キメラ抗原受容体および治療用抗体によって増強されるNK細胞毒性の定量化:生細胞イメージングおよびフローサイトメトリー

サマリー

このプロトコルは、生細胞イメージングとフローサイトメトリーを用いて、ヒトの自然なキメラ抗原受容体介在および抗体依存性細胞毒性を一貫して測定するための標準化された in vitro. ワークフローを提供します。

要約

ナチュラルキラー(NK)細胞は、多様な細胞内病原体やがんに対する保護免疫に重要な役割を果たす自然リンパ球です。主な機能は、感染、悪性形質転換、または抗体によって被覆された標的細胞を抗体依存性細胞毒性(ADCC)によって殺すことです。NK細胞はまた、特定の抗原を標的的に認識できるキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝子操作されることもあります。NK細胞毒性の定量的測定は、ベースライン機能の評価やモノクローナル抗体の前臨床評価、CAR工学戦略に不可欠です。しかし、in vitroの機能アッセイは細胞準備、標的細胞、エフェクター対標的比率、共培養時間、読み取り方法の違いにより、実験室ごとに大きなばらつきがあり、再現性やクロススタディ比較に制限があります。本記事では、フローサイトメトリーおよびリアルタイムのライブセルイメージングを用いて、NK細胞毒性の定量的評価のための標準化されたプロトコルを提示します。ヒトの一次NK細胞およびCAR発現性NK-92細胞は、96ウェルプレート形式でがん細胞および抗体被覆標的細胞を殺す能力を評価し、自然細胞毒性、CAR媒介殺菌、ADCCを測定しました。標的細胞の生存率は、ライブセルイメージングを用いて連続的に測定するか、フローサイトメトリーによって定められた時間点で測定され、これによりNK細胞および標的細胞の表現型特性解析も可能となりました。これらのプロトコルは、日常的な組織培養、イメージング、フローサイトメトリー手法を用いて、自然免疫およびNK細胞ベースの免疫療法の研究において、NK細胞エフェクター機能の再現性的な定量化を可能にする堅牢な枠組みを提供します。

概要

ナチュラルキラー(NK)細胞は、ウイルス感染や悪性細胞に対する免疫監視において中心的な役割を果たす自然リンパ球であり、迅速かつ強力な細胞毒性^{を示します。}B細胞やT細胞とは異なり、NK細胞は抗原特異的受容体を発現せず、主要な組織適合性の喪失、複合体クラスI発現、細胞ストレスの喪失を検出するために、活性化および抑制性の受容体群に依存しています。これにより、パーフォリンやグランツァイムを含む細胞毒性顆粒を放出したり、場合によっては死受容体^1,2,3,4を活性化することで直接的な細胞毒性を媒介することが可能になります。自然な細胞傷害に加え、NK細胞は免疫グロブリンG(IgG)のFc部分を認識し、IgG被覆標^{的細胞に対する}抗体依存性細胞傷害(ADCC)を媒介する受容体FcγRIII(CD16)を発現します^5,6。

その内在性細胞毒性機構と良好な安全性プロファイルにより、NK細胞は細胞免疫療法の有望な候補として浮上しています。同種使用の可能性により、NK細胞は移植片対宿主病のリスクを最小限に抑えた「既製品」療法として機能し、より広範な臨床応用とコスト削減を可能にします⁷。最近の進展により、遺伝子工学的手法を通じてNK細胞の治療的可能性がさらに拡大されており、キメラ抗原受容体(CAR)の導入により、NK細胞が特定の腫瘍抗原を認識するようにリダイレクトされています。CAR-NK細胞は、in vivoの異種移植モデルおよび臨床試験において抗腫瘍効果を示しており、CAR-T^細胞と比べて毒性が低減^{しています。}そのため、改造されたNK細胞プラットフォームや抗体ベースの治療戦略の開発への関心が高まっています。この文脈では、NK細胞殺菌能力の正確かつ定量的な測定は、NK細胞の生物学の理解、CARや他の設計されたNK細胞療法の有効性評価、ADCCに依存するモノクローナル抗体の評価に不可欠です。

さまざまなin vitroアッセイが、NK細胞傷害を評価するために多くの研究室で広く用いられています。一般的な方法には、放射性クロム51放出アッセイ、乳酸脱水素放出アッセイ、カルセイン–アセトキシメチル放出アッセイ^11,12があります。これらの従来の方法は細胞毒性の測定に広く用いられてきましたが、間接的な細胞死の読み取りに依存し、運動学的データではなくエンドポイント測定を提供し、感度やダイナミックレンジも限られています。また、エフェクター細胞の表現型や活性化状態に関する情報も提供しません。近年では、標的細胞生存の直接的な定量化、時間経過による殺菌のモニタリング、エフェクター細胞と標的細胞の同時表現型解析を可能にすることから、ライブセルイメージングプラットフォームやフローサイトメトリーがますます採用されています^13,14。しかし、これらの新しいアプローチの中でも、標的細胞調製、エフェクター対標的(E:T)比、共潜伏時間の違いなど、研究室や発表された研究間で大きなばらつきが存在し、特にNK細胞ベースの免疫療法の前臨床評価において再現性や交差比較が制限されています。

本稿では、NK細胞毒性の定量的評価のための標準化されたワークフローを提示します。これは、リアルタイムの生細胞画像診断(IncuCyte SX5)とフローサイトメトリーベースのエンドポイントアッセイという、独立した補完プラットフォームの2つのプラットフォームです。生細胞イメージングは、エフェクター細胞との共培養中の標的細胞生存を継続的にモニタリングし、複数のE:T比および実験条件下で細胞毒性の動態的評価を最小限のアッセイ操作で可能に^します。これに対し、フローサイトメトリーは標的細胞死の高感度なエンドポイント測定を提供し、マルチマーカー染色パネルを用いてNK細胞と標的細胞の同時表現型特性解析を行います。

さらに、このプロトコルにはE:T比、培養条件、プレートフォーマット、分析ワークフローなどの標準化された実験パラメータが組み込まれており、再現性を高め、検査室や研究間での細胞毒性測定の比較を容易にしています。このワークフローは、自然細胞傷害、CAR媒介殺菌、ADCCを含む複数のNKエフェクター機能の定量的評価を可能にし、ヒトNK一次細胞およびNK細胞株と互換性があります。このプロトコルは、NK細胞生物学の研究およびNK細胞ベースの免疫療法開発の前臨床評価のための実践的な枠組みを提供します。

