化学的検証なしには、絶対NAD⁺定量にはあまり適していません。実務的な制約には、皮質の光学アクセスの制限、画像の奥行きの制約、成功した内皮AAVトランスダクションへの依存、頭蓋窓関連炎症の可能性、そして二重波長の2光子顕微鏡の必要性が含まれます。慢性的な頭蓋窓埋め込みは局所炎症、血管反応性、膠凝症、不透明度、組織の再形成を誘発し、これらはすべて内皮生理学やセンサーチャネル測定に影響を与える^{可能性があります。}これらの交絡因子を最小限に抑えるために、プロトコルでは無菌手術、頻繁な冷却を伴う断続的なドリル、慎重な止血、硬膜への接着剤接触の回避、術後の鎮痛、日々のモニタリング、持続的な不透明性、炎症性の破片、感染、不安定な血管形態、または基準線信号の安定性が低い動物の排除が必要です。

プロトコル

すべての手技は、健康リハビリテーション科学大学動物倫理委員会により「 血液脳関門完全性の代謝プローブによる観察の機構的研究」(承認番号KFDX: NO. 2023-1023)というプロジェクトの下で承認されました。すべての手術は無菌条件下で実施し、承認された動物プロトコルに従って術中期期鎮痛および支持ケアを提供します。代表的なワークフローでは、手術前または直後にブプレノルフィン塩酸塩(0.05–0.1 mg/kg、皮下投与)を投与し、必要に応じて8〜12時間ごとに24〜48時間投与します。温められたケージで回収し、正常な姿勢、自発的な動き、安定した呼吸が回復するまでモニタリングしてください。

1. 実験の概要

1. 代表的な実験には、10〜12週齢、体重23〜25gの成体C57BL/6Jマウスを用います。
2. マウスは特定の病原体のない環境で、12時間の明暗サイクル、周囲温度22°C–24°C、相対湿度40%–60%、そして自由に餌と水を得られる環境で飼育してください。
3. 処置の少なくとも7日前から動物を順応させてください。
4. 実験デザインに応じて性別はどちらかを用いてください。各実験ごとに性別、動物数、グループ割り当てを報告してください。ここに示された代表的なイメージングデータセットはN=3匹のマウスを使用していました。
5. まず全身性AAVを投与し、画像検査前に3〜4週間の発現期間を確保します。
6. 画像検査の3〜5日前に頭蓋ウィンドウ手術を行います。
7. 画像撮影日にマウスを麻酔し、TMR–デキストランを静脈内注射し、十分なトレーサー循環後に画像診断を行います。
8. 選択した介入スケジュールに従ってNMNを投与してください。画像検査の5日前に飲料水補給を行い、画像検査前定めの間隔で経口ガベージを行うか、ベースライン取得後の画像診断中に静脈内NMNを投与します。
   注意:AAV投与後は3〜4週間の発現期間中にプロトコルを一時停止し、動物は定期的な健康監視と標準的な飼育環境のもとに置いてください。頭蓋ウィンドウ手術後、3〜5日間の回復期間中にプロトコルを一時停止してください。画像検査に進む前に、体重が安定していること、正常なグルーミングや活動、感染や過度の炎症のなさ、そして頭蓋の窓がクリアであることを確認しましょう。

2. 縦方向皮質画像診断のための頭蓋窓手術

1. 術前準備
   1. 麻酔誘導前にすべての手術器具を滅菌し、無菌フィールドを確立してください。
   2. 恒温加熱システムを36.5°C〜37.5°Cに保つように設定し、できれば直腸プローブフィードバックコントローラーを使用してください。
   3. 呼吸器モニタリング機器を準備し、手術前に安定した機能を確認してください。
   4. 処置開始前に、無菌生理食塩水、吸収性綿棒、止血材料、無菌No.1.5ガラスカバースリップ、金属製ヘッドプレート、デンタルセメントを準備してください。
   5. 滅菌のNo.1.5ガラスカバースリップを使い、3mm×3mmの頭蓋窓を完全に覆い、頭蓋骨の縁にぴったりと収ませてください。
   6. 0.5〜1.0mmのバリを装着した高速マイクロドリルを準備します。
   7. ドリルを最大速度の約半分で操作し、頭蓋骨薄化中に即座に無菌生理食塩水洗浄が可能か確認してください。
   8. ドリル中は室温の滅菌生理食塩水を綿棒やスポイトで塗布し、頭蓋骨を冷却し骨の粉塵を除去します。
2. 麻酔、頭皮の準備、頭蓋骨露出
   1. 新たに調製したアベルチン作動液(1.25%、12.5 mg/mL)を腹腔内注射で200〜250 mg/kgで麻酔します。
      1. 2,2,2-トリブロモエタノールおよび2-メチル-2-ブタノールからアヴェルチン作動液を機関の標準作業手順に従って調製し、溶液を光から保護し、沈殿や変色が見られる製剤は廃棄してください。
