変形性関節症に対するトンビーフォーミュラのネットワーク薬理学および分子ドッキング研究

サマリー

本プロトコルはネットワーク薬理学と分子ドッキングを用いて、TongBiフォーミュラの変形性関節症に対する潜在的な治療標的および分子メカニズムを予測します。

要約

本研究では、ネットワーク薬理学と分子ドッキングを組み合わせて、変形性関節症(OA)におけるTongBiフォーミュラ(TBF)の治療標的および分子メカニズムを予測しました。TBFの有効成分および対応標的は、伝統中国医学システム薬理学データベースおよび解析プラットフォームから取得し、OA関連標的はOnline Mendelian Inheritance in Man、GeneCards、DrugBank、治療標的データベースから収集されました。ネットワークの可視化および解析ソフトウェアを用いて、化合物–ターゲットおよびタンパク質–タンパク質相互作用(PPI)ネットワークを構築しました。遺伝子オントロジー機能注釈および京都遺伝子・ゲノム百科事典経路の濃縮解析は、注釈・可視化・統合発見データベースプラットフォームを用いて実施されました。分子ドッキング解析を用いて、主要な有効化合物とコアターゲットタンパク質間の予測結合親和性を評価するために、分子ドッキングソフトウェアを用いて実施されました。TBFとOAの間に合計47の重複標的が特定されました。PPIネットワーク解析により、JUN、RELA、IL6、MAPK1、IL10が潜在的なハブターゲットとして浮き彫りになりました。濃縮解析により、TBFは炎症、脂質代謝、そしてOA進行に関連する複数の細胞内シグナル伝達経路を調節する可能性が示唆されました。分子ドッキングの結果は、コア有効化合物と主要なOA関連タンパク質標的間で良好な結合親和性が予測されることを示しました。これらの発見は、TBFがOAに対して持つ潜在的なメカニズムを理解するための計算的枠組みを提供し、さらなる実験的検証を支えています。

概要

変形性関節症(OA)は、関節軟骨の変性炎症性疾患です^。現在、約5,800万人の成人がOAの影響を受けており、この数は2040年までに7,840万人に増加すると予測されています。OAは世界中で関節痛や機能障害の一般的な原因^です。OAに伴う激しい痛みのため、患者は日常生活で大きな障害を経験する^{ことが多いです。}年齢、女性、肥満、関節損傷がOA⁵の主なリスク要因です。OAの有病率は非常に高く、医療システムに大きな影響を与えていますが、利用可能な治療法^{は依然として}限られています。現代医学では、非ステロイド性抗炎症薬や軟骨保護剤などの対症治療が一般的に採用されています。しかし、長期投与は消化器系障害や肝^腎機能の異常などの副作用を引き起こすことが多い7。したがって、OAに対する新しい治療法や代替療法の開発が緊急に求められています。

伝統中国医学(TCM)は、OA治療において豊富な経験を積み、症候群の分化とホリスティックな調整を重視しています。通餅方(TBF)は、主に当貴、丹神、吉雪騰、海風騰、頭骨草、独火、魏霊仙、香府から成る古典的な処方です。中医学の観点から見ると、OAの病理的性質は主に風・寒湿の侵入と気と血の停滞に起因します^。TBFの漢方適合性はこの中核的な病理機構に適合するよう設計されており、すべての薬用成分が相乗効果を発揮して風湿を吹き飛ばし、経絡を潤し、血行を促進し、OAの典型的な中医症候群の特徴に対応しています。増加する臨床研究は、修正TBFがOA患者の関節痛を緩和し、四肢の運動機能を改善する可能性を示唆しています^。さらなる臨床観察では、OA^症例における炎症反応の調節能力も示されており、最近のメタアナリシスでもOA介入への臨床的応用可能性が支持^{されました。}

TBFは伝統的に風を吹き飛ばし、通路を開け、風を散らし、湿気を除去し、血行と栄養を促進するために使われます。しかしながら、TBFがOAに対してどのような潜在的な治療効果を発揮する具体的なメカニズムは不明であり、その有効成分や主要な標的はまだ明らかにされていません。これらのメカニズムをより体系的かつ包括的に調査するため、薬物、標的、疾患間の関係を示すネットワークマップを構築するためにネットワーク薬理学的アプローチを用い^ました。さらに、遺伝子オントロジー(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)による濃縮解析も行われ、TBF¹³の薬理学的作用に関与する分子メカニズムやシグナル伝達経路の可能性を探りました。TCM処方薬の薬理学的メカニズムを体系的に調査するため、本研究では有効成分のスクリーニング、ターゲット予測、ネットワーク構築、機能濃縮解析、分子ドッキングを含む完全な分析ワークフローを構築しました。このような研究枠組みは、中医学処方の分子メカニズムをOA¹⁴に対抗する際の標準化かつ再現可能なパラダイムとして認識されています。既存の方法論的研究は、この^{研究戦略の}科学的合理性と実用的応用性をさらに支持しています。方法論的標準化を超えて、本研究はOAにおけるTBFの物質的基盤と主要な規制目標の定義に寄与します。さらに、TBFの臨床応用および将来の実験的検証のための理論的参考文献を提供するとともに、他のTCM処方薬の機構的探究のための実現可能な方法論的枠組みも示しています。

