間接磁気ビーズ戦略を用いたポドプラニン陽性間葉質幹細胞サブポピュレーションの単離と検証

サマリー

本プロトコルは、フィコエリスリン(PE)標識されたフローサイトメトリー抗体と抗PEマイクロビーズを用いて、高価な細胞選別機や標的特有のカスタムビーズを必要とせず、試験条件下で高い後選定標的マーカー陽性率とCCK-8ベースの増殖・代謝活性を維持する特定の間葉幹細胞サブポピュレーションを分離する磁気ビーズベースの選別法を説明しています。

要約

間葉系幹細胞における機能的異質性の研究は、特定のサブ集団(例:ポドプラニン(PDPN)陽性細胞)の効率的な単離に依存しています。しかし、ほとんどの膜タンパク質標的では、選別用の市販磁気ビーズは限られています。これに対処するため、当研究室は「フィコエリスリン(PE)標識フローサイトメトリー抗体/抗PE磁気ビーズ」という間接結合原理に基づく標準化された磁気ビーズ選別プロトコルを確立・試験しています。PDPN陽性細胞をモデルターゲット集団として用いるこのプロトコルは、高価なフローサイトメトリック細胞選別機に依存せずに標的細胞の画分を濃縮します。

研究者は、利用可能な細胞表面タンパク質を標的とした適合するPE標識フローサイトメトリー抗体を用い、市販の抗PEマイクロビーズと組み合わせて、標的特異的最適化後に選定された標的の選別ワークフローを確立できます。この方法は、ターゲットごとにターゲット固有の磁気ビーズをカスタマイズ・注文する際の長いリードタイムや高コストを回避し、希少または研究が不十分な表面マーカーに特に適しています。ここでテストしたPDPNモデルシステムでは、未分類MSCと比較して高いPDPN陽性率とCCK-8ベースの増殖・代謝活性の維持を目的サブポピストの濃縮を可能にしました。

概要

整形外科の分野では、軟骨損傷や半月板の無血管帯(白帯)の損傷などの損傷は、しばしば不可逆的な関節損傷や機能喪失を引き起こし、最終的に変形性関節症を引き起こします。これは主に、これらの組織の再生能力が低いこと、すなわち直接的な血液やリンパ供給の欠如、そして増殖や移動能力が限られた高度に分化した細胞の存在に起因しています(1,2,3,4)。この課題に対処するため、エクソソーム^5,6の利用、自家または異種軟骨細胞移植^7,8、組織工学的アプローチ9,10,11,12など、さまざまな臨床戦略が検討されています。近年、間葉幹細胞(MSC)は多系統分化の可能性と免疫調節特性により再生修復の有望な細胞源として浮上し、軟骨再生に新たな希望をもたらします 13,14,15,16。

治療の可能性があるにもかかわらず、MSCは顕著な異質性を示します。骨髄や臍帯のような単一の組織源内でも、異なるMSCのサブ集団は増殖能力、多系統分化の可能性(特に軟骨性分化)、および生体内再生機能においてかなりのばらつきを示すことがあります(17,18,19)。したがって、機能的に定義されたMSCサブポピュレーション、例えば軟骨形成能力が強化されたものの正確な同定と分離は、その生物学的特性の理解を深め、軟骨修復の有効性を向上させるために不可欠です。これは私たちの研究における重要な一歩を示しています。

研究が進むにつれて、機能的に異なるMSCサブポピュレーションのマーカーとして、新規膜タンパク質のいくつかが同定されています。しかし、これらの発見を効果的な細胞選別戦略に翻訳することは技術的に依然として困難です。従来の蛍光活性化細胞選別(FACS)は強力ですが、専門的な機器や技術的な専門知識を必要とし、多くの実験室での利用が制限されています。一方で、免疫磁気細胞選別はより広く使われていますが、主に確立された膜標的向けに設計された市販試薬の入手可能性が限られているため、制約があります。その結果、生物学的に重要な可能性を持つ多くの新たに発見されたマーカーについては、市販の磁気ビーズが存在せず、これらの貴重なMSCサブポピュレーションを特異的に濃縮することが困難です。

この制約を克服するため、本研究は陽性細胞選択のための柔軟で費用対効果が高く効率的なプロトコルを確立し標準化することを目指しています。このアプローチは、市販のフィコエリスリン(PE)結合抗体と抗PE免疫磁気ビーズの間接接合に基づいています。過去の報告では、ポドプラニン陽性(PDPN⁺)MSCはPDPN^型に比べて幹維持能力と分化能力が優れていることが示されています²⁰。さらに、PDPN⁺MSCsが軟骨再生および変形性関節症(OA)の進行に関与していることも文献で記録されています(^21,22)。機能的MSCサブポピュレーションの最近候補マーカーであるポドプラニン(PDPN)をモデルターゲットとして用い、骨髄由来MSCからPDPN陽性細胞を選別しました。単一細胞懸濁液の調製、抗体および磁気ビーズの標識、磁気分離に関する詳細なステップバイステッププロトコルを提供しています。さらに、選別細胞の収量、選別後のPDPN陽性率、CCK-8ベースの増殖・代謝活性も評価します。このプロトコルを標準化することで、利用可能な細胞表面マーカーに対する適合抗体を用いて標的細胞サブポピュラーを単離する多機能でアクセスしやすい方法を研究者に提供し、基礎幹細胞研究と将来の再生医療におけるトランスレーショナル応用を促進します。