   2. 足踏筋の引き込み反射の喪失と安定した呼吸によって、安定した手術面を確認します。
   3. 麻酔誘導後すぐに両目に眼科軟膏を塗ってください。
   4. 吸入麻酔を使用する場合は、3%〜4%のイソフルランで麻酔を誘導します。
   5. 酸素中で1%〜2%のイソフルランを0.5〜1.0 L/minで麻酔し、呼吸や反射に応じて調整します。
      注意:麻酔薬は施設の安全手順に従って取り扱い、吸入麻酔を施す際は適切なスカベンジングシステムを使用してください。
   6. マウスを立体型フレームやカスタムヘッドホルダーに固定し、背側頭蓋骨に安定してアクセスできるようにします。
   7. 利用可能な場合は、フィードバック制御型の温熱パッドと直腸プローブを使用して、体温を36.5°C〜37.5°Cに保ちます。
   8. 頭皮を剃り、手術現場の緩んだ毛を取り除きましょう。
   9. 頭皮を交互にポビドンヨウ素またはヨードフォール溶液と70%エタノールを3サイクル消毒します。
   10. 消毒液を目や頭蓋の開口部に入れないようにしてください。
   11. 頭皮の中央に切開し、皮膚を優しく引き戻します。
   12. 頭蓋骨を十分に露出させ、頭蓋の窓作成とヘッドプレートの固定の両方を可能にします。
   13. 細かい鉗子やメスの刃を使って骨膜と残存結合組織を除去します。
   14. 頭蓋骨を滅菌綿棒で約10〜20秒ほど優しく乾燥させ、表面が湿っているのではなくマットに見えるまで続けます。
   15. 露出した組織の過度な脱水を避けてください。
3. 3mm×3mm開頭手術のマーキング
   1. 外科顕微鏡でブレグマとラムダを識別します。
   2. これらの解剖学的ランドマークを使って、正中線とターゲットとなる皮質領域を位置付けます。
   3. 背側体性感覚野の片側半球に3mm×3mmの正方形をマークしてください。
   4. 前縁はブレグマの後方約0.5mm、内側縁は正中線から約1.0mm外側に位置させます。
   5. 可能な限り、主要な頭蓋骨縫合や大きな表面血管は避けてください。
4. ドリルと骨弁除去
   1. 連続的な圧力ではなく、断続的なドリル接触で頭蓋骨を周囲に沿って薄くします。
   2. 掘削中は熱損傷を防ぐために、無菌生理食塩水を繰り返し使用してください。
   3. 1回の投与で約20〜50μLの滅菌生理食塩水を投与し、頭蓋骨表面を湿らせ冷やすのに十分な量を与えます。
   4. 10〜20秒ごと、または骨屑がたまる、または熱の蓄積が疑われる場合は再度灌漑を行います。
   5. 骨が均一に半透明でわずかに柔軟になるまで薄くしていきます。
   6. 硬膜血管の可視化、硬膜脈動の保存、皮質圧迫や熱変色の欠如を観察して十分な薄化を確認しましょう。
   7. 過度の熱蓄積、出血、または硬膜脈動の減少が発生した場合は、直ちに掘削を中止してください。
   8. その地域に灌漑を行い、再評価してから続けてください。
   9. 細かい鉗子や針先で骨のフラップを片隅から優しく持ち上げます。
   10. 抵抗が残る場合は周囲を薄くしなってください。
   11. 骨弁除去時には硬膜をそのまま保存してください。
   12. 骨の粉塵は滅菌生理食塩水で洗い流してください。
   13. 軽度の出血は、優しい生理食塩水洗浄と吸収性綿棒でコントロールしてください。
   14. 灌流と吸収スワブ接触後1〜2分以内に収まる出血は許容範囲とみなされます。
   15. 出血が約5分以上続く場合は、動物を排除するか処置を中止してください。
   16. 硬膜が裂けたり、皮質圧迫が起きたり、血液が画像領域を覆い隠した場合は、動物を排除するか処置を終了してください。
       注意:完全な止血後およびカバースリップ挿入前に一時的に手技を一時停止することがあります。露出した硬膜は滅菌生理食塩水で湿った状態に保ち、出血がないことが確認されてから再開してください。
5. 窓の密閉とヘッドプレートの固定
   1. 露出した硬膜が清潔で湿っており、活発な出血がないことを確認してください。
   2. 開頭切開部に無菌のカバースリップを敷きます。
   3. 硬膜を圧迫せずに、頭蓋骨切開を囲む頭蓋骨の縁にカバースリップを置いてください。
   4. カバースリップ表面がフラッシュであること、気泡が閉じ込められていないこと、硬膜パルスの保存、光経路のクリアさを確認して正しい位置を確認しましょう。