本研究では、ネットワーク薬理学的アプローチを用いて有効成分をスクリーニングし、OA関連標的遺伝子と組み合わせた化合物–標的ネットワークを構築しました。その後、機能的濃縮解析と分子ドッキングが行われ、機構的探査が行われました。ネットワーク薬理学は、生物学的および薬理学的情報を統合し、薬剤・標的・疾患関係を包括的かつ多面的な視点から調査^します。このアプローチがTBFの薬理学的メカニズムを明らかにし、今後の実験研究の理論的基盤を提供するのに役立つと考えています。研究のワークフローは 図1に示されています。

図1。ネットワーク薬理学および分子ドッキング研究設計のワークフロー。 変形性関節症(OA)に対するTongBiフォーミュラ(TBF)の潜在的メカニズムを調査するために用いられた分析ワークフローの概説的概要。ワークフローには、アクティブ化合物スクリーニング、ターゲット予測、OA関連ターゲット収集、交差解析、ネットワーク構築、タンパク質間相互作用(PPI)解析、遺伝子オントロジー(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)の濃縮解析、分子ドッキング検証が含まれていました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

プロトコル

この研究には人間、脊椎動物、組織サンプルは含まれていません。すべての解析は公開されているバイオインフォマティクスデータベースと分子ドッキング手法を用いて行われました。したがって、倫理的な承認は必要ありませんでした。

TBFの構成要素および対応するターゲットのスクリーニング
TBFのすべての漢方成分(唐桂、丹神、吉雪騰、海風騰、豆虎草、独火、魏霊仙、香府)は、TCMシステム薬理学データベース・分析プラットフォーム(TCMSP)(2026年1月アクセス)で検索されました。正確な検索語は各漢方薬の標準化されたラテン語名に対応していました: Angelicae Sinensis Radix (ダングイ)、 Radix Salviae (ダンシェン)、 Spatholobus suberectus Dunn(ジシュエテン)、 Caulis Piperis Kadsurae (海豊騰)、 Impatiens balsamina (トグカオ)、 Radix Angelicae Biseratae (ドゥホ)、 Radix Clematidis (威靈仙)、 Cyperi Rhizoma (香福)化学成分は経口バイオアバリアフリー(OB)の固定閾値≥30%、薬剤類似度(DL)≥0.18に基づいてスクリーニングされました。これらのカットオフ値は、生体内での活性を持つ可能性のある生体利用可能性の高い薬剤様有効化合物を特定するために、TCMネットワーク薬理学研究で広く用いられています。データベースに明確なOB値またはDL値を持たない化合物は、有効成分スクリーニングの信頼性と一貫性を維持するために除外しました。

スクリーニングされた有効成分の対応するタンパク質標的は、その後TCM薬理学データベースから取得されました。標的遺伝子の標準化は、Universal Protein Resource(UniProt)タンパク質注釈データベースを用いて行われ、種は ホモ・サピエンス に限定されました(2026年1月アクセス)。元のタンパク質名は公式のヒト遺伝子記号に変換され、冗長で非ヒト標的エントリーは手動で除外されました。重複したターゲットは手動比較と照合によって除去され、最終的なTBFターゲットデータセットが生成されました。

OA関連標的および骨髄損傷の潜在的な治療標的の特定
OA関連標的は、オンラインメンデル遺伝の人間(OMIM)、GeneCards、DrugBank、および治療標的データベース(TTD)データベース(2026年1月アクセス)における正確な検索語「Osteoarthritis」を用いて取得されました。異なるデータベースから得られた重複ターゲットは、データ照合と比較を通じて手動で除去され、OA関連のターゲットデータセットが生成されました。GeneCardsでは、関連性スコアが3≥のターゲットのみが保持されました。OMIM、DrugBank、TTDから「Osteoarthritis」というキーワードで取得した標的は、追加のフィルタリング基準には適用されませんでした。活性化合物関連標的とOA関連標的の重複標的は、Venny 2.1.0オンラインVenn解析ツールを用いて特定されました。交差解析は、TBFがOAに対して潜在的な治療標的となる可能性を明らかにするために実施されました。

