COPD関連のPANopsosis遺伝子は、肺扁平上皮がんの予後および化学療法感受性を予測する

サマリー

本研究は、公開されたトランスクリプトミックデータからCOPD関連のPANoptosis遺伝子セットを導き出し、肺扁平上皮がんのコホートに適用して予後シグネチャーを遡って評価します。このシグネチャーは免疫浸潤および計算的に予測された薬剤感受性と関連し、将来のリスク層別研究のための仮説生成候補バイオマーカーを提供しました。

要約

慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、進行性の炎症性疾患であり、肺扁平上皮癌(LUSC)のリスクを高めます。PANopsosisはピロプトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシスを統合しますが、COPD関連PANopsosis遺伝子とLUSC予後との関係は依然として不明です。本研究では、まずCOPD関連の差異発現遺伝子をGSE57148から導出し、COPDの肺組織と正常な肺組織を比較し、これらの遺伝子を厳選されたPANopsosis関連遺伝子リストと交差させました。得られた遺伝子セットはTCGA-LUSC、GSE30219、GSE37745に適用され、患者レベルのCOPD併存疾患が確認されていないLUSCコホートとして解析されました。PANopsosisの遺伝子発現パターンを評価し、教師なしクラスタリングを行い、クラスター間の免疫浸潤の違いを特徴づけ、外部検証を用いた予後署名を構築しました。組織タイプ間で発現に差異を持つ38のCOPD関連PANopsosis遺伝子を特定しました。2つの分子サブタイプは、異なる免疫構造、免疫チェックポイント発現、および総合生存率を示しました。単変量CoxおよびLASSO Cox回帰によって選択された12遺伝子リスクモデルは、患者を高リスク群と低リスク群に階層化し、TCGA-LUSC、GSE30219、GSE37745コホートで中程度から中等度の予測性能を示しました。また、高リスク患者は複数の薬剤で計算予測IC50値が高く、実験的に確定された化学療法耐性ではなく、予測された薬剤感受性が低いことを示唆しています。これらの発見は、COPD関連のPANopsosis遺伝子が予後、免疫微小環境の再構築、LUSCにおける薬剤感受性の予測に関連しており、将来の検証のための仮説生成バイオマーカーを提供する可能性があることを示しています。

概要

肺扁平上皮癌(LUSC)は、非小細胞肺がん(NSCLC)の亜型であり、肺内の扁平上皮細胞の異常な増殖を特徴としています。手術、プラチナ系化学療法、免疫療法、放射線療法、そして選択された分子誘導戦略の進歩にもかかわらず、LUSCの全体的な治癒率は依然として低いままであり、特に進行期疾患の患者において顕著です^1,2。治療効果の最適化は、腫瘍の顕著な異質性と多重耐性機構のため依然として困難です。^3,4。

プログラム細胞死(PCD)は、組織の恒常性維持と全体的な健康維持に不可欠です。PANopsosisは、ピロプトーシス、アポトーシス、ネクロトーシス^5,6,7の特徴を統合した特定の協調炎症性細胞死プログラムです。PANoptosome複合体は、メラノーマに欠如する上流感知およびシグナル伝達分子(AIM2)、Z-DNA結合タンパク質1(ZBP1)、受容体相互作用セリン/スレオニンタンパク質キナーゼ1(RIPK1)などで構成されており、これらは特定の刺激を感知し、PANoptosomeの組み立てを促し、複数のPCD^経路を活性化できます。

ミトゲン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)経路活性を含む腫瘍原シグナル伝達の変化は、LUSCの異質性と^{治療抵抗性}に寄与します9。しかし、LUSCの標的治療法は肺腺癌に比べて限られており、多くの患者は依然として化学療法、免疫療法、放射線療法、または組み合わせ治療を受けています¹⁰。調節された細胞死の回避が治療抵抗性の一つのメカニズムであるため、PANoposis関連経路の協調解析はLUSC¹¹における治療脆弱性に関する仮説の形成に役立つ可能性があります。

