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方法論記事

行動分析および高濃度画像を用いたゼブラフィッシュ幼虫におけるドーパミン作動性神経変性のin vivo表現型解析

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DOI:

10.3791/71516

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2026年6月16日

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1Department of Clinical Pharmacy Practice, UC Irvine School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2Robert A. Mah Molecular Innovation Center, University of California Irvine

この記事について

サマリー

このプロトコルは、 in vivo ゼブラフィッシュを用いてドーパミン作動性ニューロンの喪失や運動行動障害を定量化する標準化された高スループット化合物スクリーニング法を提供し、神経保護化合物の効率的なスクリーニングを可能にします。

要約

神経変性における創薬研究は、従来の哺乳類モデルの高コストと低スループットによって制約を受けています。このボトルネックは特にパーキンソン病研究で観察されており、厳密かつ拡張可能なドーパミン作動性(DA)神経変性研究は依然として遅く、資源を要するものです。このギャップを埋めるために、DAニューロンにニトロレダクターゼを発現させるトランスジェニックゼブラフィッシュモデルを用いた標準化された高スループット表現型パイプラインを提案し、受精後5日以内のDAニューロンの喪失を研究します。ゼブラフィッシュは、迅速な幼虫発生、生 体内 での全脳イメージングを可能にする光学的透明性、パーキンソン病に関連する遺伝子や経路の強い保存、細胞培養モデルでは利用できない完全な神経回路など、トランスレーショナル神経科学にとって重要な利点を提供します。当プロトコルは化学遺伝学的アブレーションと高濃度画像診断を統合し、スクリーニング用の迅速なデータセットを生成します。DAニューロンはメトロニダゾール(MTZ)を用いて選択的にアブレーションされ、特異的かつ調整可能な神経変性を引き起こします。MTZ治療は徐行運動様表現型に一致する線量依存的な移動量の減少をもたらし、DA細胞喪失との強力な行動相関を提供します。パーキンソン病は根本的に運動障害であるため、解剖学的測定と機能的行動指標を組み合わせています。運動活動はプレートに直接記録され、自動追跡によって定量化され、総移動距離、スイムの頻度、バースト開始などの指標を抽出します。ゼブラフィッシュは、最小限の手間で数百匹の幼虫を同時に分析できる効率的かつ拡張可能なモデルシステムを提供します。学部生研究における実験的分散を最小化するために、高スループットのプレートベースの薬物スクリーニングプロトコルを最適化しました。この標準化されたプレートベースのフォーマットは、神経保護や機能的救済のための候補化合物のスクリーニングに用いられており、異なる研究者が収集したデータを統計的に比較可能かつ神経保護候補の特定に有効であり、再現性を向上させます。これらの手法は、神経変性研究のための堅牢で拡張可能な枠組みを提供します。

概要

神経変性における創薬研究は、従来の哺乳類モデルの高コストかつ低スループットのため、効率性のボトルネックに直面しており、慎重な実験計画と大規模な労働力の活用が必要です。この手法の全体的な目標は、Tg(th:Gal4;UAS:NTR-mCherry)は、ニトロレダクターゼ-mCherryをドーパミン作動性(DA)ニューロンで特異的に発現させ、DAニューロンの喪失と運動障害を研究するトランスジェニックゼブラフィッシュモデルです。この技術の使用の根拠は、神経変性研究のための厳密で拡張可能かつ経済的に実現可能な生体内モデルの必要性に由来します。in vitro細胞培養は迅速な薬物スクリーニングを可能にしますが、翻訳関連性に不可欠な完全な神経回路や生物全体の文脈を欠いています。6.これに対し、齧歯類モデルは優れた生理学的背景を提供しますが、神経保護化合物の初期のハイスループットスクリーニングには高コストかつ時間がかかります7,8。

ゼブラフィッシュは幼虫の発生が速く、生体内での全脳イメージングを可能にする光学的透明性、特に神経変性に関連する疾患関連経路の強い遺伝的保存性を持っています。このプロトコルは、標準化された飼育、メトロニダゾール(MTZ)による化学遺伝性アブレーション、高濃度画像診断と機能的行動追跡を統合しています。運動活動を直接測定することは、ドーパミンニューロンの喪失が行動異常と関連しているため、DAニューロンの喪失と強い行動相関を示すことを示しています(12,13,14)。標準化されたプレートベースのフォーマットにより、オペレーター間の実験分散を最小限に抑え、ゼブラフィッシュ幼生システムの高スループットにより大規模なサンプルサイズが可能となり、神経保護効果を検出するのに十分な統計的パワーを提供します。これにより、このプロトコルはスケーラブルかつ再現性のあるスクリーニングが必要な用途、さらには調査者の経験が異なる環境にも適しています。