TBF–コンポーネント–ターゲットネットワークの構築
コンポーネント–ターゲット相互作用データはCytoscape 3.10.2ネットワーク可視化・解析ソフトウェアにインポートされ、TBF–コンポーネント–ターゲットネットワークを構築しました(2026年1月アクセス)。構築されたネットワークでは、ノードはハーブ化合物と標的遺伝子を表し、エッジは有効化合物と対応する標的間の相互作用を表していました。重複分析を避けるため、複数のハーブで共有された重複化合物を一つの一意ノードに統合しました。その後、次値を主要な評価パラメータとしてネットワークトポロジカル解析が実施されました。コア有効化合物は度順順に同定され、その後の分子ドッキング解析のリガンド候補として選ばれました。

PPIネットワーク構築
潜在的な治療標的はPPI解析のためにSTRING PPIデータベースにインポートされました(2026年1月アクセス)。種パラメータは ホモ・サピエンスに限定され、必要な最小相互作用信頼度スコアは0.9に設定され、残りのパラメータはデフォルト設定のまま維持されました。生成されたインタラクションデータはエクスポートされ、ネットワークの可視化および解析ソフトウェアでさらに可視化されました。PPIネットワークのトポロジー解析はCytoHubbaネットワークトポロジー解析プラグインを用いて行われました。度合い、中間中心性、近さ中心性を計算し、相互作用ネットワーク内のノードの重要度を評価しました。コアターゲットタンパク質は統合されたトポロジー的特性に基づいて同定され、その後の分子ドッキング解析のために選定されました。最大クリーク中心性アルゴリズムがハブターゲットのスクリーニングに採用されました。相互作用するパートナーを持たないノードは除外され、最終ネットワーク内のノード数は元のインポートされたターゲットデータセットよりも少なくなりました。

行ってケッグ
OAに対するTBFの治療標的に関連する潜在的な生物学的機能およびシグナル伝達経路解析を調査するために、Go機能濃縮解析およびKEGG経路濃縮解析を実施しました。GO解析には、生物学的プロセス(BP)、細胞成分(CC)、分子機能(MF)という3つの標準的な存在論カテゴリーが含まれ、生物学的プロセスが解釈の主な焦点とされています。

機能強化解析は、注釈・可視化・統合発見データベース(DAVID)とR統計解析ソフトウェア(バージョン4.3.1、2026年1月アクセス)を組み合わせて実施されました。濃縮結果は clusterProfiler パッケージを用いて処理・可視化され、ドットプロットとバープロット関数を使って濃縮図を作成しました。すべての標的遺伝子は ホモ・サピエンスの 背景に対して注釈が付けられました。ベンジャミニ–ホッホバーグ法を多重検定補正に適用し、修正済み P値<0.05は統計的に有意とされました。

GOおよびKEGG濃縮結果の可視化は、MicrobiomeAnalyst/MicrobiomeNetオンライン解析プラットフォーム(2026年1月アクセス)を用いて実施されました。バープロットやバブルチャートを用いて、最も有意に強化されたGO項とKEGG経路を表示しました。

分子ドッキング
主要なコアターゲットの公式遺伝子名および対応するタンパク質データバンク(PDB)識別子はタンパク質注釈データベースから取得され、その三次元結晶構造はRCSB PDB(2026年2月アクセス)からダウンロードされました。各標的タンパク質に対して、鎖Aは受容体構造として保持され、受容体調製時に冗長なタンパク質鎖、ヘテロアム、無関係な構造断片は除去されました。コア有効化合物の三次元構造はPubChemデータベース(2026年2月アクセス)から取得されました。本研究では、ケルセチンが成分-標的ネットワークにおいて最も高いトポロジー的中心性を示し、OA病因に対する保護効果が報告されているよく特徴付けられたフラボノイドであるため、代表的なドッキングリガンドとして選ばれました。

受容体および配位子の前処理は分子ドッキング準備ソフトウェアを用いて行われ、水分子の除去、水素原子の付加、プロトン化処理、ガスタイガー電荷の割り当てなどが含まれていました。その後、分子ドッキングソフトウェアバージョン1.5.7を用いて分子ドッキング解析が実施されました。グリッドボックスの寸法は、各ターゲットタンパク質の予測結合領域を包含するように調整されました。グリッドボックスは各ターゲットタンパク質のネイティブリガンド結合ポケットを中心に配置され、均一なサイズは40 Å×40 Å×40 Å、グリッド間隔は0.375 Åでした。ドッキング計算は完簜性パラメータ8で行われ、各リガンド–ターゲットペアに対して9つの候補結合構造が生成されました。予測される結合エネルギーが最も低いドッキング構造が、後の構造解釈のための代表的な結合姿勢として選ばれました。本研究では再ドッキングの検証および正対照リガンド比較は行われませんでした。すべてのドッキング手順およびパラメータ設定は、予測される結合モードの信頼性を支持するためにネットワーク薬理学研究で一般的に採用されている標準プロトコルに従っていました。ドッキングの構造は分子可視化ソフトウェアバージョン2.5.4を用いて可視化されました。結合エネルギー≤−5.0 kcal/molは安定した配位子-受容体結合の指標と考えられていました。

