本プロトコルは、急性呼吸困難症候群(ARDS)における年齢層別ピロプトーシスバイオマーカーを特定するための統合バイオインフォマティクスおよび機械学習ワークフローを示し、LPS誘導ラットモデルを用いた生体内手法を用いて、スペクトルエネルギー、水、遠赤外線放射線の予備的有効性を実験的に検証することを目的としています。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
研究記事
* These authors contributed equally
本プロトコルは、急性呼吸困難症候群(ARDS)における年齢層別ピロプトーシスバイオマーカーを特定するための統合バイオインフォマティクスおよび機械学習ワークフローを示し、LPS誘導ラットモデルを用いた生体内手法を用いて、スペクトルエネルギー、水、遠赤外線放射線の予備的有効性を実験的に検証することを目的としています。
急性呼吸困難症候群(ARDS)は、高い罹患率と死亡率を持つ生命を脅かす炎症性肺疾患であり、ピロプトーシスが重要な病原性メカニズムとして浮上しています。加齢に伴う免疫および分子の違いがピロプトーシスおよび治療反応に影響を与える可能性があることを考慮し、本研究は年齢特異的なピロプトーシス関連バイオマーカーの特定と、スペクトルエネルギー水(SEW)と遠赤外線放射線(FIR)の組み合わせの治療可能性を評価することを目的としました。プロトコルの包括的なワークフローは、トランスクリプトミックデータセットの処理、年齢層化、機械学習、免疫浸潤解析を含み、年齢特異的なハブ遺伝子の特定を行います。この計算フェーズの後、LPS誘導ARDSラットモデルを用いた生体内実験検証が行われ、組織学的評価、ELISA、ウェスタンブロッティングを用いてSEW+FIR介入を厳密に評価し、ハブ遺伝子発現を検証します。16のピロプトーシス関連遺伝子が同定され、そのうちAXLおよびGSDMEは高齢患者で主にARDSの重症度と関連し、SPP1は若年患者により関連性が高かった。高齢患者ではM2マクロファージ濃縮と免疫抑制が見られるが、若年患者では炎症促進活性化が見られる。機能解析により、これらの遺伝子が代謝、炎症、免疫の調節経路に関与していることが示されました。生体内では、SEW+FIR治療が肺損傷を緩和し、炎症性サイトカイン(IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α)の産生を抑制し、AXL、GSDME、SPP1の発現を調節しました。これらの結果は総じて、ARDSにおけるピロプトーシス関連機構の年齢依存的な違いを強調し、AXL、GSDME、SPP1がさらなる臨床検証を要する予備的バイオマーカー候補であることを示しています。現在のマウス実験モデルでは、SEW+FIRが全身性炎症を緩和し、ピロプトーシス関連シグナル伝達を調節することで保護効果を示し、非薬理学的補助戦略としての基礎的なin vivo支持を提供しました。
急性肺損傷(ALI)/急性呼吸困難症候群(ARDS)は、主にびまん性肺胞損傷に起因する重度の低酸素血症と非心因性肺水腫の急性発症を特徴とする重篤な呼吸器疾患です。肺および肺外のさまざまな損傷によって引き起こされることがあります。肺の原因には感染性肺炎、胃内容物の誤嚥、重度の胸椎外傷があり、肺外の誘因は敗血症、膵炎、非胸部外傷、重度の火傷、大量輸血、肺移植または血栓切除後の再灌流損傷などの非肺損傷に伴う全身炎症反応から生じます1,2.支援医療の進歩にもかかわらず、ARDSは依然として集中治療医学における主要な臨床課題であり、世界的に高い罹患率と死亡率を抱えています3。したがって、ALI/ARDSの病因を理解することは効果的な治療法の開発に不可欠です。