後天性耐性はLUSCにおける治療失敗の主な原因です。この耐性は遺伝子変異、経路の異常、細胞死シグナル伝達の変化、腫瘍微小環境の変化と関連しています¹²。研究では、アポトーシスが多くの抗がん薬の有効性に寄与することが示されています¹³。したがって、アポトーシス、ピロプトーシス、ネクロトーシスに関与する遺伝子は、治療反応に関連する細胞死調節状態を示す可能性があります。しかし、本研究は計算的であり、これらの遺伝子がPANopsosis 14,15,16に対する耐性を引き起こすかどうかを直接検証しているわけではありません。

本研究では、アポトーシス、ピロプトーシス、ネクロプトーシス、およびPANポトーシス関連文献17,18,19,20,21から選出された遺伝子を「PANoposis関連遺伝子」という運用用語で用います。この用語は、COPD関連LUSCにおける実験的に証明された耐性機能ではなく、経路関連を示します。COPD関連のトランスクリプトム変化をこのPANopsosis遺伝子セットと統合することで、公的LUSCコホートにおける予後、免疫特徴、薬剤感受性の予測に関連する候補遺伝子および発現パターンの同定を目指しました。

慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、気道閉塞と肺機能の低下を特徴とする慢性肺疾患であり、LUSC²²の重要なリスク因子です。COPD患者の肺の慢性炎症環境は、がんの発生に好ましい条件を提供する可能性があります^23,24。COPDはまた、呼吸機能障害が治療選択肢を制限するため、治療の選択や忍容性に影響を与える可能性があります^(25–27)。 さらに、COPD関連の炎症は腫瘍免疫微小環境を変化させ、免疫療法への反応に影響を与える可能性があります^。 本研究は臨床的に確認されたCOPD併存症のLUSC症例を直接解析していません。代わりに、非悪性のCOPD肺組織からCOPD関連の遺伝子シグネチャーを導き出し、その予後および免疫関連を公的なLUSCコホートで評価しました。

プロトコル

この研究は公開されている非特定データセットのみを使用し、直接的な人間や動物実験は含まれていませんでした。したがって、追加の倫理委員会の承認やインフォームド・コンセントは必要ありませんでした。

データのダウンロードと処理
肺扁平上皮がん(LUSC)のRNAシーケンスデータおよび対応する臨床情報は、TCGA-LUSCプロジェクトのゲノミックデータコモンズデータポータルを通じて、がんゲノムアトラス(TCGA)データベースから取得されました。本研究で使用されたTCGA-LUSC表現行列はFPKM値に基づいていました。遺伝子発現値は後続解析前に変換・正規化されました。臨床変数には、年齢、性別、腫瘍の病態段階、グレード、生存期間、利用可能な生存状況が含まれていました。合計489件のTCGA-LUSC症例が最初に抽出され、完全な発現プロファイルおよび全生存期間情報を持つ381人の患者が予後モデル構築および内部評価に含まれました。

独立した検証データセットは2026年1月3日にGene Expression Omnibus(GEO)データベースからダウンロードされました。GSE30219 GPL570プラットフォームを基にし、発現および総合生存情報を含む307名のLUSC患者を対象としました。GSE37745もGPL570プラットフォームを基にしており、発現および総生存情報を含む196名のLUSC患者を対象としました。GSE57148はGPL11154プラットフォームを基に、慢性閉塞性肺疾患(COPD)患者の正常肺組織91点と肺組織98点、合計189サンプルを含みました。GSE57148はCOPDに関連する差異発現遺伝子の同定に用いられ、GSE30219とGSE37745は独立した外部検証コホートとして用いられました。

GEOデータセットでは、対応するRアノテーションパッケージとプラットフォームアノテーションファイルを用いてプローブ注釈が行われました。プローブ識別子は公式の遺伝子シンボルに変換されました。複数のプローブが同じ遺伝子にマッピングされた場合、平均発現値が最も高いプローブがその遺伝子を代表するために保持されました。遺伝子・シンボルマッチング後、検証データセットでモデル遺伝子の欠落は検出されませんでした。TCGA-LUSC、GSE30219、GSE37745は、患者レベルのCOPD併存症の確認が本分析に用いられた注釈で確認されなかったため、一般LUSCコホートとして分析されました。