結果

TBFの化学組成および標的スクリーニング
スクリーニングの結果、ダングイから2基、ダンシェンから65基、吉雪騰から24基、海豊騰から21基、トゥグカオから6基、杜火から9基、威霊県から7基、向福から18基のアクティブコンポーネントが確認されました。スクリーニングされた有効化合物の詳細情報は 補足表1に記載されています。当初、合計2672の目標が回収され、その中には唐桂266、ダンシェン689、独火236、海豊騰188、吉雪騰545、トウグカオ192、威霊県102、湘福454が含まれていました。詳細な目標情報は 補足表2に示されています。重複エントリを削除した後、TBFに関連する258の非冗長ターゲットが得られました。

TBF–コンポーネント–ターゲットネットワーク
TBF–Component–Targetネットワークは、TCM薬理学データベースから取得したデータを用いて構築され、152の有効成分、258の非冗長ターゲット、8の漢方薬ノードが含まれています。これらのデータは「ネットワーク」と「タイプ」という2つのファイルに整理されていました(補足表3)。ファイルをネットワーク可視化・解析ソフトウェアにインポートした後、578ノードと3022エッジを含む包括的なネットワークが確立されました(図2)。構築されたネットワークでは、ノードはハーブ医薬品、バイオアクティブ化合物、対応する標的タンパク質を表し、エッジは化合物と標的間の予測される相互作用を表していました。ノードサイズが大きく色の濃い色が濃いほど、度数が高く、ネットワーク接続性も向上しました。ネットワークトポロジカル解析から得られた度順位に基づき、上位5つの有効化合物はケルセチン(A7-MOL000098)、ベータシトステロール(B8-MOL000358)、ルテオリン(A1-MOL000006)、ケンプフェロール(C1-MOL000422)、およびスティグマスタール(C2-MOL000449)と特定されました。

図2。TBF–コンポーネント–ターゲット相互作用ネットワーク。 TBF、有効化合物、予測標的遺伝子間の相互作用のネットワーク可視化。ノードはハーブ医薬品、有効化合物、標的タンパク質を表し、端は化合物と標的間の予測された相互作用を示します。ノードサイズが大きく色の濃い色が濃いほど、度数が高くネットワーク接続性が向上します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

OAに関連する標的情報およびTBFの潜在的な治療標的
「変形性関節症」というキーワードは4つのデータベースで検索され、OMIMから9件、GeneCardsから349件、DrugBankから32件、TTDから38件の計42件の潜在的な疾患関連ターゲットが検出されました。4つのデータベース間の目標分布を示すベン図は 図3に示されています。重複エントリーを統合・削除した結果、398件のユニークなOA関連ターゲットが取得されました。OA関連標的とTBF活性化合物関連標的の交差解析により、47の重複標的が特定され、これらはOAに対するTBFの潜在的な治療標的と考えられました。オンラインのベン解析ツールを用いて生成される対応するベン図は 図4に示されています。

図3。複数のデータベースから取得したOA関連ターゲットのベン図。 OMIM、GeneCards、DrugBank、治療ターゲットデータベース(TTD)から特定されたOA関連標的間の重複を示すベン図。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4。TBFとOAの重複標的の特定。 TBFの有効成分関連標的とOA関連標的の交差を示すベン図。重複する標的は、OAに対するTBFの潜在的な治療標的と考えられていました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

PPIネットワークの構築と解析
47の重複ターゲットのPPIネットワーク解析はPPIデータベース(図5)を用いて行われ、その後ネットワーク可視化および解析ソフトウェアで可視化されました。ネットワーク構築中、タンパク質間相互作用(PPI)を持たない孤立ターゲットを表す切断されたノードは標準的なネットワークトポロジー手順に従って除去され、39ノードと108エッジを含む洗練されたネットワークが完成しました(図6)。ノードのサイズと色の強度は度数値を反映しており、ネットワーク内でターゲットの相対的重要性を示していました。