プロトコル

研究におけるヒトドナーサンプルの使用は、機関審査委員会の承認を受け、機関ガイドラインに従って実施されました(承認 #2022P000699)。

1. リアルタイムのライブセルイメージング殺菌アッセイ

1. コートプレート
   1. 6 × 10 グリッドの平底96ウェルプレートに、50 μL/ウェルのポリ-D-リジン(リン酸緩衝生理食塩水[PBS]で0.1 mg/mL)を加えます。各井戸の底が完全に覆われているか確認するために、プレートを優しく振ってください。
   2. 蓋をしたまま室温(RT;18°C–26°C)で2時間培養します。
   3. 300 μL/wellのPBSで3×ウェルを洗浄し、上清液を捨てます。
      注:コーティングされたプレートはパラフィルムで密封し、4°Cで最大1週間保存でき、各ウェルに200μLのPBSを追加します。プレートは滅菌状態を保ち、PBSは廃棄し、使用前にRTと平衡させるようにしてください。
2. ターゲットセルを準備
   1. SYTOXオレンジ(200 nM)を15 mLの円錐形遠心分離機管内でNK-92培地に希釈し(250 μMをDMSO中に溶かして)、2× SYTOXオレンジ(200 nM)10 mLを調製します(総体積10 mLに8 μLのストックを加えます)。
      注:NK-92細胞の培養培地は、Advanced RPMI-1640培地、10%胎児用牛血清(FBS)、2 mM L-アラニル-L-グルタミン、100 μg/mLプリモシン、500 U/mLヒトIL-2で構成されています。
      注意:SYTOXオレンジは蛍光色素であり、皮膚や目の曝露にリスクをもたらす可能性があります。適切な個人用防護具を着用し、機関の安全ガイドラインに従って取り扱ってください。
   2. 標的細胞のカウントは、色素排除ベースの細胞計数法(例:トリパンブルー)または同等の検証済み方法(例:自動細胞カウンター)を用いて行われます。
      注:このアッセイでは、標的細胞はラモス細胞であり、これはB細胞成熟抗原発現(BCMA⁺)B細胞リンパ腫細胞株であり、近赤外線(NIR)蛍光タンパク質emiRFP670を発現させるために設計しました。
   3. 必要な量を15mLの円錐底遠心分離機チューブに移します。
   4. 遠心分離機(5分、300 × g、RT、加速度=最大;減速[ブレーキ]=最大)。
   5. 上清液は捨てる。
   6. 標的細胞を最終濃度2.5 ×^{10 5} cells/mL(2.5 ×^{10 4} cell/100 μL)に再懸濁し、2× SYTOXオレンジ培地に置きます。
      注意:再懸濁標的細胞は、エフェクターセル希釈を準備する間、チューブ内に5%のCO₂を含んだ37°Cで最大30分間維持できます。
      注:1枚の満タンプレートの場合、60ウェル×2.5 ×10⁴ セル/ウェル=1.5 ×合計⁶ セル。損失を考慮して2.0×10個⁶ セルを準備してください。アッセイサイズや希望するシーディング密度に基づいてセル数を調整します。
3. エフェクターセルを準備する
   1. 色素排除ベースの細胞計数法(例:トリパンブルー)または同等の検証済み方法を用いてNK-92細胞の濃度と生存可能性を評価します。生存可能性が≥80%の場合のみ進行してください。生存可能性が低いとアッセイ性能に影響を与える可能性があります。
      注:蛍光タンパク質ZsGreenを安定的に発現させるために設計されたNK-92細胞を、単独(対照群)またはBCMA標的CAR構造物と組み合わせてエフェクター細胞として使用しました。
   2. 必要な細胞数を数え、個別の15mL円錐形遠心分離機チューブに移送します。
      注:1回の複製に必要なエフェクターセルの総数は、すべてのE:T比で必要な細胞数を合計し、複製数を掛けて細胞損失を考慮した50%余剰分を加えて計算します。準備を円滑にするために必要に応じて丸い番号を付けます。例えば、E:T比が2:1から0.25:1の範囲の場合、1回のレプリケートごとに1.5×10個^の5NKセルを使用します。三重化については、補足図1Aに記載されたプレートレイアウトに基づき、各条件あたり4.5個×10個⁵セルを準備します。
   3. 遠心分離機セル(5分、300 × g、RT、加速度=最大;減速[ブレーキ]=最大)。
   4. 上清液は捨てる。
   5. 細胞を最終濃度5.0×10⁵ cells/mL(5.0 ×¹⁰ 4 cells/100 μL)まで再懸濁します。
4. エフェクターセル希釈を準備する
   1. エフェクターセル希釈を、標的のみの対照を含む円底96ウェルプレートで準備します(補 足図1A は、4つの条件を三重にまとめた代表的なプレートレイアウトを参照)。各条件は三重に準備されます。
   2. E:T比2:1に対応するウェルに、240μL/ウェル(5.0 ×^{10 μL} /mL)のエフェクターセルを加えます。
   3. 残りのすべてのウェルに120μL/ウェルの培地を加えます。
   4. E:T = 2:1 ウェルから E:T = 0.25:1 ウェルまでの2重連続希釈を行います。ピペッティングで十分に混ぜて≥5回、移すたびにチップを交換してください。
      注意:画像診断システムで画像診断が予定されていない場合は、共培養を設定する前にスケジュールしてください。準備済みのエフェクターセル希釈は、37°Cで5%CO₂を含み、丸底96ウェルプレートで最大30分間維持し、生細胞イメージングシステムをセットアップします。
5. 共文化の設立
   1. ポリDリジンコーティングされた平底96ウェルプレートを入手します。
   2. すべてのウェルに100μL/ウェルのターゲットセル懸濁液を加えます。適切なピペット(例:200 μL)を使って、適切なピペットで上下≥5回ピペットを行い、標的細胞を十分に再懸濁し、移送中に気泡の発生を避けてください。
   3. 対応するウェルに100μL/ウェルのエフェクター-セル懸濁液を加えます。適切なピペット(例:200 μL)でピペットを上下に5回≥ピペットし、エフェクターセルを十分に再懸濁し、移送中の気泡形成を防ぎます。
   4. 周囲の未使用井戸に200μL/ウェルのPBSを加えます。
   5. 板を遠心分離(2分、100× g、RT、加速度=低[例:2];減速[ブレーキ]=低[例:2])。
      注:このソフトスピンは、IncuCyte SX5で正確な画像撮影のために、ウェル底部に細胞を迅速かつ均等に沈降させるために不可欠です。私たちはスイングバケットローター対応のベンチトップEppendorf Centrifuge 5810Rを使用し、加速・減速設定は9段階中2に設定されています。
   6. プレートをライブセルイメージングシステムに入れ、24時間(必要に応じて最大72時間まで延長可能)に1時間ごとに画像を取得します。標準的なインキュベーション条件下(37°C/5% CO₂)で画像検査を行うことを必ず確認してください。
      注: t = 0時間での画像がベースラインターゲット細胞数を正確に反映するように、共培養セットアップおよび遠心分離後10〜15分以内に画像取得を開始してください。3つのイメージングチャンネル(緑、オレンジ、近近紅外)を持つフルプレートの場合、20×倍率で3枚の画像を1枚ずつ撮影する際、スキャン時間は約1時間あたり10分です。
   7. 最初のスキャン後に画質を確認し、必要に応じて設定を調整してください。
6. 計器設定
   1. スペクトルアンミクシングを設定して、SYTOXオレンジの緑チャンネルへの蛍光スピルオーバーを補正します。ソフトウェア内で緑とオレンジのチャンネルを比較してアンミキシング値を調整し、Orange⁺ のデッドセルが誤ってGreen⁺として検出されていないか確認してください。代表的な実験(図1)では、オレンジチャネルが緑のチャネルに寄与する割合は8.5%に設定されていました。これらの値はデータセットごとに異なり、各実験ごとに最適化されるべきです。
   2. 各視野内のすべてのセルの正確なセグメンテーションとマスキングを確保するために、非準拠型のセルバイセル解析を設定してください(代表的なセットアップは 補足図1B を参照)。懸濁エフェクターモデルおよびターゲット細胞株モデルを用いた生細胞イメージングシステムには、以下のパラメータが推奨されます。
      1. 期待される物体の直径を15μm(おおよそのセル径)に設定します。
      2. 閾値感度とテクスチャ感度を5に設定してください。
      3. 細胞クラスターの分離を容易にするためにエッジ感度を10に設定してください。
      4. 許される物体面積のフィルター範囲を50〜2000μm^² に設定し、破片や大型物体を除外します。
      5. 非細胞対象を除外するために離心率の最大値を0.95に設定してください。
   3. 分類しきい値を設定します(代表的なゲーティングについては 補足図1C を参照)。標的のみコントロールウェルを用いて、NIR⁺/Orange⁻ の生標的細胞集団の基準値を定義します。その後、後期の時点(例: t = 4h)に共培養ウェルを用いて、NIR⁺/⁻ とOrange⁺/⁻ の集団間の重複が最小限で明確な分離を確認します。分類閾値および解析パラメータの例は 補足図1Cに示されています。
      1. オレンジの強度閾値をおおよそ15に設定してください。
      2. 近距離紅外強度の閾値を約0.1に設定してください。
         注意:パラメータおよび閾値は、機器、ソフトウェア、細胞株モデル、蛍光信号強度によって異なる場合があります。
         注:このプロトコルは、標的細胞が安定的にNIR蛍光を発現する場合(例:emiRFP670)場合、一次ヒトNK細胞毒性やADCCアッセイに適応可能です。また、ポリDリジンコーティングを省略し、平底または丸底の96ウェルプレートを使用することで、フローサイトメトリーを用いた殺害アッセイにも適応可能です。