   5. メーカーの指示に従って、デンタルセメントまたはスーパーボンドC&Bタイプ接着剤を準備してください。
      1. 代表的なスーパーボンドC&B製剤としては、粉末1スクープに触媒1滴、モノマー4滴を、約−20°Cの温度で冷却直後に保温したセラミック皿を混ぜます。
   6. カバースリップの周囲の頭蓋骨の外縁だけに接着剤を塗ってください。
   7. 硬膜への接着剤接触や、ガラス下の毛細血管のウィックバックも避けてください。
   8. 接着剤を室温で約5〜10分間硬化させます。
      注意:歯科用セメントや接着剤には揮発性または刺激性の化学物質が含まれている場合があります。施設の安全手順に従って取り扱い、適切な換気を行ってください。
   9. 頭蓋の窓の周りにカスタムチタン製のヘッドプレートを配置します。
   10. イメージングヘッドホルダーと互換性のある約10mmの中央開口部を持つヘッドプレートを使用します。
   11. 頭蓋窓をヘッドプレートの開口部内に中央に合わせてください。
   12. 光学窓の外側、頭蓋骨に接触する部分にのみ歯科用セメントを塗布してください。
   13. 動物を移動させる前に、セメントが完全に硬化するまで約5〜10分待ちます。
6. 術後の回復と窓の品質管理
   1. 承認された動物プロトコルに従って術後鎮痛を投与してください。
   2. 代表的なワークフローでは、塩酸ブプレノルフィンを0.05〜0.1 mg/kgを8〜12時間ごとに皮下投与し、24〜48時間投与します。
   3. 温まったケージでネズミを回収しましょう。
   4. 呼吸、姿勢、動き、グルーミング、体重を毎日モニタリングしてください。
   5. 透明なガラス表面、目に見える皮質血管、完全な硬膜、最小限の残留血液、カバースリップの下に接着剤がない、感染なし、安定したヘッドプレート固定を持つ頭蓋窓を受け入れてください。
   6. 著しい不透明度、持続的な出血、炎症性破片、感染、窓の位置移し、重度の体重減少(>15%)、またはグルーミングや活動不良の動物は除外します。
   7. 回復から3〜5日後に画像検査に進みます。
   8. 画像検査前に、正常な活動、正常なグルーミング行動、安定した体重、痛みや感染のなさ、透明な頭蓋の窓と明確に見える血管を確認してください。
      注意:術後の回復期間中はプロトコルを一時停止する場合があります。マウスは標準的な飼育環境で維持し、体重と窓の透明度を毎日監視し、すべての回復基準が満たされた後に画像診断を再開してください。

3. AAV媒介の内皮NAD⁺ センサー発現

1. ウイルス構成と調製
   1. 内皮Cdh5プロモーター駆動の遺伝子コードされたNAD⁺ バイオセンサーを用いたeGFP/cpVenusを用いてください。
   2. Cambronneらの資料を使いましょう。LigA-cpVenus 細胞質NAD⁺ バイオセンサー配列(例:Addgeneプラスミド#186787または同等の配列検証済み挿入物)。
   3. CV232ベクターバックボーンを用いて、NAD⁺ バイオセンサーコード配列の上流にあるCdh5プロモーターをクローン化しました。
   4. 発現カセットをAAV-X1.1カプシドにカスタマイズされたウイルス製剤としてパッケージ化します。
      1. 各AAV製剤のウイルス生産提供者、精製方法、ウイルスゲノム定量方法、生産ロット番号、分析証明書を記録してください。
   5. 各ウイルス製剤ごとにプラスミドマップ、配列検証結果、ウイルス生成情報、精製情報、ウイルスゲノムタイター、分析証明書を記録します。
      1. 各ウイルス製剤の構成体マップ、配列検証報告書、ウイルス生産バッチ番号、定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)抗体価報告書、精製記録、分析証明書を各研究で使用したものを記録します。
   6. 構造物の詳細は 材料表 を参照してください。
   7. ロット特異的qPCR抗体価は通常2 ×^{10 13} vg/mLを超える高抗体価AAV製剤を使用してください。
   8. 使い捨てアリコートは−80°Cで保管します。
   9. 繰り返される凍結と解凍のサイクルは避けましょう。
   10. 使用前に生産ロット、qPCRタイター、保管期間、ロット間許容される変動を記録してください。
2. 体系的なAAV管理
   1. ウイルスのアリコートを氷の上で解凍する。
   2. ウイルスを滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、マウス1匹あたり最終注射量100〜200 μLにします。