図5。STRING PPIネットワークは重なり合う標的の対象です。 TBFとOAの重なり合うターゲットに対して、STRINGデータベースを用いて生成されたPPIネットワーク。ノードはターゲットタンパク質を表し、エッジは予測されるPPIを表します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図6。コアPPIネットワーク解析。 切断されたノードを除去した後のPPIネットワークの改良。ノードのサイズと色の強度は度数を表し、ネットワーク内のターゲットの相対的重要性を示します。JUN、RELA、IL6、MAPK1、IL10などのコアターゲットは高いネットワーク接続性を示しました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

PPIネットワークのトポロジー解析は、Degreeアルゴリズムを用いたネットワークトポロジー解析プラグインを用いてノードトポロジー特性を計算しました。学位値で順位付けされた上位10の目標は 表1に示されています。JUN、RELA、IL6、MAPK1、IL10を含む5つの上位標的が、次数値、近接中心性、ビトウィネス中心性に基づき、分子ドッキング解析のコアターゲットとして選ばれました。

OAにおけるTBFのGO生物学的機能およびKEGG経路解析
GO濃縮解析により、サイトカイン活性、転写因子結合、成長因子活性など、OAに関連するいくつかの生物学的機能が特定され、TBFが炎症、転写活性、軟骨恒常性の調節に関与する可能性を示唆しました。上位20の強化GO用語はカウント値に基づいてランク付けされ、棒グラフ(図7)で可視化されました。KEGG経路濃縮解析は、骨炎関連シグナル伝達経路に焦点を当てており、高度な糖化末端産物-進先糖化最終産物受容体シグナル伝達経路、白血介質17(IL-17)シグナル伝達経路、腫瘍壊死因子(TNF)シグナル伝達経路、T細胞受容体シグナル伝達経路など、炎症調節、軟骨細胞の異化作用、OAにおける免疫応答に関連しています。濃縮解析で特定された感染症関連経路は、本研究において直接的なOAメカニズムとは解釈されませんでした。KEGG経路解析は統計解析ソフトウェアを用いてバブルプロットの可視化を生成しました(図8)。合計20本の有意に濃縮されたシグナル伝達経路が同定されました。これらの結果は、TBFが多標的薬理学的メカニズムを通じてOA関連の生物学的プロセスやシグナル伝達経路を調節する可能性を示唆しました。

図7。潜在的な治療標的のGo濃縮解析。 TBFのOAに対する潜在的な治療標的に関連する上位20の濃縮GO用語を示す棒状図。強化された用語には、生物学的プロセス、分子機能、炎症、転写調節、軟骨恒常性に関連する細胞成分が含まれます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図8。潜在的な治療標的のKEGG経路濃縮解析。 骨炎に対するTBFの潜在的な治療標的に関連する上部濃縮KEGGシグナル伝達経路のバブルプロット可視化。バブルサイズは濃縮遺伝子の数を示し、色の強さは濃縮の有意度を反映します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

分子ドッキング検証
TBFの主要活性化合物とPPIネットワークから特定されたコアターゲット間の潜在的な結合相互作用をさらに調査するため、成分–ターゲットネットワークで最上位の活性化合物であるケルセチンと、5つのコアターゲットであるJUN、RELA、IL6、MAPK1、IL10の間で分子ドッキング解析が行われました(表2)。ケルセチンは成分–標的ネットワークにおいて最も高い位相的重要性を示し、抗炎症活性および軟骨代謝調節に関連する代表的なバイオアクティブ化合物として広く報告されています^18,19。予測された結合エネルギーは、JUNで−8.4 kcal/mol、RELAが−7.6 kcal/mol、IL6が−6.9 kcal/mol、MAPK1およびIL10で−6.7 kcal/molであり、ケルセチンと選択されたコアターゲット間の結合親和性が良好であることを示しました。リガンド–受容体結合の立体構造の可視化は、分子相互作用の可能性の解釈を容易にしました。分子可視化ソフトウェアバージョン2.5.4を用いて、ケルセチンと5つのコアターゲット間の最適なドッキング構造を可視化しました(図9–13)。

図9。JUNによるケルセチンの分子ドッキングモデル(PDB ID: 1JNM)。 JUNに結合したケルセチンの三次元分子ドッキング構象。ケルセチンはJUNのbZIPドメイン内で結合し、構造的相補性を持つ疎水結合空洞に適合すると予測されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図10。RELAを用いたケルセチンの分子ドッキングモデル(PDB ID: 7LEU)。 RELAに結合したケルセチンの三次元分子ドッキング立体構造。ケルセチンは非共有結合相互作用を通じてRELAのRelホモロジードメインの活性領域と相互作用すると予測されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図11。IL6(PDB ID: 1ALU)を用いたケルセチンの分子ドッキングモデル。 IL6に結合したケルセチンの三次元分子ドッキング立体構造。ケルセチンはIL6の保存された受容体結合溝を占有すると予測されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図12。MAPK1を用いたケルセチンの分子ドッキングモデル(PDB ID: 6D5Y)。 MAPK1に結合したケルセチンの三次元分子ドッキング立体構造。ケルセチンはMAPK1のATP結合ポケットに位置すると予測されており、キナーゼ関連の相互作用の可能性を示唆しました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図13。IL10とクエルセチンの分子ドッキングモデル(PDB ID: 1ILK)。 IL10に結合したケルセチンの三次元分子ドッキングコンフォメーション。ケルセチンはIL10の二量体界面領域付近で相互作用すると予測され、タンパク質複合体の安定化に寄与する可能性があります。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