TCGAおよびGEOデータセットは異なる発現プラットフォームで生成されたため、クロスプラットフォーム正規化およびバッチ効果補正は標準的なRベースの前処理手法でモデル適用が行われました。リスクモデルはTCGA-LUSCコホートで訓練され、すべてのコホートを直接統合するのではなく、各外部GEOコホートで独立して評価されました。差別表現解析はlimma Rパッケージを使用して実施されました。GSE57148におけるCOPD関連の差異発現遺伝子は|log2FC|>0.263、P<0.05です。このlog2FC閾値は約1.2倍の変化に相当し、潜在的に関連するPANopsosis関連遺伝子を保持するための探索的スクリーニング基準として用いられました。これまでに発表されたアポトーシス、ピロプトーシス、ネクロプトーシス、PANポトーシス関連研究から、合計277個のPANopsosis関連遺伝子が選集され、 補足表1に掲載されています。

遺伝子の機能豊化解析
選択されたCOPD関連PANopsosis遺伝子の機能的含意を明確にするため、clusterProfiler Rパッケージおよび組織を用いてGene Ontology(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)の濃縮解析が実施されました。Hs.eg.db注釈パッケージ。GOの生物学的プロセス、細胞成分、分子機能のカテゴリーが評価されました。選択遺伝子に関連するシグナル伝達経路を特定するためにKEGG経路の濃縮解析が実施されました。P値は、該当する場合ベンジャミニ・ホッホバーグ偽発見率法を用いて複数回の検証で調整されました。この探索的解析では、P < 0.05の濃縮項が統計的に有意と考えられました。濃縮プロットはggplot2を用いて生成されました。

PANopsosis関連遺伝子発現パターンの教師なしクラスタリング解析
LUSCにおけるPANopsosis関連遺伝子発現に関連する分子異質性を調査するため、ConsensusClusterPlus Rパッケージを用いてコンセンサスクラスタリングを実施しました。LUSCサンプルは生存関連PANopsosis遺伝子の発現プロファイルに基づいてクラスタリングされました。階層的クラスタリングはピアソン相関距離を用いて適用されました。クラスタの最大数は6つに設定され、クラスタリングの堅牢性を評価するために1,000回の再サンプリングが行われました。最適なクラスタ数は、コンセンサス行列、累積分布関数曲線、デルタ面積プロット、そして得られたグループの生物学的解釈可能性を評価して決定されました。これらの基準に基づき、k = 2が選ばれ、下流解析が行われました。両分子群間の生存率差は、Kaplan-Meier解析およびログランク検定を用いて評価されました。

サブタイプ間の免疫微小環境の違いの分析
分子サブタイプ間の免疫微小環境の特徴を比較するために、LM22白血球シグネチャーマトリックスを用いたCIBERSORTのデコンボリューションアルゴリズムを用いて免疫細胞浸透を推定しました。解析は e1071 および preprocessCore パッケージを用いて R で実施されました。CIBERSORT置換P値を記録し、デコンボリューション推定の信頼性を評価しました。この研究は探索的で遡及的トランスクリプトムデータに基づいていたため、免疫細胞間の違いは直接的な細胞測定ではなく、計算的に推定された免疫浸潤パターンとして解釈されました。

ESTIMATEアルゴリズムを用いて、各腫瘍サンプルの間質スコア、免疫スコア、ESTIMATEスコア、腫瘍純度を算出しました。GSVAは選択された遺伝子セットに基づく経路レベルの濃縮スコアを推定するために適用されました。免疫細胞分画、免疫チェックポイント遺伝子、HLAファミリー遺伝子、ESTIMATE由来スコアのグループごとの差異を非パラメトリック検定を用いて評価しました。複数の免疫関連比較では、適切な場合はベンジャミニ・ホッホバーグ補正を適用しました。名目上のP値を用いて報告された解析は探索的と解釈されました。スピアマンランク相関解析を用いて遺伝子発現と免疫関連マーカーの関連性を評価し、該当する場合は相関係数とP値の両方を報告しました。HLA転写物の違いは、抗原提示能力の直接的な機能的証拠ではなく、抗原提示に関連する転写変化として解釈されました。