   3. 動物ごとに1匹あたり2×10〜¹² vgの最終投与量を維持してください。
      1. ロット特異的ウイルスゲノムタイターから注射量を計算します。qPCRタイターが1.39 ×^{10 13} vg/mLの代表的な製剤の場合、約144 μLを注入してマウスにつき2 ×^{10 12} vgの投与量を供給します。
   4. 無菌の29Gインスリン注射器を用いて後眼窩静脈洞注射でウイルスを送達します。
   5. ウイルス懸濁液を約10〜20秒かけてゆっくり注射します。
   6. 漏れ、過剰出血、眼の損傷がないか確認して、分娩の成功を確認しましょう。
   7. 代替投与経路があれば別途検証・報告してください。
   8. マウスを観察し、通常の姿勢と自然な動きが回復するまで。
   9. 呼吸が安定し、出血や苦痛がないことを確認します。
   10. 完全に回復してからのみ、動物を元のケージに戻してください。
   11. 画像検査前にセンサー発現に21〜28日を設けてください。
   12. 各比較セット内で一貫した発現間隔を維持しましょう。
   13. 21〜28日の範囲外の発現間隔も別々に検証してください。
       注意:プロトコルはAAV発現期間中に一時停止されることがあります。定期的な飼育と健康状態のモニタリングを維持し、予定された発現間隔が過ぎてから頭部手術を進めてください。
3. 内皮制限の検証
   1. 正式なデータ収集前に動物のスクリーニングを行うこと。
   2. 緑色のセンサーチャネル信号が検出可能で血管ネットワークに沿っている場合は動物を受け入れます。
   3. シグナルがTMR–デキストラン陽性のルーメンに隣接する血管壁に沿って濃縮されていることを確認します。
   4. 優勢なびまん性実質蛍光の欠如を確認してください。
   5. すべての実験群に同一の受け入れ基準を適用してください。
   6. 事後検証が必要な場合、PBSを投与した後に4%のパラホルマルデヒドを投与するマウスに投与します。
   7. 脳を採取し、30〜40μmの冠状または矢状図片を準備します。
   8. トマトレクチン、CD31、または血管内皮カデリン(VE-cadherin)などの内皮マーカーを用いた染色切片。
      1. 各検証実験ごとに抗体源、カタログ番号、ロット番号、宿主種、希釈、培養条件、検出方法を記録してください。
   9. 必要に応じてニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ(NAMPT)およびポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ1(PARP1)の発現を評価します。
   10. 組織調製に最適化された一次抗体希釈を用いてください。
   11. グループ間で同一の取得設定を用いて蛍光または共焦点画像を取得します。
   12. 共局在を、センサー陽性信号のうち血管マーカー陽性領域と重なったり、そのすぐ隣接する割合として定量化します。
   13. 検出可能な信号が血管構造の外にある場合は、動物を除外します。
   14. 容器壁の濃縮がない場合は動物を除外してください。
   15. 標的外の実質蛍光が信頼できる関心領域選択を妨げる場合は、動物を除外します。
   16. ベースライン取得時にセンサーチャネル蛍光が飽和または不安定の場合は動物を除外します。

4. 二光子イメージングと定量解析

1. 画像診断日の準備と血管内参照標識
   1. マウスには、新たに調製したアバーチン作動液(1.25%、12.5 mg/mL)を腹腔内注射(200–250 mg/kg)で麻酔するか、施設動物プロトコルで承認された麻酔レジメンを使用します。
   2. 足の引き込みと呼吸の安定によって手術面が安定していることを確認します。
   3. 誘発直後すぐに眼軟膏を塗ってください。
   4. 吸入麻酔を使用する場合は、3%〜4%のイソフルランで麻酔を誘導します。
   5. 酸素中で1%〜2%のイソフルランを0.5〜1.0 L/minで麻酔し、呼吸や反射に応じて調整します。
   6. 滅菌PBS中に70 kDaのTMR–デキストランを10〜25 mg/mLで調製します。
   7. TMR–デキストラン溶液を光から保護し、機関の実践に基づき溶液をろ過してください。
   8. TMR–デキストランを20 mg/kgで静脈内注射します。