データの利用可能性:
本研究の発見を支持するすべてのデータは、原稿、表、図、補足資料に含まれています。 補足表1 はトンビ式(TBF)のスクリーニング済み有効化合物を含み、 補足表2 は対応する予測標的情報、補 足表3 はネットワーク構築およびトポロジカル解析に使用されるネットワーク符号化および相互作用データを示しています。

ジーン	タンパク質名	学位	近接性中心性	中間中心性
ジュン	転写因子AP-1	18	0.58	0.22
本当に	転写因子p65	15	0.56	0.15
IL6	インターロイキン6	14	0.59	0.33
MAPK1	ミトゲン活性化タンパク質キナーゼ1	13	0.54	0.16
IL10	インターロイキン10	10	0.47	0.12
ESR1	エストロゲン受容体	10	0.44	0.03
IL2	インターロイキン2	9	0.53	0.05
AKT1	RAC-αセリン/スレオニンタンパク質キナーゼ	9	0.44	0.04
MMP1	マトリックスメタロペプチダーゼ1	8	0.44	0.03
MMP2	マトリックスメタロペプチダーゼ2	8	0.44	0.03

表1:PPIネットワークにおけるコアターゲットのトポロジーパラメータ。 PPIネットワーク解析で特定された主要ターゲットのトポロジカルパラメータ。度合い、近接性中心性、および中間性の中心性を計算し、結節の重要度を評価し、骨孔炎に対するTBFに関連する主要な治療標的を特定しました。相互作用ネットワーク内で、度数や中心性の高いターゲットはより重要と考えられていました。

ターゲット	PDB ID	アクティブサイト座標 (X、Y、Z)	配位子	結合親和性 (カロリー/モルカロリー)
ジュン	1JNM	X = 10.201;Y = 0.493;Z = 19.492	ケルセチン	−8.4
本当に	7LEU	X = 1.717;Y = 23.889;Z = −0.778		−7.6
IL6	1ALU	X = 2.599;Y = −20.016;Z = 8.749		−6.9
MAPK1	6D5Y	X = 7.052;Y = 12.800;Z = 20.749		−6.7
IL10	1ILK	X = 17.836;Y = 46.443;Z = 38.685		−6.7

表2:ケルセチンとコア標的タンパク質間の分子ドッキングパラメータおよび結合親和性。 ケルセチンと選択されたコアターゲットタンパク質であるJUN、RELA、IL6、MAPK1、IL10との分子ドッキング結果が見られます。この表は、タンパク質データバンク(PDB)識別子、ドッキング計算に使用されるアクティブサイトグリッドセンター座標、分子ドッキング解析から得られる予測結合親和度値を示しています。結合エネルギー値が低いほど、予測されるリガンド–受容体結合親和性が強いことを示します。

補足表1:TBFから特定された有効化合物。 TBFからスクリーニングされた有効化合物の詳細情報、化合物名、分子識別子、OB値、DL値、対応するハーブ源などが含まれます。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表2:TBFの有効化合物に対応する予測標的。 標的正規化および重複除去後に得られた標準化されたヒト遺伝子記号を含む、TBFのスクリーニング活性化合物に対応する予測タンパク質標的の包括的なリスト。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表3:TBF–コンポーネント–ターゲットネットワークのネットワーク符号化情報。 TBFコンポーネント–ターゲット相互作用ネットワークの構築に用いられる詳細なコーディング情報、分子識別子、ターゲット情報、ネットワーク関係、ネットワークトポロジー解析に用いられるノード分類データなどが含まれます。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