ピロプトーシスは、腫瘍抑制や腫瘍治療の文脈で広く特徴づけられている炎症性のプログラム細胞死の形態であり、現在ではARDSの病態生理学における重要な存在として認識されています。アポトーシスとは異なり、ピロプトーシスはインフラマソームの活性化とその後のガスデルミンD(GSDMD)の切断によって媒介され、膜孔の形成、細胞溶解、インターロイキン-1β(IL-1β)やインターロイキン-18(IL-18)6などの炎症促進サイトカインの放出を引き起こします。ARDSでは、肺胞マクロファージ、上皮細胞、内皮細胞における過剰なピロプトーシス活性化が炎症反応の過剰、肺胞毛細血管関門の破壊、肺水腫、低酸素血症の進行に寄与します7。増え続ける証拠は、炎症を軽減し臨床アウトカムを改善するための新たな戦略である可能性を示唆しています。ピロプトーシス経路の主要な調節因子を標的とすることが、ARDS 8,9において。しかし、ARDSの感受性と予後を左右する重要な要因である老化がピロプトティックの生態に与える影響については、依然として重要な知識のギャップがあります。現在の研究では、ARDSを一枚岩の疾患として扱い、個別化した治療反応を左右する年齢特異的な分子要因の可能性を見落としています。
近年、SEWや遠赤外線(FIR)放射体などの新しい生物物理的介入や高度な機能性材料の応用が、免疫応答の調節や炎症抑制のための非薬理学的戦略として注目を集めています10,11。これらの治療法は白血球増殖と食細胞活性を促進し、組織浮腫を軽減し、エンドトキシン誘発性の微小循環障害(白血球の癒着、赤血球の凝集、血小板活性化、内皮損傷など)を軽減することが報告されています(12,13,14)。リポ多糖(LPS)誘発性ARDSラットでは、SEWとFIRの併用治療により、ピロプトティックカスケードの下流効果因子であるIL-1βおよびIL-18のレベルが血清および気管支肺胞洗浄液(BALF)の両方で有意に減少しました。この証拠は、SEW+FIRの保護効果がインフラムソーム駆動の細胞死の抑制を通じて媒介されている可能性を強く示唆しています。さらに、SEWは単独または溶媒として適用した場合、インターロイキン8(IL-8)および腫瘍壊死因子α(TNF-α)の発現レベルを低下させ、血清中のインターロイキン4(IL-4)およびインターロイキン10(IL-10)の発現レベルを上昇させ、組織病理学的肺損傷を緩和することが確認されました(15,16,17,18)。
これらの観察を基に、ARDSにおけるSEWとFIRの併用治療効果は、年齢特異的なピロプトティック経路を調節し、肺免疫の恒常性を標的的に回復する能力に基づいていると仮説を立てました。現在、ARDSの管理の主力は人工呼吸とコルチコステロイドなどの限定的な薬理学的薬剤に依存しており、これらはしばしば人工呼吸器による肺損傷や全身免疫抑制のリスクを伴います19。これらの従来の治療法と比較して、SEW+FIRは非侵襲的かつ非薬理学的な代替手段を提供し、二次的な臓器毒性なく初期炎症カスケードを安全に軽減する可能性があります。実際には、このプロトコルは軽度から中等度のARDSに対する早期補助的介入として最も適しています。主な限界は、重度で後期の線維性ARDSにおける有効性がまだ証明されておらず、集中治療の場面で不可欠な生命維持措置に代わることはできないことです。仮説を検証するために、年齢層別のトランスクリプト体プロファイリングと機械学習をvivo検証とつなぐ統合パイプラインを先駆的に構築しました。このアプローチは、AXL、GSDME、SPP1を新規かつ年齢特異的な治療標的として特定するだけでなく、SEW+FIRがARDSの精密な非薬物介入として臨床的潜在力を持つことを示す初のメカニズム的証拠を提供します。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
すべての動物実験手順は、北京中医薬大学東直門病院の実験動物福祉倫理委員会(承認番号19-54)が承認したガイドラインに厳格に従って実施され、研究開始前に行われました。
データソースとデータ処理
遺伝子発現データセット(GSE89953および4 GSE116560)はGene Expression Omnibus(GEO)データベース20から取得されました。ARDS患者の異なる年齢層の全肺胞マクロファージトランスクリプトミクスデータを含み、GSE89953データセットが差別発現およびネットワーク解析に使用されました。GSE116560データセットには機械的換気の状態などの臨床情報が含まれ、機械学習および予後モデリングに使用されました。さらに、ピロプトーシスに関連する608の遺伝子を包括的なヒト遺伝子注釈データベースから抽出し、相関スコア1を超えるスクリーニング基準を用いました。遺伝子発現データはRのlimmaパッケージを用いて正規化されました。臨床試験番号:該当なし。
DEGの識別