   9. 注入量はストック濃度に応じて調整してください。25gのマウスに対して、総着色料約0.5mgを投与します。
   10. トレーサーは新鮮に準備するか、製造元の指示に従って光から保護された形で保管してください。
   11. 画像取得前にTMR–デキストランを5〜10分間循環させます。
2. 顕微鏡の構成
   1. eGFPベースのセンサーチャネルの920 nm励起に対応したデュアル波長の2光子顕微鏡を使用してください。
   2. TMR–デキストラン血管参照チャネルには1040 nmの励起経路を使用します。
   3. 代表的なイメージングは、NIS-Elements AR/AR解析ソフトウェア(バージョン5.42.06)で制御されたニコンA1 MP/A1R MP+多重光子顕微鏡で実施されました。
   4. 各イメージングシステムのレーザー光源、パルスパラメータ、ビームの組み合わせ構成、検出器の種類、ソフトウェアバージョンを記録します。
   5. 検出チャネルを設定し、センサーチャネル信号とTMR–デキストラン信号を分離します。
   6. 非脱走型光電子増倍管(PMT)やリン化ガリウム(GaAsP)検出器を使用してください。
   7. 約500〜550 nmの緑色センサーチャネル放射を収集します。
   8. 約570〜650nmのTMR–デキストラン放射を収集します。
      1. 代表的なデータセットでは、525/50 nmの発光フィルターを用いてグリーンセンサーチャネルの発光を収集し、575/25 nmまたは610/75 nmの発光フィルターでTMR–デキストラン放出を収集します。
   9. チャンネル間のスペクトル漏れを最小限に抑えましょう。
   10. 各比較セット内で検出器の利得とオフセット設定を一定に保ちます。
   11. 利用可能な場合は、シングルチャンネル制御でチャンネル分離を確認しましょう。
   12. Nikon CFI75 Apochromat 25XC W 1300の水浸式対物レンズまたは同等のレンズ(25×、数値絞り1.10、作業距離2.0mm)を使用してください。
   13. 分岐やルーメンエッジなどの固定された血管ランドマークを用いてチャネル共登録を確認します。
   14. 光経路調整後は共登録検証を繰り返します。
   15. イメージング前に試料面でレーザー出力を測定してください。
   16. 各比較セット内で920 nmのレーザー出力を一定に保ちます。
   17. 各比較セット内で1040 nmのレーザー出力定数を維持してください。
   18. 代表的な作業範囲として、920 nmで約10〜20 mW、1040 nmで8〜18 mWを用いてください。
   19. 画像深さや頭蓋窓の品質に応じてレーザー出力を調整してください。
   20. 120秒の基準期間中に20%を超える信号損失があったフィールドは除外します。
   21. 光毒性の変化が目に見えるフィールドを除外してください。
3. 取得設定
   1. 明確な光学ウィンドウ、鋭く焦点を合わせた微小血管、最小限の動きを持つ視野を選びます。
   2. 透明なカバースリップ、目に見える皮質血管、無傷の硬膜、残留血液が最小限、カバースリップの下に接着剤なし、感染なし、安定したヘッドプレート固定がある窓を受け入れてください。
   3. 著しい不透明度、持続的な出血、炎症性破片、感染、窓の移動、重度の体重減少(>15%)、またはグルーミングや活動不良の動物は除外します。
   4. 512ピクセル×512ピクセルのタイムラプス画像を取得できます。
   5. より高度な空間ディテールが必要な場合は、1024ピクセル×1024ピクセルで代表的な静止画を取得します。
   6. 各比較セット内でピクセルサイズ、ズーム、スキャン速度、視野角を一定に保ちます。
   7. ステップサイズ1–3 μmでzスタックを取得します。
   8. 皮質表面下約200〜250μmの深さにある皮質微小血管を画像化します。
   9. 窓の品質が許す場合は、画像深さを約400μmまで拡張します。
   10. ペア比較のために画像深度を一定に保つこと。
   11. 急性介入前に1秒間隔で120秒の基準値を取得してください。
   12. あらかじめ定められた介入後期間中は取得を続けます。
   13. 注射後約10〜30分間の静脈内NMN応答を記録します。
   14. あらかじめ定められた実験エンドポイントで飲料水および口腔漏水データセットを取得します。
   15. すべての比較群で同一の獲得設定を維持します。