本研究ではネットワーク薬理学および分子ドッキング手法を用いて、TBFがOAに対して持つ潜在的なメカニズムを調査しました。分析された主な漢薬には、当貴、丹神、吉雪騰、海風騰、吐口草、独火、威霊仙、香福が含まれていました。過去の研究では、ダンギ(Angelica sinensis Radix)が、軟骨変性、軟骨下骨硬化症、異常歩行、内側半月板モデルの不安定化における膝の腫れなど、OA関連の病理学的変化を緩和する可能性があることが示されています²⁰。IL-1β誘導型OA細胞モデルでは、Dangguiは活性酸素種の蓄積を減少させ、スーパーオキシドジムターゼやグルタチオン²¹を含む抗酸化酵素の活性を高めました。サルビア・ミルティオリザの有効成分であるダンシェニンジオンIIAは、軟骨の変性を緩和し、軟骨下骨の再構築恒常性を回復し、OAマウスモデルにおける異常血管新生の抑制に効果があると報告されています²²。さらに、S. miltiorrhiza由来の成分は酸化ストレスや骨代謝を調節する可能性がある^23,24。スパソロブス・スベレクタスダンは軟骨代謝およびOAの進行に関連するPI3K/Akt/mTORおよびRas/Raf/MAPKシグナル伝達経路²⁵を調節することが報告されています。S. suberectus Dunnの抽出物は炎症促進ケモカインの産生も抑制します²⁶。さらに、インパチェンス・バルサミナで報告されている抗炎症および抗酸化活性は、慢性炎症や酸化ストレスが軟骨^の変性に寄与するため、OAの病因に関連している可能性があります。ラディックス・アンジェリカエ・ビセラタエは血行の改善や関節炎関連症状の緩和とも関連しています(^28,29)。ジシュエテン(Spatholobus suberectus Dunn)、ハイフェンテン(Caulis Piperis Kadsurae)、シャンフー(Cyperi Rhizoma)のOAにおける治療効果の可能性については限定的な研究が行われています。

PPIネットワークに基づく計算予測により、TBFは炎症反応の調節や関節軟骨の保護を通じてOAに対して治療効果を発揮する可能性が示唆されましたが、これらの予測にはさらなる実験的検証が必要です。PPIネットワークで比較的高度のコアターゲットには、JUN、RELA、IL6、MAPK1、IL10が含まれていました。過去の研究では、JUNが軟骨細胞の老化およびOAの進行と関連していることが示されています。JunB/Jun二重変異マウスは、関節組織に炎症浸潤を示し、骨破壊と骨膜炎を伴^います。変形性関節症軟骨および滑膜のトランスクリプトミクス解析でもJUN発現の減少が示されています³¹。さらに、前十字靭帯切断誘導型OAラットモデルおよび老化軟骨球³²でもJUNタンパク質発現の低下が観察されています。先行研究では、JUN関連シグナル伝達がOA軟骨細胞における軟骨変性、アポトーシス、オートファジー、細胞外マトリックス代謝を調節する可能性が示唆されています。³³。これまでの研究では、トランスファーRNA由来断片がRELA関連シグナル伝達経路を通じて関節軟骨細胞の増殖と生存を調節することが示されています³⁴。さらに、間葉質間質細胞におけるSox9遺伝子のアップレギュレーションとRELA発現の阻害が組み合わさることで、軟骨生成および免疫調節能力が向上し、OAの進行が遅くなった実験モデル³⁵。これらの発見は、現在の計算解析で特定されたJUNおよびRELA関連シグナル伝達経路の潜在的な関連性を支持しています。

IL6はOAにおける主要な炎症メディエーターであり、軟骨代謝において分解と修復過程の両方に影響を与える重要な役割を果たします。慢性的な低度炎症状態では、IL6の上昇が軟骨細胞の老化、軟骨マトリックス合成の低下、軟骨恒常性の乱に寄与します³⁶。過去の研究では、IL6受容体/JAK2シグナル伝達が老齢細胞アポトーシスの調節に関与していることが示されており、老齢細胞の標的的除去はOAの進行を緩和する可能性がある³⁷。さらに、Li QらはmiR-186-5pのアップレギュレーションがIL-1β刺激の軟骨細胞における炎症反応を調節し、miR-186-5pの阻害はMAPK1発現の強化によりOAの進行を緩和したと報告しました³⁸。これらの発見は、本計算解析で特定されたIL6およびMAPK1関連シグナル伝達経路の関与の可能性を支持しています。