PANopsosis関連遺伝子に関連する予後シグネチャーの確立
完全な発現プロファイルと全体生存情報を含んだTCGA-LUSCコホートが予後モデル構築に用いられました。最初に採取された489例のTCGA-LUSC症例のうち、全生存期間データが完全な381例が予後解析に含まれました。これらの患者は、7:3の比率でトレーニングコホートと内部検査コホートに無作為に分けられました。生存状況に応じて階層化されたランダム化を実施し、トレーニングコホートとテストコホート間の生存イベントの分布を比較できるようにしました。

トレーニングコホートでは、まず単変量Cox比例ハザード回帰を用いて、各候補PANポトーシス関連遺伝子と全生存期間との関連性を評価しました。Pが0.05<遺伝子は予後候補遺伝子とみなされ、その後glmnet Rパッケージを用いてLASSO Cox回帰分析に入力されました。最適なペナルティパラメータを選定し、過学習を低減するために10折の交差検証を用いました。LASSO Cox回帰係数と対応する正規化遺伝子発現値に基づき、各患者ごとに以下の式を用いて個別化リスクスコアが計算されました。

リスクスコア = Σ(coefi と Xi) ×

ここでcoefiは選択された各遺伝子の回帰係数、Xiは対応する遺伝子の正規化発現値を表します。最終的な予後モデルには12の遺伝子が含まれていました:GSDMD、IL18、NFKBIA、PIK3CA、IL1B、BIRC3、MCL1、PSMB10、LMNA、CFLAR、IL1R1、AKT3です。係数に基づくリスクスコアの完全な方程式は 補足表2に示されています。

トレーニングコホートの中央値リスクスコアを基準に、患者を高リスク群と低リスク群に分類しました。同じリスクスコアの計算式が内部テストコホートおよび外部検証コホートGSE30219およびGSE37745にも適用されました。モデル性能を評価するために、Kaplan-Meier生存分析、対数ランク検定、時間依存受信者動作特性曲線解析を用いました。検証データセットはマイクロアレイプラットフォームを用いて作成され、COPD併存症の確認注釈が含まれていなかったため、外部検証は臨床的に確認されたCOPD併存LUSC患者への検証ではなく、独立したLUSCコホートにおける後ろ向き評価と解釈されました。

薬物感受性予測解析
薬剤感受性は、がんにおける薬剤感受性ゲノムデータベースの薬理ゲノム参照データに基づき、腫瘍遺伝子発現プロファイルからの薬物反応を予測するpRRophetic Rパッケージを用いて推定されました。各患者サンプルに対して半最大阻害濃度(IC50)の予測値を算出しました。式行列はpRRophetic入力要件に従って処理され、バッチ効果補正は標準のpRRophetic互換ワークフローで行われました。予測されたIC50値はpROphetic出力スケールで報告されました。

ソラフェニブ、ゲフィチニブ、ブレオマイシン、ボスチニブ、エトポサイド、レナリドマイド、カンプトテシン、メトトレキサートを含む8つの候補薬剤が、探索的薬剤感受性パネルとして評価されました。高リスク群と低リスク群間の予測IC50値の差はWilcoxonランク-総和検定を用いて比較しました。これらの結果は、臨床化学療法の反応測定や実験的に確認された薬剤耐性ではなく、計算的な薬剤感受性推定値として解釈されました。

統計解析
すべての統計解析はRソフトウェアを使用して実施されました。2つのグループ間の連続変数はウィルコクソンランク-総和検定で比較され、2つ以上のグループ間の比較は適宜クルスカル・ウォリス検定を用いました。総生存期間が主要生存評価項目として定義されました。カプラン・マイヤー生存曲線を作成し、グループ間の生存差を比較し、統計的有意性は対数ランク検定を用いて評価しました。単変量と多変量