4. NMN介入(応用例)
   1. NMNを滅菌飲料水に溶かします。
   2. NMN濃度を調整して、約100 mg/kg/1日の投与量を供給します。
   3. 飲み物のボトルを光から守りましょう。
   4. NMNを含む飲料水は24〜48時間ごとに補充してください。
   5. ボトルの重量測定で水の消費量を監視しましょう。
   6. 水の摂取量と体重を用いて推定NMN摂取量を計算します。
   7. 画像検査の5日前からサプリメントを続けてください。
   8. 経口ガベージ用に1 mg/mLのNMNを準備してください。
   9. マウス1匹あたり200μLを、20G、38mmの丸い先端ガベージ針を投与します。
   10. ガビッジ後30〜60分後に画像検査を行います。
   11. 静脈内投与用にNMNを1 mg/mLで準備します。
   12. 1匹あたり100μLを後眼窩静脈洞または尾静脈から注入します。
   13. 注射は10〜20秒でゆっくりと投与してください。
   14. 注射後すぐまたは5分以内に画像検査を開始してください。
   15. 補給5日後に飲料水データセットを取得します。
   16. 固定された経口閉鎖後の時間点で経口漏珠データセットを取得します。
   17. 静脈注射直前に基準値を取得してください。
   18. 静脈注射後約10〜30分間急性反応が記録されます。
5. 画像処理と信号抽出
   1. モーションアーティファクトが存在する場合はモーションコレクションを実施してください。
   2. Fiji/ImageJ(バージョン1.8.0以降)をStackReg、TurboReg、または同等のリジッドボディレジストレーションアルゴリズムと組み合わせて使用してください。
   3. TMR–デキストランチャネルの血管ランドマークを用いて登録を導きます。
   4. 修正後、残差変位が約1〜2ピクセル未満の場合のみデータセットを受け入れます。
   5. 取得期間中、血管領域(ROI)境界が安定していることを確認しましょう。
   6. TMR–デキストランチャネルを使って血管内腔を分割します。
   7. 内皮ROIはルーメンのすぐ隣に定義します。
   8. 安定した腔の標識、最小限の動き、可視性のセンサーチャネル信号を持つ選択された微小血管。
   9. 約5〜80μmの血管直径を解析します。
   10. 内皮ROIとは、幅約2〜5μmの血管壁関連領域と定義します。
   11. 利用可能な場合は、視野あたり3〜5隻の船舶を分析してください。
   12. 利用可能な場合は、マウスごとに1〜3個の視野を解析してください。
   13. トレーサーおよびセンサー信号が欠如する組織領域におけるバックグラウンドROIを定義します。
   14. 背景ROIは分析対象の容器や画像アーティファクトから少なくとも20μm離れた場所に配置してください。
   15. 正規化前に各チャンネルから平均背景強度を差し引いてください。
   16. すべてのサンプルに同じ背景減算戦略を適用してください。
   17. F_sensor(t)の時系列平均強度値を抽出します。
   18. F_ref(t)の時系列平均強度値を抽出します。
   19. NIS-Elements AR/AR解析またはFiji/ImageJを用いて測定を行います。
   20. RAW画像ファイルをND2ファイルとしてエクスポートしてください。
   21. 可能な限り、分析コピーを16ビットのTIFFスタックとしてエクスポートします。
   22. ROIの時系列データをCSVファイルとしてエクスポートできます。
   23. 正規化前に背景を差し引いた蛍光値を計算します。
   24. ΔF/F₀ = (F(t) − F₀)/F₀ を用いて計算します。
   25. _F0を120秒の基準期間の平均信号と定義します。
   26. 血管参照の正規化をF_sensor(t)/F_ref(t)として計算します。
   27. 獲得期間が許す場合は、ピーク変化、ピークまでの時間、曲線下面積、回復速度論を報告してください。
   28. 920 nmのセンサーチャネル信号を校正済みNAD⁺ 濃度として解釈しないでください。
   29. 定量的なNAD⁺ 測定が必要な場合は、追加の比率校正や生化学的検証を行います。
6. 統計と報告
   1. マウスを生物学的実験単位と定義します。
   2. グループレベル分析の前に、各マウス内の平均血管レベルの測定値、またはネスト統計モデルを適用する方法。