図1。リアルタイム生細胞イメージングを用いて、キメラ抗原受容体(CAR)NK-92細胞介在細胞傷害の動態と有効性を定量化すること。(A) NK細胞介分細胞毒性のモニタリングのためのIncuCyte生細胞イメージングアッセイの概略概要。emiRFP670(近赤外線[NIR]チャネル)を発現するBCMA⁺ラモス標的細胞は、ZsGreen(緑チャネル)を発現するNK-92エフェクター細胞と共培養し、細胞死はSYTOX Orange(オレンジチャネル)を用いて検出されます (B) 12時間時点のエフェクター対ターゲット(E:T)比1:1での共培養井戸の代表的な蛍光画像。生標的細胞(emiRFP670⁺)は青、NK-92エフェクター細胞(ZsGreen⁺)は緑、死んだ細胞(SYTOX Orange⁺)は赤で示されています。画像は非接着型のCell-by-Cell分析モジュールを用いて20×倍率で取得されました。スケールバー=100μm (C) 対照およびCAR発現型NK-92細胞の標的細胞増殖および生存率を異なるE:T比で定量化すること (D) 複数の時点(4、8、16、24時間)におけるE:T比の関数としての標的細胞生存の定量化。ターゲットセルカウントは各時刻でターゲットのみのウェル(E:T = 0:1)に正規化されました (E) 細胞毒性を評価するための定量指標の概略的表現:KR₅₀、12時間で50%殺菌を達成するために必要なキラー対標的比;KT₅₀、E:T比1:1で50%の殺傷を達成するのに必要な時間;およびIKI₅₀は、50%生存等価線以下のヒートマップ面積として定義されます (F) 各エフェクター条件におけるE:T比および時間の関数としてのターゲット細胞の成長と生存を示すヒートマップ。KR₅₀、KT₅₀、IKI₅₀の定量値が各条件ごとに示されています。生の標的細胞数は、IncuCyte 2021Cソフトウェアの細胞別分類解析を用いて、ゲート付きNIR⁺/SYTOX Orange^–集団から取得されました。すべての条件は三重に実施されました(n = 3)。データは平均±標準偏差として提示されます。非線形回帰分析を用いてパネルDおよびFの細胞毒性傾向をモデル化しました。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