GSE89953データセットの患者は、低年齢(<45歳)と高齢(≥45歳)の2つの年齢グループに階層化されました。このカットオフは、ARDS発症の中央値年齢が約45歳21歳であることを示唆する疫学的証拠に基づいて選ばれました。この閾値の堅牢性を確保するため、50歳と55歳の代替年齢カットオフを用いた感度解析が行われました。これらの解析はハブ遺伝子の同定とモジュールクラスタリングにおいて一貫したパターンを示し、後続解析の45年カットオフを統計的に検証しました。データセットはRのlimmaパッケージを用いて正規化されました。年齢層間の差異発現遺伝子(DEGs)は、経験的ベイズ減速を用いた線形モデリングを用いて同定されました。調整された P 値が0.05<|log₂フォールド変化する遺伝子|統計的に有意なDEGは0.5≥とみなされました。火山プロットとヒートマップは、Rのggplot2パッケージを用いてDEGを可視化するために生成されました。
ピロプトーシス関連遺伝子の同定および増殖解析
ピロプトーシス関連遺伝子は「ピロプトーシス」というキーワードを使って遺伝子注釈データベースから取得されました。DEGsとピロプトーシス関連遺伝子の交差点は、差異発現ピロトーシス関連遺伝子(DEPGs)として定義されました。DEPGの遺伝子オントロジー(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)経路の濃縮解析は、R22のclusterProfilerパッケージを用いて実施されました。生物学的過程(BP)、細胞成分(CC)、分子機能(MF)のカテゴリーが注釈され、Zスコア≥1、 調整P値 <0.05が有意とみなされました。
加重遺伝子共発現ネットワーク解析(WGCNA)
ピロプトーシスに関連する遺伝子モジュールを特定するために、WGCNA Rパッケージを用いてWGCNAが実施されました。符号付きネットワークは、スケーリングフリートポロジー23を保証するためにソフトしきい値パワー(β)26を用いて構築されました。モジュールは動的木切りアルゴリズムによって特定され、最小モジュールサイズは30、ディープスプリットは2、マージ閾値(切断高さ)は0.25でした。モジュール固有遺伝子とピロプトーシス形質の相関を計算しました。遺伝子セット変異解析(GSVA)は、MsigDB24,25からダウンロードした特徴的な遺伝子セットを用いて選定モジュールで実施されました。
機械学習
GSE116560データセットは高年齢グループと低年齢グループに分けられ、45歳を基準にし、両グループは機械学習アルゴリズムで分析されました。最小絶対収縮および選択演算子(LASSO)回帰解析は、Rのglmnetパッケージ(バージョン4.1-2)を用いて実装され、最適ペナルティパラメータ(λ)は10折りクロス検証(1-SE基準)によって決定されました。ランダムフォレスト(RF)アルゴリズムでは、500本の木(ntree = 500)を構築し、各分割(mtry)でサンプリングされる特徴数を予測変数の総数の平方根に設定してモデルの安定性を確保しました。両方法の重複遺伝子は年齢特異的シグネチャー遺伝子として定義されました。
診断モデルの構築と評価
識別されたシグネチャー遺伝子に基づいて診断予測モデルを構築しました。モデル開発にはロジスティック回帰法が用いられ、その予測力を可視化するためにノモグラムが作成されました。モデルの性能は受信機動作特性(ROC)曲線を用いて評価され、曲線下面積(AUC)を計算して診断精度を評価しました。内部検証はブートストラップリサンプリングによって行われました。モデルの安定性および臨床的有用性のさらなる評価は、キャリブレーションプロットおよび意思決定曲線解析(DCA)を用いて実施されました。
免疫浸潤解析
高齢および低齢群の免疫細胞組成は、LM22シグネチャマトリックスに基づくCIBERSORTアルゴリズムを用いて推定されました。22種類の免疫細胞の相対的な割合をグループ間で比較しました。免疫細胞サブセット間のハブ遺伝子の差異発現を単一サンプルデータを用いて解析し、ヒートマップおよびヒストグラムで可視化しました。
遺伝子セット濃縮解析(GSEA)