   3. マウス内で正規分布比較を行うには、ペア付き二尾t検定を使用します。
   4. 正規性仮定が満たされない場合は、Wilcoxonマッチペア署名順位検定を用いましょう。
   5. 関連する疾患が2つ以上関与する分析には、反復測定ANANOVAまたは混合効果モデルを用いてください。
   6. 適切な多重比較修正を適用してください。
   7. GraphPad Prismまたは同等のソフトウェアを使って統計解析を行います。
   8. 統計的有意性をp < 0.05と定義します。
   9. 各図の凡例に正確な統計検定を報告してください。
   10. 可能な限り、ROIの選択や定量化前に画像ファイルをコード化してください。
   11. ROI測定と品質管理の決定が完了するまで、アナリストの目立たしを維持しましょう。
   12. 代表的なデータセットの生物学的実験単位としてN = 3匹のマウスを使用します。
       注意:アクティブタイムラプス撮影中は画像取得を一時停止しないでください。画像処理や定量分析は、生データのエクスポート後に一時停止されることもあります。ND2ファイル、TIFF解析ファイル、ROIファイル、メタデータ、CSV測定テーブルをバックアップされたアーカイブに保存します。各撮影セッションごとにレーザー出力、検出器設定、画像深度、動物同定、治療割り当て、除外決定を記録します。

結果

調製が成功すれば、縦方向画像診断に適した透明で機械的に安定した頭蓋窓が得られます。 図1A は、麻酔と頭蓋骨曝露から開頭手術、カバースリップの挿入、ヘッドプレート固定、術後の回復までの手順をまとめています。 図1B は主要な手術ステップの代表的な連続写真を示しています。画像診断に適した窓は、明確な光路、目に見える皮質血管、完全な硬膜、最小限の残留血液、カバースリップの下に接着剤が存在せず、頭蓋縁にぴったりと位置するカバースリップを示します。対照的に、不成功の製剤は著しい不透明度、気泡の閉じ込め、持続的な出血、炎症性破片、感染、骨の再生、窓のずれ、または光学アクセスの不十分さを示し、定量的画像検査の前に除外すべきです。持続的なウィンドウ不安定性、皮質血管の可視化障害、または画像品質を損なうその他の特徴を持つ動物は、下流解析に含めるべきではありません。

ディスカッション

このプロトコルは、生体内で脳内皮NAD⁺代謝をモニタリングするためのエンドツーエンドワークフローを提供します。成功の主な要因には、(i) 窓の透明度と安定性(熱損傷の最小化や掘削中の出血制御を含む)、(ii) AAVカプシド、プロモーター、用量、発現間隔の適切な選択により、内皮特異性と十分なセンサー発現が得られること;および(iii)特に縦断比較を行う際の一貫した画像診断および分析環境。血管内TMR–デキストランチャネルは、血管選択、ドリフト補正、正規化戦略を支援する堅牢な血管-内腔参照を提供します。各実験シリーズで内皮特異性を検証する必要があります。なぜなら、AAVのカプシド嗜好性、プロモーター活性、用量、注射経路、組織状態がトランスダクション効率や細胞標的化に影響を与えるからです。利用可能な場合、AAV-X1.1-Cdh5-EGFP対照ベクターを報告者として用いて、NAD⁺バイオセンサー構成体を適用する前に内皮の標的化、血管制限、およびオフターゲット発現を評価することができます。実質細胞や血管周囲細胞にお...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2,2,2-トリブロモエタノール（アベルティン）	シグマ・アルドリッチ	T48402	注意：有毒/有害な化学物質。頭蓋窓手術用アベルティン麻酔溶液の調製に使用。代表的な使用溶液：1.25%（12.5 mg/mL）、200–250 mg/kgの割合で腹腔内投与。
2-メチル-2-ブタノール	シグマ・アルドリッチ	152463	注意：有毒/有害な化学物質。濃縮アベルティン溶液の調製に使用する溶媒。光を避け、沈殿や変色を示す調製物は廃棄する。
吸収性綿棒	Winner Medical	滅菌医療用綿棒	止血、頭蓋骨の乾燥、灌流、および手術部位の維持に使用。
AAV-X1.1-Cdh5-細胞質NAD+バイオセンサー-SV40 pA	上海ジーンケム株式会社；プラスミドのAddgeneソース	ジーンケムコンストラクトGCPV5052075；Addgene #186787；Addgene #196836	AAV-X1.1にパッケージ化された内皮標的NAD+バイオセンサー。発現カセット：Cdh5プロモーター–細胞質NAD+バイオセンサー–SV40ポリ(A)。代表的な注入量：2 × 10¹² vg/マウス。−80 °Cでアライquotを保管し、繰り返しの凍結融解回数を避ける。ロット固有のqPCR価、バッチ番号、プラスミドマップ、配列検証、および分析証明書を記録。