2. フローサイトメトリーによる抗体依存性細胞毒性の定量化

1. 一次ヒトNK細胞を製備します
   注:一次ヒトNK細胞は、^前述のNK細胞濃縮法と密度勾配遠心分離を用いて、健康な成人ドナーから得られた白血球豊富末梢血から分離されました。精製されたNK細胞は、5 ×⁶ mL/mLの冷凍溶液(90% FBSおよび10% ジメチルスルホキシド[DMSO])で0.5mLのアリコートとしてクライオ保存され、−150°C未満で3^{回使用される}まで保存されました。
   1. 5個×10個^6個の 一次ヒトNK細胞を含むバイアルを、37°Cの水浴で約1分間優しく攪拌し、小さな氷結晶だけが残るまで解凍します。
      注意:すべての人体由来サンプルは、適切なバイオセーフティ手順と個人用保護具を用いて機関のガイドラインに従って取り扱ってください。
      注意:DMSOは皮膚の化学物質吸収を促進します。適切な防護具を着用し、直接の接触を避けてください。
   2. 解凍した細胞を15mLの円錐底遠心分離機チューブに移し、10mLの予温(37°C)NK細胞培養培地を含み、優しく渦巻きながら混合します。
      注:NK細胞培養培地は、Advanced RPMI-1640に10% FBS、10%ヒトAB血清、2 mM L-アラニル-L-グルタミン、100 μg/mL プリモシン、50 U/mL ヒト IL-2 を補足したものです。
   3. 遠心分離機セル(5分、300 × g、RT、加速度=最大;減速[ブレーキ]=最大)。
   4. 上清液は捨てる。
   5. ペレットを予備加熱(37°C)のNK細胞培地5mLに再懸浮させます。
   6. 遠心分離機セル(5分、300 × g、RT、加速度=最大;減速[ブレーキ]=最大)。
   7. 上清液は捨てる。
   8. ペレットを1mLの予温されたNK細胞培養培地に再懸浮させます。
   9. 懸濁液を24ウェルの組織培養プレートの1つのウェルに移します。
   10. 蒸発を最小限に抑えるために、周囲の井戸に1mLの無菌PBSを加えます。
   11. 24ウェルプレートを45°角で(プレートラックまたは支持材を用いて角度を保ち)、37°Cで5%のCO₂で16〜24時間キュベートし、NKセルの回復を促します。
       注:一次ヒトNK細胞は最大の生存と回復のために密接な細胞間接触が必要であり、これは24ウェルプレートを傾けてウェルの縁に蓄積させることで達成できます。実験ごとに一貫した孵育時間を維持しましょう。
       注:回復期間終了後は、直接標的細胞の調製および共培養のセットアップに進みます。
2. カルボキシフルオレセイン・スクシニミジルエステル(CFSE)を標的細胞染色。
   1. 5個×10個^の5 標的細胞を取得し、15mLの円錐形底遠心分離機チューブに移します。
      注:標^{的細胞として}患者由来のリンパ腫細胞株をCD38⁺を使用しました。
   2. 細胞を10mLのPBSで一度洗浄します。
   3. 遠心分離機セル(5分、300 × g、RT、加速度=最大;減速[ブレーキ]=最大)。
   4. 5 mMのストック溶液を用いて、15 mLの円錐底遠心分離機管で10 mLのPBSに希釈し、PBS中の0.5 μM作動液を製製します。
      注意:CFSEは反応性アミン結合蛍光染料であり、皮膚や目の曝露にリスクをもたらす可能性があります。適切な個人用防護具を着用し、未使用試薬は地域のバイオセーフティガイドラインに従って処分してください。
   5. 上清液は捨てる。
   6. CFSE溶液中に約1×^{10 6} Cell/mLでペレットを再懸浮させます。
   7. 37°Cで15分間培養し、アルミホイルで包むか光から守るために不透明な容器に入れてください。
   8. 5〜10個の培養液を加えて反応を消滅します。
   9. 37°Cで5分間培養します。
   10. 遠心分離機セル(5分、300 × g、RT、加速度=最大;減速[ブレーキ]=最大)。
   11. 上清液は捨てる。
   12. 細胞を2.5 × 10⁵ cells/mLで再懸濁し、100 μLに2.5 ×^{10 4} 細胞を含むようにします。
       注意:CFSEシグナル強度とターゲット細胞の生存率を一貫させるために、直接プレートを施してください。
3. プレートターゲット細胞
   1. 丸底の96ウェルプレートを取得します。
   2. マルチチャネルピペットを用いて、指定されたウェルにターゲットセル100 μL(2.5 ×⁵ mL/mL)を追加します(補 足図2参照)。各状態は三重にメッキされています。
      注意:メッキする前に細胞の懸濁液が均一であることを確認してください。
4. 準備して抗体を加えます
   1. 各検査抗体およびマッチしたアイソタイプ対照群に対して、NK細胞培養培地で4×抗体溶液(100 μg/mL)200 μLを準備します。
      注:このステップはモジュール式であり、選定された標的細胞株に対してADCCを媒介する抗体に適応可能です。抗体ストックの濃度や製剤は異なる場合があります。希釈量を適切に調整してください。アジドなどの防腐剤は標的細胞の生存率やNK細胞の機能に影響を与える可能性があります。抗体濃度の範囲を検査できますが、ここでは最終的な濃度25 μg/mLを基準としています。
   2. 抗体溶液を深いウェルプレートに移します。
   3. 標的細胞に抗体溶液50 μL/ウェルを加え、ピペッティング≥5回ピペットで十分に混合します。
   4. 無抗体対照ウェルにNK細胞培地50μL/ウェルを加え、ピペッティングで≥5回ピペットで十分に混合します。
   5. 37°Cで5%のCO₂を含んで25〜30分間培養します。
5. NK細胞を準備して追加してください
   1. 色素排除ベースの細胞計数法(例:トリパンブルー)または同等の検証済み方法を用いて、2個×10個の⁵ NK細胞を数えて取得します。この数は、三重にプレートされたNK細胞を含む状態を3つ分に十分で、ピペッティング損失を考慮した余分を含みます(補 足図2参照)。生存可能性が≥75%の場合は、アッセイ性能に影響を与える可能性があるため、進行してください。
   2. 細胞を1次培養培地800 μL(最終濃度=1.25 ×^{10 4} 細胞/50 μL)で2.5 ×^{10 5} μmLに再懸濁します。
   3. 対応するウェルに50μL/ウェルのNKセルを加え、ピペッティングで十分に混合≥5回します。
      注意:メッキする前に細胞の懸濁液が均一であることを確認してください。
   4. ウェルごとに培地50μLを加えてウェルを制御し、ピペッティング≥5回ピペットで十分に混合します。
6. 最終的な共文化の設立
   1. 丸底の96ウェルプレートを注意深く検査し、すべてのウェルに均一なメニスカスレベルかつ気泡がない200μLが含まれていることを確認します。
   2. 板を遠心分離(2分、100 × g、加速度=低[例:2]、減速[ブレーキ]=低[例:2])。
      注:このソフトスピンは細胞の沈降を迅速にし、細胞間の接触を増やすために重要です。私たちはスイングバケットローター対応のベンチトップEppendorf Centrifuge 5810Rを使用し、加速・減速設定は9段階中2に設定されています。
   3. 37°Cで5%のCO₂で16〜18時間(一晩)孵卵します。
      注:このインキュベーション期間は脱顆粒ではなく細胞毒性の読み取りに最適化されており、脱顆粒反応はCD107a発現を早期の時点(2〜6時間)に測定することで最適です。そのため、脱顆粒反応のピークは過小評価されることがあります。
      注意:長時間の共培養は対照ウェルで標的細胞死が過剰になり、実験条件間の動域が低下する可能性があるため、18時間を超えて潜伏を延長しないでください。
7. フローサイトメトリーの実施
   1. 遠心分離機(5分、300 × g、加速度=最大;減速[ブレーキ]=最大)。
   2. 上清液は捨てる。
   3. すべてのウェルは200μL/ウェルのFACSバッファー(2% FBS、2 mM EDTA PBS)で洗浄します。
   4. FACSバッファーで表面抗体マスターミックスを準備します。CD56-BV421を1:50希釈、CD16-BV785を1:50希釈、CD107a-PE-Cy7を1:25希釈で加えて作製します。
      注意:実験板設計に基づく総マスターミックス容積(ウェル数×50 μL/ウェル+20%余剰)を計算してください。抗体クローンは染色強度やエピトープの利用可能性に異なりがあります。代表的なデータで使用されたクローンは材料表に記載されており、代替クローンは滴定が必要な場合があります。NK細胞のサブセット表現型(例:KIRs、NKG2A/C/D、CD57)や活性化マーカー(例:CD69、HLA-DR)に対しても追加の抗体を含めることがあります。
   5. 抗体マスターミックスの50μL/ウェルに細胞を再懸濁し、ピペッティングで十分に混合≥5回。
   6. 4°Cで15分間培養し、アルミホイルで包むか、光から守るために不透明な容器に入れます。
   7. FACSバッファーを150μL/ウェルに加えます。
   8. 遠心分離機(5分、300× g、加速度=最大;減速[ブレーキ]=最大)。
   9. 上清液は捨てる。
   10. 細胞をFACSバッファー内の5 μM 4′6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)100 μL/ウェルに再懸濁させ、直ちにフローサイトメトリー取得に進みます。事前インキュベーションは必要ありません。
   11. フローサイトメトリーでデータを取得し、CFSE、BV421、BV785、PE-Cy7、DAPIおよびその他の蛍光色素の蛍光チャネルを記録します。
       注意:検出器電圧、補償、ゲーティングなどの取得設定は最適化が必要な場合があります。補償とゲート設置には、補正ビーズや代表的なセルを用いて、染色なしおよび単染色のコントロールを用いてください。連続的または暗い発現(例:CD107a)のマーカーには、蛍光マイナス1対照を検討すべきです。実験全体で、ライブ/デッドゲーティングやターゲットおよびエフェクター集団の同定を含む一貫した設定とゲーティング戦略を維持します。
       注意: ステップ1 と ステップ2 の両方は、付着型ターゲット細胞に適応可能です。共培養の前日に、共培養の1日前にフラットボトムの96ウェルプレートで、アッセイ当日に約70%の合流率を達成する密度で、それぞれの培養培地とともに種子標的細胞を標的します。準拠を確認した後、標的細胞培地を廃棄し、100μLの新しいNK細胞培地に置き換え、その後エフェクター細胞を追加して共培養を開始します。細胞サイズや形態の違いから、IncuCyteの細胞ごとの解析パラメータは各接着細胞株ごとに最適化されるべきです。
       注意:フローサイトメトリーを用いた付着細胞を用いたアッセイでは、共培養後にプレート(300 × g、5分)を遠心分離し、上清液を廃棄してください。トリップLEを100μL/ウェルに加え、37°Cで5%_CO2 と約5〜15分間(細胞株によります)インキュベートして細胞を剥離します。FACSバッファーを100μL/ウェルに加え、円を描くように上下にピペットで混合し、すべてのセルを丸底の96ウェルプレートに移します。染色を進める前に、ウェルを顕微鏡で検査し、完全に剥離されていることを確認します(ステップ2、サブステップ7)。TrypLEの培養時間を必要に応じて最適化し、単一細胞懸濁を実現します。