GSEAは高齢者グループと低年齢グループからハブ遺伝子を別々に実施しました。遺伝子セット濃縮解析(GSEA)は、京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)の遺伝子セットを用いて実施されました。遺伝子は高発現群と低発現群間の信号対雑音比(またはフォールド変化)に基づいてランク付けされました。その後、1,000の置換を用いて濃縮および正規化濃縮スコア(NES)を算出し、有意に濃縮された経路を特定しました。偽発見率(FDR)が0.25未満、名目上の P 値が0.05未満の経路は有意に濃縮されました。この解析を用いて、各ハブ遺伝子によって調節される生物学的経路を推定しました。
実験動物
本研究では、生後6〜7週のSPF付きスプラグドーリーラット18頭(180 g ± 10 g)を用いました。詳細なサプライヤー情報は材料表に記載されています。
試薬と器具
電磁場処理水の準備装置と遠赤外線放射装置が実験的介入に用いられ、それぞれスペクトルエネルギーの水(SEW)と遠赤外線放射(FIR)を供給しました。リポ多糖(LPS)を用いてARDSをモデル化しました。サイトカインレベル(IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α)は特定のELISAキットを用いて定量化しました。タンパク質発現レベル(AXL、SPP1、カスパーゼ3、GSDME、GAPDH)は、特異的一次抗体および対応するHRP結合二次抗体を用いて評価しました。サンプルの処理と分析は、生体顕微鏡、ミクロトーム、高速遠心分離機、超低温冷凍庫、マイクロプレートリーダーなどの標準的な実験機器を用いて行われました。すべての試薬、抗体、計測機器およびそれぞれの製造元の詳細は、材料表に記載されています。
動物の分類とモデル化
18頭のスプラグ・ドーリー・ラットがランダムに対照群、モデル群、SEW+FIR群に割り当てられ、各群に6匹ずつ割り当てられました。各グループは毎日体重測定と記録が行われました。SEW+FIR群は、1日20分間、温度管理環境(22°C±2°C)でFIR療法(波長4μm–14μm、背側から20cmの照射距離)を受け、同時に経口ガベージ7による1mL/100g/日のSEW投与を受けました。蒸留水は対照群およびモデル群に経口投与され、同等量は1 mL/100 g/dで投与されました。SEWと蒸留水は、60°Cの温かい浴槽で加熱後7日間、1日1回投与されました。7日目、授乳後6時間後、モデル群とSEW+FIR群は尾静脈を通じて2 mg/kgのLPS溶液を注射し、対照群は0.9%生理食塩水を2 mg/kgの量で投与しました。このモデリング技術は、尾静脈経由の単一LPS注射で全身性炎症反応を誘発する成熟かつ安定した方法と考えられていました。モデル群の肺病理からはARDSの特徴25と一致しました。チェックポイント:ARDS誘発の成功は、注射後16時間以内に目に見える倦怠感、頻呼吸、体重が約10%減少していることで示されます。
ネズミ関連指標の収集
16時間後、3群すべてに3%ペントバルビタールナトリウムを腹部内に30 mg/kg体重投与して麻酔を誘発しました。重要:麻酔の深さは、手技介入前に足筋離脱反射の喪失によって厳密に確認されなければなりません。さらに、厳格なバイオセーフティプロトコルが維持され、すべてのLPS汚染物質、生物体液、動物の死骸は、適切な焼却のため指定されたバイオハザード廃棄物容器に処分されました。腹部大動脈から5ミリリットルの血液を無菌チューブに採取し、1,000 x g で4°Cで20分間遠心分離して血清を分離しました。 その後、血清は−80°Cで保存され、さらなる分析が行われました。開胸術および右肺門の結紮後、気管基内カニューレを用いて予備冷却されたリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で左肺を3回洗浄することで気管支肺槽洗浄液(BALF)を得ました。その後、BALFは1,000 x g で4°Cで10分間遠心分離され、上清液は−80°Cで保存されました。 右肺の上葉は摘出され、冷たい生理食塩水で血液を除去しました。組織重量に対して生理食塩水を9巻追加し、検体は眼用ハサミで氷浴で刻み分けられました。10%肺組織均質剤をホモジナイザーで製製し、その後700 x g で4°Cで15分間遠心分離しました。 上清液は−80°Cで採取され、さらなる生化学的分析のために保存されました。さらに、各ラットの右肺組織の一部を組織学的検査のために4%パラホルムアルデヒドで固定しました。