IL10は軟骨の恒常性に保護的な役割を果たし、軟骨微小環境の維持に寄与する可能性があります。これまでの研究では、IL10がミトコンドリアのアポトーシス経路の調節、カスパーゼ活性の低下、Bax/Bcl-2比率の調節を通じて軟骨細胞アポトーシスを抑制することが示されています³⁹。さらに、IL10は圧縮された関節軟^{骨モデルにおいて}、細胞外マトリックス分解の減少およびマトリック分解関連因子(MMP3、MMP13、ADAMTS4、誘導性一酸化窒素シンターゼなど)の発現低下と関連しています。本研究におけるKEGG経路濃縮解析は、IL-17、TNF、および低酸素誘導因子1(HIF-1)シグナル伝達経路が、TBFのOAに対する治療効果の予測と関連している可能性を示唆しましたが、これらの計算的予測には実験的な確認が必要です。過去の研究では、IL-17が炎症反応や滑膜細胞活動の調節を通じてOAの進行に寄与することが示されています^41,42。IL-17発現の増加は膝のOA^の疾患重症度とも正の相関を示しています。TNF-αは、OA関連の炎症、痛み、軟骨変性に関連する主要な炎症メディエーターであり、TNF-αシグナル伝達の阻害は疾患の進行を緩和^{する可能性があります。}さらに、HIF-1αは軟骨球の低酸素代謝、細胞外マトリックス調節、滑膜炎症、軟骨下骨の再構築において重要な役割を果たし^{ています。}これまでの研究では、HIF-1α関連シグナル伝達の阻害が軟骨細胞の機能を保護し軟骨変性を抑制する可能性も示唆されています⁴⁶。これらの発見は、現在の計算的濃縮解析で特定されたシグナル伝達経路と一致しています。

この サイリコ 研究にはいくつかの重要な制限があります。第一に、分析は公開されているデータベースに依存しており、ハーブ化合物や標的注釈に関する不完全または偏った情報が含まれている可能性があります。さらに、計算的ターゲット予測手法には本質的な不確実性が伴い、本研究で特定された予測相互作用は実験的検証が必要です。分子ドッキング解析は、直接的な生理学的または薬理学的活性ではなく、理論的な結合ポテンシャルを反映しています。さらに、計算予測を検証するための in vitro やin vivo実験は行われていません。ハーブの用量、薬剤動態、そして結合された配合の全体的な生体利用能などの要素も評価されませんでした。したがって、本研究から導き出されたすべての結論は予測的とみなされ、さらなる実験的確認が必要です。

本研究はネットワーク薬理学および分子ドッキング解析に基づき、TBFのOAに対する潜在的なメカニズムを調査するための予測的枠組みを提供します。この結果は、TBFが8つの成分から得られる有効化合物間の相互作用を通じて複数のOA関連標的を調節する可能性を示唆しました。同定された標的は、炎症調節、脂質代謝、低酸素関連シグナル伝達に関連する生物学的プロセスおよびシグナル伝達経路(IL-17、TNF、HIF-1経路)に豊富化していました。分子ドッキング解析により、ケルセチンとコアターゲットであるJUN、RELA、IL6、MAPK1、IL10との間で良好な予測結合親和性が示されました。これらの発見を総合すると、TBFはOAに対して多成分かつ多標的の調節効果を発揮する可能性を示唆しています。本研究はまた、今後の機構的研究やOA研究におけるTCM式の実験的検証のための理論的戦略と方法論的枠組みを提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AutoDockTools	ソフトウェア	バージョン 1.5.7; Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/
AutoDock Vina	ソフトウェア	バージョン 1.5.7; Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/
barplot function	R の可視化機能	clusterProfiler パッケージ	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
clusterProfiler	R パッケージ	エンリッチメント解析用 Bioconductor パッケージ	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
CytoHubba	プラグイン	Cytoscape 3.10.2 と互換性あり	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba
Cytoscape	ソフトウェア	バージョン 3.10.2; Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/
DAVID	データベース	アノテーション、可視化、統合発見データベース	https://david.ncifcrf.gov/
dotplot function	R の可視化機能	clusterProfiler パッケージ	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
DrugBank	データベース	アルバータ大学	https://go.drugbank.com/
GeneCards	データベース	GeneCards Suite	https://www.genecards.org/
MicrobiomeAnalyst / MicrobiomeNet	オンラインプラットフォーム	オンラインエンリッチメント可視化プラットフォーム	https://microbiomenet.com/
OMIM	データベース	Online Mendelian Inheritance in Man	https://www.omim.org/
PDB	データベース	RCSB タンパク質データバンク	https://www.rcsb.org/
PubChem	データベース	国立生物工学情報センター	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
PyMOL	ソフトウェア	バージョン 2.5.4	https://pymol.org/
R	ソフトウェア	バージョン 4.3.1; R 財団統計計算	https://www.r-project.org/
STRING	データベース	相互作用遺伝子/タンパク質の検索ツール	https://cn.string-db.org/
TCMSP	データベース	伝統的中国医学システム薬理学データベースと分析プラットフォーム	http://tcmspw.com/tcmsp.php
TTD	データベース	治療標的データベース	https://db.idrblab.net/ttd/
UniProt	データベース	ユニバーサルタンパク質リソース	https://www.uniprot.org/
Venny	ソフトウェア	バージョン 2.1.0	https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html