プロトコル

ヒト骨髄由来のMSCは商業的に入手されました(材料 表参照)。供給者はCD73、CD90、CD105の陽性発現によりMSCの同様を確認しました。CD34、CD45、HLA-DRの陰性発現、および三系統分化の可能性。細胞は培養で増殖され、3〜5のパッセージで使用されました。すべてのヒト由来細胞解析は、クラスIIの生物安全キャビネットの無菌条件下で行われました。これらの細胞は商業的に入手されており、このプロトコルではヒト被験者の直接募集やサンプリングは行われなかったため、直接的なIRB承認は必要ありませんでした。

1. 単一セル懸濁液の準備

注:単一セルサスペンションの品質は選別効率に直接影響します。細胞がよく分散し、生存率が高く、塊がないことを確認してください。目に見える塊は、繰り返し優しくピペッティングすることで散布し、塊が見えなくなるまで続けてください。

1. 80〜90%の合流点に達したMSC(3–5のパッセージ)を選択。培養媒体は捨てましょう。
2. 細胞を予温×10mLのPBSを2洗浄します。容器を優しく揺らし、PBSを捨てます。
3. 0.25%トリプシン-EDTAを2mL加え、37°Cで3〜5分間培養します。顕微鏡で細胞を観察し、円を描いて剥離し始めるまで観察してください。
4. トリプシンを中和するために、16.5%のFBSを含む培地4mL(材料 表参照)を加えます。細胞を完全に剥離するために優しくピペットで除去してください。細胞懸濁液を15mLの遠心分離機チューブに移します。
   注意:すべての細胞が採取されているか顕微鏡で確認してください。
5. 300 × g で遠心分離機で3分間置き、上清液を捨てます。
6. 細胞ペレットを1 mLのバッファーに再懸浮させます(材料 表参照)。細胞数を数えて。

2. 細胞計数と濃度調整

注意:総細胞数が1×107未満^でも、標識効率を確保するために1×107^細胞の 標準体積に基づく抗体および磁性試薬を追加してください。

1. 細胞懸濁液を300 × g で3分間遠心分離し、上澄液を捨てます。
2. 細胞をバッファーに再懸浮させ、1×^{10 8} cells/mLの密度にします。
   注意:例えば、10個×⁷ 個セルを処理する場合は、ペレットを100μLのバッファーに再懸濁します。
3. 細胞懸浮液を5mLのポリスチレン丸底チューブに移します。

3. 抗体標識

1. 1×10個⁷セルごとに10μLのFc gamma RIIブロッカー(材料表参照)を加えます。優しく混ぜて室温で10分間孵育します。
2. 製造者の推奨濃度に従い、1×10.7細胞あたり5μLのPE結合抗ヒトPDPN抗体(材料表参照)を加えます。優しく混ぜて室温で15〜20分間、光を遮って孵化させます。
   注意:抗体の量は、使用している特定のフローサイトメトリー抗体のデータシートに基づいて調整する必要があります。製品によって濃度が異なる場合があります。

4. 磁気ビーズ表示

注意:使用前はすべての試薬を氷に保管し、添加後はすぐに氷に戻して活性と一貫性を保ってください。

1. 1×10⁷ セルごとに10μLのセレクションカクテルを加えます(材料 表参照)。優しく混ぜて室温で15分間培養します。
2. 1×10個⁷ セルごとに5μLの磁気ビーズを加えます(材料 表参照)。優しく混ぜて室温で10分間孵育します。
   注意:使用前に磁気ビーズのバイアルを30秒間力強くボルテックスで処理し、均等な分散を確実にしてください。

5. 磁気分離

1. ラベル付きセルサンプルを入れた5mLのポリスチレン丸底チューブを磁気分離台に置きます(材料 表参照)。
2. チューブに緩衝液を加えて、総容量を2.5〜3 mLにします。室温で5分間孵育します。
3. 分離を行う:磁石とチューブを一体として固定し、逆さにして上清液を新しい集水管に注ぎます。この収集された細胞分はPDPN陰性細胞を含みます。このチューブは冷やしておけ。
   注意:この工程ではチューブを磁気スタンドから外さないでください。分離が乱れて処置が失敗します。
4. ステップ5.1–5.3を3回繰り返します。毎回、磁石内の元のチューブにバッファーを加え、5分待ってから、ステップ5.4で使用した同じ負の分率収集管に上清液を注ぎます。
5. 最終洗浄後、磁気結合セルを入れたチューブをスタンドから取り出します。このチューブにはPDPN陽性細胞画分が含まれています。
6. 陽性細胞を再懸浮させるために3mLのバッファーを追加します。この懸流液を新しくラベル付けされた管(正分率管)に移します。