Cox比例ハザード回帰分析を用いて、臨床変数、リスク群、全生存期間間の予後関連性を評価しました。多変量Cox回帰において、臨床的関連性または統計的有意性を持つ変数が検討されました。比例的危険の仮定はシェーンフェルド残差を用いて評価されました。欠落した臨床変数は、Cox回帰およびノモグラム構築において完全症例解析を用いて処理しました。多変量モデリングの前に臨床変数間の共線性が評価されました。

時間依存性ROC曲線を用いて、1年、3年、5年の全生存期間におけるリスクモデルの予測性能を評価しました。多変量モデルに保持された変数または十分な臨床利用可能性を持つ変数を用いてノモグラムを構築しました。比較プロットを用いて予測された生存確率と観察された生存確率を比較しました。意思決定曲線解析は、選択された閾値確率における潜在的な純利益の探索的評価として実施されました。

スピアマン順位相関解析を用いて、遺伝子発現と免疫関連特徴との関連性を評価しました。該当する場合は相関係数とP値が報告されました。複数比較の場合、適切な場合はベンジャミニ・ホッホバーグ偽発見率補正を適用しました。名目上のP値を用いた分析は探索的とみなされました。両側P値<0.05は統計的に有意とみなされました。

結果

LUSCにおけるPANopsosis関連遺伝子の発現パターンと機能注釈
GSE57148のトランスクリプトミクスデータ(正常な肺組織91件、COPD肺組織98件を含む)を解析し、COPD関連の差異発現遺伝子を特定しました。合計2,182個のCOPD関連遺伝子が同定され、そのうち38個の遺伝子が厳選されたPANopsosis関連遺伝子セットと重複しました(図1A および1B)。これら38遺伝子の染色体分布は 図1Cに示されています。その後、TCGA-LUSC腫瘍および正常組織で発現パターンを評価し、複数の遺伝子で腫瘍と正常サンプル間で有意な発現差異が認められました(図1D)。タンパク質間相互作用解析により、STAT3、NFKBIA、MAPK3、IL1B、MTORなど、いくつかの高度に連結した遺伝子が同定されました(

ディスカッション

COPDとLUSCは、炎症性、喫煙関連、気道損傷に関連する病原性プロセスを通じて臨床的および生物学的に関連しています。免疫チェックポイント阻害薬やその他の全身療法はLUSCの治療選択肢を改善しましたが、腫瘍の異質性、不完全なバイオマーカー層化、治療抵抗性のため、多くの患者にとって持続的な利益は限定的です。31,32,33。

PANopsosisは、共有シグナル伝達機構を通じてピロプトーシス、アポトーシス、ネクロトーシスを統合しているため、細胞死制御の解釈に有用な枠組み^{を提供します。}本研究では、COPD関連のPANopsosis遺伝子が公的LUSCコホートにおいて生存の異質性、サブタイプ層化、免疫微小環境の特徴と関連しています。分析は後ろ向きかつ計算的であったため、これらの発見は遺伝子...