結果

NK細胞細胞毒性をリアルタイムで定量化するため、抗BCMA CARを発現させるように設計されたNK-92エフェクター細胞を、黒色透明な平底96ウェルプレートで^BCMA+ ラモス標的細胞と共培養し、ライブセルイメージングでモニタリングしました(図1A および 補足図1A)。エフェクターセルは、E:T比0:1(ターゲットのみ)、0.25:1、0.5:1、1:1、2:1で、各条件を三重に行って追加しました。3つの異なるCAR NK-92構成要素が評価されました:共刺激ドメインなしのCAR1、4-1BB(CD137)共刺激ドメインのCAR2、DAP10共刺激ドメインのCAR3、そしてZsGreenのみのベクターを発現する対照細胞のNK-92細胞です。すべてのエフェクター細胞は、前述の通りレンチウイルストランスデュクションによって生成されました。⁴ はZsGreen-P2A-CARトランスジーンカセットを用いて記述されています。ラモス標的細胞も同様にemiRFP670をコードするレンチウイルスベクターで転換されました。標的細胞の増殖と生存率は、生細胞イメージング機器を用いて24時間ごとに追跡され、ZsGreen⁺ NK-92細胞の緑色蛍光、SYTOX Orange⁺ 死細胞のオレンジ蛍光、emiRFP670⁺ 標的細胞の近近紅外蛍光を測定しました(図1A および 補足図1B および 1C)。

顕微鏡画像は、共同培養中にエフェクター細胞、生きた標的細胞、死細胞を可視化するために一定の時間間隔で取得されました(図1B)。標的細胞の増殖と生存率の定量化により、CAR2およびCAR3のNK-92細胞は特に初期の時点でE:T比1:1でCAR1 NK-92細胞よりも殺菌速度が速いことが示されました。標的細胞殺菌はE:T比が高いほど増加し、対照群では自然な細胞毒性を示したNK-92細胞も含まれます(図1C)。これらの測定は、生細胞イメージングが細胞毒性活性の動的変化を捉える能力を示しています。標的細胞生存率も特定時点におけるE:T比の関数として解析し、CAR NK-92の効力を比較しました。CAR2およびCAR3 NK-92細胞は、後の時点(例:E:T = 0.25:1、24時間時)および中間のE:T比(例:E:T = 1:1)でより高い高能を示しました(図1D)。解析結果では、CAR2およびCAR3 NK-92効果細胞間で殺菌率に有意な差は認められませんでした。