鎮痛剤（ブプレノルフィン塩酸塩）	MCE	HY-B0071	術中および術後鎮痛。代表的な用量：0.05–0.1 mg/kgを8–12時間ごとに24–48時間経皮的に投与。
麻酔投与システム	RWD Life Science	R500 with R580 気化器	イメージング中のイソフルラン投与に使用。典型的な酸素フロー：0.5–1.0 L/min。
麻酔剤（イソフルラン）	RWD Life Science	R510-22シリーズ	イメージング麻酔に使用。典型的な設定：3–4%誘導および1–2%維持。
カブリスリップ	カスタムメイド	カタログ番号なし	頭蓋窓を完全に覆い、頭蓋縁にぴったりと合う3 × 3 mmの頭蓋窓用の滅菌No. 1.5ガラスカブリスリップ。
歯科用セメント/接着剤	サンメディカル	Super-Bond C&B; VZB/JAP8147	頭蓋窓のシーリングとチタン製頭部プレートの固定に使用。代表的な調製：粉末1スクープ、触媒1滴、モノマー4滴。室温で約5–10分硬化。
歯科用ドリル	RWD Life Science	78001 マイクロドリル	頭蓋骨の薄化と開頭術に使用する高速ドリル。最大速度の約半分を使用して、頻繁に生理食塩水で冷却する。
消毒液	Winner Medical	ポビドンヨウ素/ヨードホアと70%エタノール	手術前の頭皮の準備に使用。3サイクルで交互に消毒剤を塗布。
精密鉗子	JZブランド	JD1050/JD1070	骨膜の除去、組織の操作、および骨片の持ち上げに使用。
経口注射針	RWD Life Science	20G、38 mm、球状先端	経口NMN投与に使用。
頭部プレート	カスタムメイド	カタログ番号なし	イメージングホルダーと互換性のある約10 mmの中央開口部を持つチタン製頭部プレート。
加熱パッド/恒温コントローラ	RWD Life Science	69020 with 69023パッド	手術とイメージング中に体温を約36.5–37.5 °Cに維持するために使用。
画像取得ソフトウェア	ニコン	NIS-Elements AR/AR Analysis v5.42.06	顕微鏡制御と画像取得に使用。代表的な設定には、512 × 512または1024 × 1024ピクセル、1–3 µm zステップ、および1秒のタイムラプス間隔が含まれます。
画像解析ソフトウェア	NIH	Fiji/ImageJ v1.8.0以降	モーション補正、ROI選択、背景減算、強度抽出、およびCSVエクスポートに使用。
静脈内注射用品	BD	329461	AAV、TMR–デキストラン、およびNMN注射用の滅菌1 mLインシュリンシリンジと29G針。
NMN（ニコチンアミドモノヌクレオチド）	Selleck Chemicals	S5259	飲料水、経口経管投与、および静脈内投与実験に使用するNAD+前駆体。
眼科用軟膏	認定薬局	該当なし	麻酔中の角膜乾燥を防ぐために使用。
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）	Servicebio	G4202-100MLまたはG4202-500ML	ウイルス希釈、トレーサー調製、組織すすぎ、および試薬調製に使用する滅菌1× PBS。
呼吸モニタリングシステム	RWD Life Science	統合モニタリングモジュール	手術とイメージング中の呼吸と麻酔深度をモニタリングするために使用。
生理食塩水（0.9% NaCl、滅菌）	Servicebio	G4702-500ML	頭蓋骨の冷却、灌流、組織の保湿、および溶液の調製に使用。
ステレオタキシックフレーム/ヘッドホルダー	カスタムメイド	カタログ番号なし	頭蓋窓手術とイメージング中の安定な位置決めに使用。
手術用顕微鏡	オリンパス	SZ61	頭蓋窓手術中の頭蓋骨の薄化、開頭術、およびカブリスリップの配置に使用。
TMR–デキストラン（70 kDa）	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	D1818	血管参照ラベリングに使用する血管内蛍光トレーサー。典型的な濃度：10–25 mg/mL。20 mg/kgで注射し、イメージングの前に5–10分循環させる。
トマトレクチン（DyLight 488）	Vector Laboratories	DL-11