材料

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この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AnnotationDbi Rパッケージ	Bioconductor	N/A	遺伝子アノテーションと識別子の変換に使用されます。ソース: https://bioconductor.org/packages/AnnotationDbi/
caret Rパッケージ	CRAN	N/A	TCGA-LUSCコホートを再現可能な分層ランダム分割で訓練とテストのサブセットに分けるのに使用されます。ソース: https://cran.r-project.org/package=caret
CIBERSORTアルゴリズム	CIBERSORTリソース	N/A	LM22シグネチャーマトリックスを用いた免疫細胞のデコンボリューションに使用されます。アクセスとライセンスは元の提供者に依存します。ソース: https://cibersortx.stanford.edu/
clusterProfiler Rパッケージ	Bioconductor	N/A	GOおよびKEGGエンリッチメント分析に使用されます。ソース: https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
ConsensusClusterPlus Rパッケージ	Bioconductor	N/A	PANoptosisに関連する遺伝子発現パターンのコンセンサスクラスタリングに使用されます。ソース: https://bioconductor.org/packages/ConsensusClusterPlus/
e1071 Rパッケージ	CRAN	N/A	CIBERSORTベースのデコンボリューション分析の依存関係として使用されます。ソース: https://cran.r-project.org/package=e1071
edgeR Rパッケージ	Bioconductor	N/A	カウントベースの正規化が必要なRNA-seqカウント処理に使用されます。ソース: https://bioconductor.org/packages/edgeR/
ESTIMATE Rパッケージ	MDアンダーソンがんセンター/ SourceForge	N/A	間質スコア、免疫スコア、ESTIMATEスコア、腫瘍純度を計算するのに使用されます。ソース: https://sourceforge.net/projects/estimateproject/
ゲノムデータコモンズデータポータル	国立がん研究所	TCGA-LUSC	TCGA-LUSC RNAシーケンスデータと臨床アノテーションのソース。ソース: https://portal.gdc.cancer.gov/
がんにおける薬物感受性のゲノミクスデータベース	GDSCプロジェクト	N/A	pRRophetic互換の参照データを通じて使用される薬物反応の参照データセット。ソース: https://www.cancerrxgene.org/
GEOquery Rパッケージ	Bioconductor	N/A	GEOシリーズマトリックスファイルのダウンロードと解析に使用されます。ソース: https://bioconductor.org/packages/GEOquery/
ggplot2 Rパッケージ	CRAN	N/A	可視化と図の生成に使用されます。ソース: https://cran.r-project.org/package=ggplot2
ggpubr Rパッケージ	CRAN	N/A	出版スタイルのプロットとグループ比較に使用されます。ソース: https://cran.r-project.org/package=ggpubr
glmnet Rパッケージ	CRAN	N/A	LASSO Cox回帰と予後モデルの構築に使用されます。ソース: https://cran.r-project.org/package=glmnet
GSE30219データセット	NCBI遺伝子発現オムニバス	GSE30219	発現と生存情報を持つ外部LUSC検証コホート。ソース: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE30219
GSE37745データセット	NCBI遺伝子発現オムニバス	GSE37745	発現と生存情報を持つ外部LUSC検証コホート。ソース: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE37745
GSE57148データセット	NCBI遺伝子発現オムニバス	GSE57148	COPD関連の差異発現遺伝子を導出するために使用されるCOPD対正常肺のトランスクリプトームデータセット。ソース: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE57148
limma Rパッケージ	Bioconductor	N/A	差異発現分析に使用されます。ソース: https://bioconductor.org/packages/limma/
org.Hs.eg.dbアノテーションパッケージ	Bioconductor	N/A	エンリッチメント分析におけるヒト遺伝子アノテーションに使用されます。ソース: https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/
preprocessCore Rパッケージ	Bioconductor	N/A	発現の前処理とCIBERSORT互換のワークフローに使用されます。ソース: https://bioconductor.org/packages/preprocessCore/
pRRophetic Rパッケージ	CRAN	N/A	遺伝子発現データから薬物IC50値の探索的予測に使用されます。ソース: https://cran.r-project.org/package=pRRophetic
Rソフトウェア	統計計算のためのR財団	バージョン4.1.0	すべての統計分析と図の生成に使用されます。ソース: https://www.r-project.org/
STRINGdb Rパッケージ	Bioconductor	N/A	該当する場合、タンパク質間相互作用関連の分析に使用されます。ソース: https://bioconductor.org/packages/STRINGdb/
SummarizedExperiment Rパッケージ	Bioconductor	N/A	TCGAbiolinksを通じてダウンロードされたTCGA発現データオブジェクトを処理するのに使用されます。ソース: https://bioconductor.org/packages/SummarizedExperiment/
survival Rパッケージ	CRAN	N/A	Cox回帰とKaplan-Meier生存分析に使用されます。ソース: https://cran.r-project.org/package=survival
survminer Rパッケージ	CRAN	N/A	Kaplan-Meier生存曲線とリスク表を視覚化するために使用されます。ソース: https://cran.r-project.org/package=survminer
TCGAbiolinks Rパッケージ	Bioconductor	N/A	TCGA-LUSCの発現データと臨床データのダウンロードと準備に使用されます。ソース: https://bioconductor.org/packages/TCGAbiolinks/
timeROC Rパッケージ	CRAN	N/A	予後モデルの時間依存性ROC分析に使用されます。ソース: https://cran.r-project.org/package=timeROC

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