観測指標と検出方法
右肺の下葉は標準的な埋め込み、組織スライス、脱ワックス、HE染色、色分離、脱水、4%パラホルマルデヒド固定後の膜シール処理を用いて処理されました。各グループの肺組織からは光学顕微鏡で病理学的変異が観察されました。
歯槽構造および鼻中隔の病理異常、炎症細胞浸潤の度合い、充血、肺毛細血管水腫を光学顕微鏡で確認した。北京中医薬大学病理学部が観察を支援しました。組織学的肺損傷スコアは、以下の通りに計算されました:無損傷 = 0、フィールドの25%未満での損傷 = 1、フィールドの25–50%での損傷 = 2、フィールドの50–75%での損傷 = 3、75%以上のフィールドでの損傷 = 4。10の分野が無作為に選ばれ、研究者がグループ化を盲検にして評価しました。
ELISAは、製造元の指示に従い、以前に採取されたBALF上清液、肺組織均質液、血清サンプルに対して実施されました。サンプルは37°Cのプレコーティング井戸で90分間インキュベーションされました。洗浄バッファーで5回洗浄した後、ビオチニル化検出抗体(1:100希釈)を37°Cで60分間適用しました。 さらに洗浄工程を経て、HRP共役脂肪酸を加え、37°Cの暗闇で30分間培養しました。 その後、マイクロプレートリーダーを用いて450nmで吸収を測定し、試料濃度を計算しました。
ウエスタンブロット解析を用いて、−80°Cで保存された肺組織およびBALFサンプルにおけるAXL、SPP1、カスパーゼ1、GSDMD、カスパーゼ3、GSDME、GAPDHの発現レベルを評価するために実施されました。 タンパク質は、タンパク質抽出キットの指示に従って採取・溶解されました。各レーンごとに同量のタンパク質抽出物(40μg)をロードし、SDS-PAGEで分離しました。ポリペプチドは分離され、PVDF膜に移されました。膜は5%無脂肪のドライミルクでTBSTで室温で1時間ブロッキングし、その後4°Cで特異的一次抗体(希釈した1:1000)とともに一晩培養しました。TBSTで3回、各10分間洗浄した後、膜はHRP結合した二次抗体(希釈した1:5000)と室温のブロッキング溶液で1時間インキュベートされました。内部参照タンパク質としてGAPDHを使用しました。タンパク質バンドは、1〜5分の露光時間を持つ強化化学発光(ECL)キットを用いて可視化し、その結果を画像処理ソフトウェアで解析しました。標的タンパク質の相対発現レベルは、標的タンパク質とGAPDHの比率として計算されました。
統計解析
定量指数は平均および標準偏差±表され、統計解析は統計ソフトウェアを用いて行われました。Kruskal–Wallis検定または一方向ANOVAを用いて、データが正規分布かどうかに応じて複数のグループ間で差を比較しました。すべての統計は両側仮説検定を用いて評価されました。差異遺伝子発現や免疫細胞浸透プロファイリングなど複数比較を伴う解析では、ベンジャミニ・ホッホバーグ偽発見率(FDR)法を用いて P 値を調整しました。調整後 P 値が0.05以下であれば、統計的に有意とみなされました。グラフ作成にはグラフ作成ソフトウェアが使用されていました。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
異なる年齢層におけるDEGの同定と対応する機能豊化解析GSE89953
GSE89953データセットの生の発現データはlimmaパッケージ内のnormalizeBetweenArrays関数(図1A)を用いて正規化され、正規化前後のボックスプロットでサンプル間の整合性が向上しました。正規化マトリックスに基づく差異発現解析により、228のDEGが同定されました(ベンジャミニ・ホッホバーグ補正を用いて p < 0.05を修正、|log₂FC| ≥ 0.5)、その中には高齢者群で有意に上行した遺伝子が16、有意にダウンレギュレーションされた遺伝子が43に含まれます(図1B、C)。これらのDEGとデータベース内のピロトーシス関連遺伝子を交差させることで、16の差異発現ピロトーシス関連遺伝子(DEPGs)が得られました(図1D
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