6. 標的細胞の収集、培養および検証

1. 陽性・陰性の分割管の両方の細胞数を数えます。各分画の細胞収率を記録します。
2. 正の分率セル懸濁液を300× g で3分間遠心分離します。上清液は捨てる。
3. 細胞ペレットを16.5%FBSを含むMEMアルファ培養培地に再懸浮させます。必要に応じて細胞密度を調整し、培養皿やフラスコに細胞を植え付けます。
4. 細胞は37°Cで5%CO₂インキュベーターで培養します。

7. 純度および機能検証のための試料準備

1. 細胞を数え、12mLの培地で1皿あたり3個×10個^6細胞の 密度で100mmの培養皿にシードします。種まきから24時間後、細胞の付着を観察してください。残留磁性ビーズや非接着細胞を除去するために、培養培地を新しい培地に交換してください。
2. トリプシン化によって細胞を収穫する。ピペットを上下に10〜15回優しく動かし、磁気ビーズや残留抗体を外して除去します。
3. フローサイトメトリーでPDPN-PE陽性細胞の割合を評価してください(詳細なプロトコルは 補足ファイル1 参照)。
4. 対数成長期に細胞を集めます。96ウェルのプレートに種をまきましょう。異なる時間点(0時、24時、48時、72時)にCCK-8試薬を加え( 材料表参照)、製造元の指示に従って吸水を測定します。データに基づいて拡散曲線をプロットします。

結果

実験の全体的な原理とワークフローは図1に示されています。その後のすべての実験データはパッセージ5細胞に基づいています。磁気分離後、得られたPDPN⁺細胞は24〜48時間培養されました。非接着細胞および潜在的な残留磁気ビーズを除去するために培地を交換した後(図2A)、選別効率と細胞収率を評価しました。初期集団は1×10⁷個のMSCから始まり、Fc受容体遮断、抗体標識、磁気分離後の最終細胞数はPDPN⁺分画で3.5 ± 0.21 × 10⁶、PDPN^-分画は6.4 ± 0.15 × 10⁶でした(図2B)。

磁気選別前は、フローサイトメトリーにより開始細胞集団におけるPDPN陽性...

ディスカッション

本研究では、骨髄由来MSCからPDPN+細胞を分離するための磁気ビーズベースのプロトコルを確立しました。このアプローチにより、PDPN陽性サブポピュラーの効率的な濃縮が可能であり、試験条件下でCCK-8ベースの増殖・代謝活性を維持します。

従来の直接免疫磁気選別法と比べて、この戦略の最大の利点はその多用途性にあります。従来の方法は、関心のある新しい^{マーカー23}ごとに特定の磁気ビーズを開発またはカスタマイズする必要があり、これは時間とコストの両方を要します。これに対し、この方法は市販のPE結合抗体(ほとんどの実験室で一般的な試薬)を活用し、研究者は標的特異的最適化後に選ばれた表面標的の選別ワークフローを確立できます。この柔軟性により、プロトコルはPDPNだけでなく、MSCの他の表面マーカー(例:CD146、CD90、CD105)²⁴ や他の細胞タイプからのサブポピュレーション分離にも適用可能になると期待されています。さらに...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
7-AAD細胞生存能アッセイキット	KeyGEN	KGD1202-50
抗ヒトCD32ブロッカー（FcガンマRIIブロッカー）	STEMCELL Technologies	18520
バッファー	STEMCELL Technologies	20104	バッファー
CCK-8	Meilunbio	MA0218-5
デキストラン磁性粒子	STEMCELL Technologies	50100	磁性粒子
胎児ウシ血清	Gibco	16050-122
マグネット	STEMCELL Technologies	18000	磁気分離スタンド
MEMアルファ培地	Gibco	C12571500BT	MEMアルファ培地（82.5%）+ FBS（16.5%）+ ペニシリン-ストレプトマイシン（1.0%）
MSCs	KeyGEN	KGG5575-1	ヒト骨髄由来間葉系幹細胞
PE共役抗ヒトPDPN抗体	ABclonal	A26770	PDPN-PE
PE選択カクテル	STEMCELL Technologies	18151	選択カクテル
ペニシリン-ストレプトマイシン	Gibco	15140122
トリプシン-EDTA	Gibco	25200-072