E:T比、共培養時間、標的細胞生存を統合したヒートマップは、すべてのエフェクター集団における自然およびCAR介在性細胞毒性を包括的に可視化し、定量的な評価を可能にします。効力と動力学を定量化するために3つのパラメータが定義されました:KR₅₀(殺菌剤と標的の比率で、12時間で50%の殺菌率)、KT₅₀は共孵化時間で50%の殺菌(E:T比1:1)を達成するために必要な時間です。そしてIKI₅₀は、50%生存率以下のヒートマップ領域を表す統合キラー指数で、50%生存等高線で定義されます(図1E)。これらの指標により、CAR NK-92細胞の効力(KR₅₀)、殺菌動力学(KT₅₀)、統合細胞毒性性能(IKI₅₀)の比較が可能です(図1F)。この分析は、単一実験内で複数のパラメータにわたって設計されたNKセルプラットフォームを定量的に比較できることを示しています。

フローサイトメトリーと細胞計数を用いて、治療用抗体の有無にかかわらず、蛍光標識標的細胞を一次ヒトNK細胞と共培養し、16〜18時間の培養後に残存する生標的細胞集団を定量することでADCCを測定しました(図2A)。Cytek Aurora、BD Symphony、BD Fortessaなどのフローサイトメーターとハイスループットサンプラーを組み合わせて使用できます。代表的なセットアップ(補足図2)では、CD38⁺ 患者由来のリンパ腫標的細胞を丸底96ウェルプレートにプレートし、適切なウェルにダラツムマブ(またはアイソタイプ抗体)を追加しました。その後、NK細胞はE:T比0.5:1で共培養され、この比率は自然死を最小限に抑えつつADCC検出を可能にするために最適化されました。インキュベーション後、フローサイトメトリーが行われ、細胞集団を前方および側散乱で分離し、DAPIを用いた生存不可能な事象を除外し、CFSE⁺ 標的細胞をCD56⁺CD16⁺ NK細胞から分離して並行解析しました(図2B)。この設計により、細胞毒性の測定と表現型の特徴付けを同時に行うことが可能となります。

図2。フローサイトメトリーを用いた抗体依存性細胞毒性(ADCC)アッセイにより、標的細胞生存とNK細胞活性化を同時に定量できます。(A) ADCCアッセイの概観図。CFSE標的CD38⁺リンパ腫標的細胞は、1ウェルあたり2.5個×10個⁴細胞でプレートされ、5つの条件下で培養されました:標的細胞単独;ダラツムマブ(25 μg/mL)を標的細胞に投与;標的細胞はNK細胞(E:T = 0.5:1);標的細胞にはNK細胞とダラツムマブが使われています。そしてNK細胞とアイソタイプコントロール抗体(25 μg/mL)を標的とする細胞です (B) 代表的なフローサイトメトリーゲーティング戦略。イベントはまず前方散乱と側散乱によってゲートされ、その後DAPIを用いて生存性のない細胞を除外しました。標的細胞はCFSE⁺イベントとして、NK細胞はCD56⁺およびCD16⁺イベントとして同定されました。NK細胞の脱顆粒化はCD107a発現によって評価されました (C) 標的細胞生存率の定量化(標的のみコントロール条件(100%)に対するパーセンテージで表す (D) NK細胞脱顆粒の定量化(NK細胞集団内のCD107a⁺細胞の割合で示す)。バーは平均±標準偏差を表し、重ねられた点は個々の複製井戸(n = 3)を表します。統計解析はTukeyの事後多重比較検定を用いた分散の一方向解析を用いて実施されました。統計的有意性は以下の通りです:*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

主要評価項目は、生体内のCFSE⁺ ゲート内で計算され、標的のみの状態に正規化され、100%生存率に設定された標的細胞生存です。この正規化により、自発的な標的細胞の損失を制御し、条件間の直接比較が可能になります。代表的なデータ(図2C)では、ダラツムマブ単独の添加は標的細胞の生存を減少させず、エフェクター細胞がない場合に抗体が標的細胞の生存率に直接影響を与えないことを確認しました。NK細胞との共培養は標的細胞生存率を約70%に低下させ、ベースラインの自然細胞毒性を示しました。ダラツムマブの追加はさらに生存率を約37%に低下させ、抗体介在による殺死の強化と一致しました。一方、アイソタイプコントロール条件では約62%の生存率が示され、NK単独の状態と同等でした。成功した実験では、抗体処理済みと対照群の両側で明確な分離が認められ、複製体間で高い再現性があることが示されました。

NK細胞の二次表現型解析は、標的細胞殺菌とエフェクター活性化の関連を補完的に確認します。CD107a⁺ NK細胞の割合で測定されるNK細胞脱顆粒化は、抗体なしのNK細胞・標的細胞共培養で最も低く、ダラトゥムマブ処理条件下で最も高く(約31%)、アイソタイプ対照では中間脱顆粒(約19%)が見られ、抗体介在の活性化を支持しています(図2D)).これらの結果は、アッセイが標的細胞殺害とエフェクター活性化を区別できることを示しています。脱顆粒化と生存傾向は概ね一致していますが、完全に重なるわけではなく、関連しつつも異なる生物学的プロセスを表していることを示しています。

最適でない実験では、条件間の分離の低下、ウェル間で細胞数のばらつき、対照ウェルで標的細胞死が多いこと、CFSE染色の弱さ、背景脱顆粒の増加が一般的に示されます。これらの結果は、標的細胞の生存能力の低下、NK細胞の回復不均一、混合不全、染色や獲得の変動などが原因となる可能性があります。このアッセイは標的およびエフェクターの区画を独立して同定するため、標的細胞の追加表現型(例:抗原密度やリガンド発現)やより広範なNK細胞の特徴解析も拡張可能です。「NKのみ」の状態を含めることで、ベースライン脱顆粒やNK細胞の生存率をさらに定量化できます。この多パラメータ設計は、機能的細胞毒性を機構的な免疫表現型と並行して解釈できる重要な利点です。