炎症性損傷の蓄積と免疫調節障害は急性呼吸困難症候群(ARDS)の特徴であり、重度の肺損傷と高い死亡率を引き起こします。複雑な病因と効果的な治療法の不足により、正確な治療標的を特定することが治療結果を改善するために極めて重要です。新たな証拠は、プログラムされた細胞死の一種であるピロプトーシスがARDSの進行において中心的な役割を果たすことを示唆しています。年齢がARDSの発症および重症度に重要な要因であることを踏まえ、45歳を基準にして年齢ごとに階層化し、異なる年齢層にわたるピロプトーシス関連の主要な標的を特定しました。本研究では、トランスクリプトム解析、免疫浸潤プロファイリング、実験的検証を統合し、ARDSの年齢特異的分子特性および治療標的を探りました。ピロプトーシス関連の遺伝子発現に焦点を当て、機械学習を活用することで、ARDSの進行に診断的かつ機構的に関連性を示すAXL、GSDM、SPP1という異なるハブ遺伝子を特定しました。方法論に焦点を当てた研究として、WGCNAにおけるソフト閾値値の厳密な選択から、生体内モデルにおけるLPS用量およびFIR照射パラメータの正確...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
著者たちは何も明かすことはありません。
著者らはすべての研究参加者の皆様に感謝申し上げます。著者たちは、英語の編集および査読サービスを提供してくれたAiMi Academic Services(www.aimieditor.com)に感謝しています。本研究は北京中医大学東直門病院横向研究プロジェクト(HX-DZM: No.2017005/HX-DZM: No.2017019)、北京中医大学研究プロジェクト(2025-JYB-JBGS-034)、および中央政府資金提供の高級伝統中医病院臨床研究プログラム(DZMG-MLZY-23004)によって資金提供・支援を受けました。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 抗AXL抗体 | アブカム | AB215205 | |
| 抗カスパーゼ-3抗体 | アブカム | AB184787 | |
| 抗GAPDH抗体 | アブカム | AB8245 | |
| 抗GSDME抗体 | アブカム | AB215191 | |
| 抗SPP1抗体 | アブカム | AB307994 | |
| バイオ顕微鏡 | オリンパス、日本 | BH2 | |
| FIR機器 | 広東JFCグループ | JF-802 | |
| ヤギ抗ウサギIgG H&L(HRP) | アブカム | AB6721 | |
| GraphPad Prism 10.1.2 | GraphPadソフトウェア | - | |
| 高速遠心分離機 | サーモ、アメリカ | ソーヴァル ST16R | |
| IL-18 ELISAキット | 江蘇美弁バイオテクノロジー有限公司 | MB-1735B | |
| IL-1とベータ;ELISAキット | 江蘇美弁バイオテクノロジー有限公司 | MB-1588B | |
| IL-6 ELISAキット | 江蘇美弁バイオテクノロジー有限公司 | MB-50054A | |
| イメージJ | NIH | - | |
| リポポリサカリド(LPS) | シグマ、アメリカ | L6511 | |
| オスのSPFスプラグドーリーラット(6〜7週齢) | 北京HFKバイオサイエンス株式会社、中国 | SCXK(北京)2019-008(ライセンス) | |
| マイクロプレートリーダー(Varioskan Flash) | サーモ・サイエンティフィック | ヴァリオスカン・フラッシュ | |
| ミクロトーム | ライカ | RM2235 | |
| Rソフトウェア(limma、clusterProfiler、WGCNA、glmnet、randomForest) | R統計計算財団 | - | |
| SEW準備器具 | 広東JFCグループ | JF-139 | |
| SPSS 26.0 | IBM | - | |
| テーブルバランス | 上海キャニー精密機器有限公司 | HC·TP11·10 | |
| TNF-およびα;ELISAキット | 江蘇美弁バイオテクノロジー有限公司 | MB-50051A | |
| 超低温冷凍庫 | サーモ、アメリカ | フォーマ900シリーズ |