補足図1。 生細胞イメージング細胞毒性アッセイの代表的なプレートレイアウトおよび解析ワークフロー。(A) CAR NKセル殺害アッセイの代表的な96ウェルプレートレイアウト。4つのエフェクターセル条件が四分円に分けられ、それぞれ0:1(ターゲットのみコントロール)、0.25:1、0.5:1、1:1、2:1のE:T比で試験され、各条件は三重(合計60アッセイウェル)で実施されます。(B) IncuCyte 2021Cソフトウェアにおける非準拠細胞別解析の代表的な構成。個々のエフェクターおよびターゲット細胞を識別し、破片や集合体を除外したスペクトルアンミクシング、セグメント、マスキングパラメータを示した。(C) NIR対SYTOXオレンジ蛍光を用いた代表的な細胞ごとの分類ゲーティング戦略で、生きた標的細胞集団を定義する。標的のみのウェルや、例えば時点(t = 4h)での共培養ウェルが、生細胞群と死細胞群の分離を確認するために用いられます。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図2。 フローサイトメトリーを用いたADCCアッセイの代表的なプレートレイアウト。代表的な96ウェルプレートレイアウト。B–D行および2–6列に三重にプレートされた5つの実験条件を示している(合計アッセイウェル=15):(1) 標的のみ対照群、(2) ダラツムマブを用いた標的細胞、(3) NK細胞を用いた標的細胞、(4) NK細胞とダラツムマブを用いた標的細胞、(5) NK細胞とアイソタイプ対照抗体を用いた標的細胞。ターゲットセルは1ウェルあたり2.5 × 10⁴ セルでプレートされ、NKセルは1.25 × 10⁴ セルで追加され、E:T比0.5:1に達成されました。抗体は最終濃度25 μg/mLで使用されました。周囲の井戸は蒸発を最小限に抑えるためにPBSで満たされていました。標的のみの状態は標的細胞生存率の正規化に用いられ、アイソタイプコントロールは抗原特異性に依存しない抗体製剤効果を考慮しました。標的細胞株の感受性に応じてE:T比の最適化が必要になる場合があります。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

これらのプロトコルは、標準化された96ウェルプレート形式でNK細胞細胞毒性を定量化するための2つの補完的なアプローチを提供します。 ステップ1 はリアルタイムのライブセルイメージングを用いて標的細胞の喪失を継続的に監視し、複数のE:T比における自然およびCAR介在の殺菌の動態を評価するのに適しています。 ステップ2 では、フローサイトメトリーを用いて定められた共潜伏期間後にADCCを定量しつつ、同時にターゲット区画とエフェクター区画を分離して表現^{型解析を行います}。これらの方法は、異なる生物学的プロセスをモデル化できる補完的なアッセイプラットフォームとして提示されており、また容易に互換性があります。一次ヒトNK細胞は生細胞イメージングに基づくADCCアッセイに利用でき、フローサイトメトリーアッセイにおけるCAR介在殺にも設計可能です。さらに、野生型NK-92細胞はCD16発現¹⁸を欠いていますが、CD16の導入(例:レンチウイルス伝達)により、NK-92細胞は強力なADCCを容易に媒介できるようになります。したがって、両方のアッセイは個々の科学的および翻訳的ニーズに合わせて調整可能です。

両方のアッセイで再現性に特に重要なステップがいくつかあります。エフェクター細胞の数や表現型のわずかな変化が標的細胞の生存を劇的に変えることがあります。正確なセルカウントとメッキ中の徹底的な再懸濁は、セル数の偏差や不完全な混合を最小限に抑えるために不可欠です。同様に、細胞の準備は実験間で一貫性を保つ必要があり、生存可能性、回復期間、以前のサイトカイン曝露を含めて、均一なエフェクター機能を確保しなければなりません。プレート形状もアッセイ性能の重要な決定要因です。ライブセルイメージングのワークフローでは、フラットボトムコーティングプレートは安定した画像取得と一貫したフィールド解析をサポートしますが、フローサイトメトリーのワークフローでは、ラウンドボトムプレートは細胞間接触を促進し、エンドポイントでの非接着共培養の回復を促進します。さらに、蛍光標識の品質はアッセイ前に確認しなければなりません。イメージングによる標的細胞識別の不十分や、フローサイトメトリーによるCFSE分離の弱さは定量や解釈を妨げます。

これら2つのワークフローは、異なる技術的考慮事項を示しています。ライブセルイメージングアッセイでは、データ品質の低下の一般的な原因として、不均一な細胞板状、高密度の細胞クラスタリングや凝集、最適でない画像解析閾値などがあり、これらはいずれも容易に補正可能です。これらの問題は細胞数を歪め、時間経過による追跡の不安定さを引き起こす可能性があります。フローサイトメトリーベースのアッセイでは、最適でない結果は、高い背景的標的細胞死、標的細胞群とエフェクター集団の分離が弱い、抗体染色不良、または複製ウェル間のピペティング不均一が原因であることが多いです。これらのアッセイは比較解析を目的としているため、適切な内部対照群の含め方が解釈に不可欠です。これには標的のみのコントロールによる正規化や、抗体やCAR特異的疾患に対するマッチネガティブコントロールが含まれます。

これらの方法には、いくつかの共通点やアッセイ特有の制限を考慮する必要があります。生細胞イメージングアッセイは時間的な解像度を提供しますが、正確な蛍光標識および画像解析パラメータに依存し、これらは細胞クラスタリング、スペクトル重なり、^{共培養中の}形態変化に影響される可能性があります。特に一次効果細胞を含むアッセイの場合、殺菌ダイナミクスを変えずに十分な蛍光標識を得ることは困難または実現不可能となります。フローサイトメトリーベースのアッセイは、定義されたエンドポイントでより高い表現型分解能を提供しますが、複数のマッチング時点を収集しない限り、早期殺菌と後期殺菌を独立して区別できません。これはコストと時間のかかる^{場合があります。}さらに、エンドポイントの測定は標的細胞死だけでなく、標的細胞増殖、エフェクターの喪失、サンプル取り扱い中の回復の違いも反映されることがあります。したがって、CD107aのような機構的指標は、標的細胞除去の直接的な代替ではなく、エフェクター細胞活性化の補完的な指標として解釈するのが最適です¹⁹。より広く言えば、どちらのプラットフォームもNK細胞の機能を生体内で形作る空間構造、間質相互作用、サイトカイン勾配、輸送制約を完全に再現していません 。

NK細胞殺菌アッセイの解釈には、いくつかの生物学的要因も考慮する必要があります。ドナー間変異は、ドナー年齢、性別、感染症歴、受容体多型によって細胞毒性の可能性やサブセット構成が異なる一次ヒトNK細胞の実験に内在的^です。NK-92細胞の使用は変動を大幅に減らしますが、これらの細胞は依然として発生源および伝達に関連する変化を示すことがあります¹⁸。当プロトコルは、標準化されたパラメータと同一プレート比較を通じて技術的または実験的な違いを軽減し、これらの生物学的要因をより正確に評価します。可能な限り、固定された生存可能性閾値を持つ定義されたNK-92通過範囲の使用を推奨します。一次NK細胞については、各疾患ごとに複数のドナーのNK細胞を用い、ドナー間の違い(例:ペアードまたは混合効果モデル)を考慮した統計解析を行うべきです。これは、条件間の相対的な差がドナー間で一般的に維持されるためです。さらに、追加のNK細胞マーカー(例:KIR、NKG2A/C/D、CD57)をフローサイトメトリー用の抗体パネルに組み込むことで、ドナー間のサブセット頻度比較やサブセット特異的なNK細胞活性化(例:CD107aおよびCD69発現)の評価が可能となり、結果の解釈がさらに容易になります。最後に、すべてのNK細胞殺害アッセイに対して、特定の追加のシナリオを考慮する必要があります。NK細胞での標的抗原の発現は、内因性発現またはトロゴサイトーシスを介して標的細胞から抗原を獲得することで、NK細胞のフラトリシドを引き起こし、結果を混乱させることがあります。例えば、ダラツムマブはNK細胞で発現したCD38を標的とし、フラトリチド²¹を誘導することで、ADCCの大きさを目標標的に対して制限します。幸いにも、生細胞イメージングやフローサイトメトリーアッセイにより、NK細胞の定量化が可能で、兄弟殺傷の評価が可能です。

これらの制約にもかかわらず、ライブセルイメージングとフローサイトメトリーの組み合わせは、基礎的および前臨床的応用における再現可能なNK細胞機能試験の実用的な枠組みを提供します。画像処理のワークフローは、時間的挙動が重要な場合に有利であり、例えば急速反応と遅延細胞毒性反応の区別や、CAR設計間での殺菌動力学の比較^{などです。}フローサイトメトリーに基づくワークフローは、同じサンプル内でエフェクターおよびターゲット細胞の表現型と併用して機能的読み取りを解釈する必要がある場合に有利です。これらのアプローチを組み合わせることで、広く利用可能な実験プラットフォームを用いて自然殺菌、CAR介在細胞毒性、ADCCの定量的評価が可能になります。標準化され拡張可能な枠組みを確立することで、このシステムはNK細胞ベースのモダリティにおける厳密なベンチマーキングと機構的検証を促進し、次世代免疫療法の開発と臨床応用を加速させます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Advanced RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	12633020	NK-92および一次ヒトNK細胞培養培地用基底培地（完全な配合についてはプロトコル参照）
Anti-human CD107a antibody, PE-Cy7 conjugated (clone H4A3)	BioLegend	328618	フローサイトメトリー用脱顆粒マーカー
Anti-human CD16 antibody, BV785 conjugated (clone 3G8)	BioLegend	302046	フローサイトメトリー
Anti-human CD56 antibody, BV421 conjugated (clone HCD56)	BioLegend	318328	フローサイトメトリー
Benchtop centrifuge with swinging bucket rotor compatible with 15-mL tubes and 96-well plates (Eppendorf Centrifuge 5810R)	Eppendorf	5811000015	セルペレティングとプレート遠心（100–300 × g）に使用
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	Thermo Fisher Scientific	C34554	標的細胞ラベリング用細胞増殖染色
Cytek Aurora spectral flow cytometer (or equivalent)	Cytek Biosciences	N7-00003	フローサイトメトリーの取得と分析に使用
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	BioLegend	422801	生死判別用核染色
Deep-well 96-well plate	USA Scientific	1896-2110	抗体調製に使用
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	凍結保存用試薬
Fetal bovine serum (FBS)	Avantor	76419-584	基底培地補完; FACSバッファー（2％FBS）で使用
General Purpose Water Bath, 10 L (37 °C)	PolyScience	WBE10	セル解凍用
GlutaMAX (L-alanyl-L-glutamine supplement)	Thermo Fisher Scientific	35050061	安定したグルタミン源
Human AB serum	Sigma-Aldrich	H4522-100ML	一次ヒトNK細胞培養培地用サプリメント
IncuCyte SX5 live-cell imaging system	Sartorius	4816	リアルタイムのライブセルイメージングとセルバイセル分析
LUNA-FL dual fluorescence cell counter (or equivalent)	Logos Biosystems	L20001	自動セルカウンティング
Parafilm M (4 in × 250 ft roll)	Genesee	16-101	プレートシーリングと保管
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile (pH 7.2–7.4)	Corning	21-020-CV	洗浄およびFACSバッファー調製に使用
Poly-D-lysine (0.1 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A3890401	プレートコーティング試薬
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	抗生物質
Recombinant human interleukin-2 (IL-2)	R&D Systems	202-IL-500	サイトカイン
RosetteSep Human NK-cell enrichment kit	STEMCELL Technologies	15065	ヒトNK細胞濃縮カクテル
SYTOX Orange dead cell stain	Thermo Fisher Scientific	S34861	ライブセルイメージング用バイアビリティ染色
Trypan Blue 0.4%	Gibco	15250-061	セルカウント用バイアビリティ染色
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604039	接着性細胞の剥離用
UltraPure EDTA (0.5 M, pH 8.0)	Thermo Fisher Scientific	15575020	FACSバッファー調製に使用
15-mL conical-bottom centrifuge tubes	Corning	352097	無菌
24-well tissue culture plate (tissue culture–treated)	Corning	3524	NK細胞回収に使用
96-well clear round-bottom plate (tissue culture–treated)	Corning	3799	共培養およびフローサイトメトリーアッセイに使用
96-well flat clear-bottom black polystyrene plate (tissue culture–treated)	Corning	3603	ライブセルイメージングシステムと互換性あり