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プロトコル

脊椎動物被験者を用いたすべての方法は、機関動物ケア・使用委員会のガイドライン(IACUC承認AUP-25-098)に準拠して実施されました。

1. ゼブラフィッシュの飼育

  1. 水生環境の維持
    1. 循環水生系を28.5°C(許容範囲:26°C–30°C)、pH 7.1–7.8、導電率600–700 μS/cmに維持してください。成魚のゼブラフィッシュは自宅水槽で約5匹/Lの放流密度を維持してください。
    2. 製造元の指示に従い、比色水槽の水質検査キットを使って毎日アンモニア、亜硝酸塩、硝酸塩のレベルを監視してください。アンモニアと亜酸塩は0ppm、硝酸塩は10〜20ppmの範囲に保ちます。
    3. アンモニアまたは亜硝酸塩が0ppmを超え、硝酸塩が20ppmを超え、目に見える濁度や破片が存在する場合、またはpH/伝導率がステップ1.1.1で記載された目標範囲外に下がった場合に水交換を行います。アンモニアと亜硝酸塩が0 ppmに戻り、硝酸塩が10〜20 ppmに戻り、pH/導電率が標的範囲に戻るまで交換を続けます。
    4. 概日リズムと繁殖を同期させるために、14時間の光と10時間の暗いサイクルを維持してください。
  2. 異なる発達段階のゼブラフィッシュに餌を与えましょう
    1. 成魚には0.5mmのスローシンクペレットを1日2回与えましょう。給餌は消費までの時間で標準化し、3〜5分以内に摂取した量だけを与えます。実験コホートごとに同じペレットサイズと食事タイプを一貫して使用してください。
    2. 幼魚にはGemma Micro 75 ZFまたは約75μmの粒径の同等の幼虫ゼブラフィッシュ飼料を1日3回与えてください。幼魚(1ヶ月)には、約150μmの粒子サイズの同等のゼブラフィッシュ飼料を1日3回与えてください。
    3. 同等の食事は、ゼブラフィッシュの幼虫や幼体向けに調合され、同等の粒子サイズを提供し、発達段階に適した高タンパクで栄養価の高い飼料を提供する場合にのみ置き換えてください。
    4. 幼虫や幼魚の飼料には、平日正午に1日1回、新鮮に孵化した生きた塩水エビのナウプリイを補う。製造元の指示に従い、エアレーションのある塩水で24〜36時間ブラインシュリンプ嚢胞を孵化させます。
    5. 泳いでいるナウプリを採取し、システムの水で洗い流し、5〜10分以内に摂取した量だけを与えます。
    6. 過剰給餌は避けてください。過剰な給餌はアンモニア濃度を上げます。
      注意:食べていない食べ物や目に見えるゴミは、毎日優しくサイフォンで取り除いてください。水槽の死んだり不健康な魚がないか点検し、ゴミが溜まった場合は水槽表面やストレーナーを清掃してください。実験コホート間でタンク密度、給餌、清掃、水質モニタリングを一貫して維持すること。ゼブラフィッシュの飼育、発達段階、ブラインシュリンプ養殖、長期施設の維持管理に関する詳細は、Westerfield15 およびAvdeshら16を参照してください。

2. 胚の採取、試薬調製、遺伝子組み換えスクリーニング

  1. 繁殖用の交配を設置する
    1. 胚採取前の夕方に交差水槽を仕切りで組み立てます。
    2. 各交差水槽にオス1匹とメス2匹のゼブラフィッシュを置き、オスとメスは仕切りで一晩分ける。
    3. 翌朝、光のサイクルが始まるときに仕切りを外し、一定の2時間のスポーンを待ちます。発生期の変動を最小限に抑えるため、産卵ウィンドウ直後に胚を採取しましょう。
  2. 胚の採取と培養
    1. 400μmのメッシュフィルターに水を通して胚を採取します。胚はシステムウォーターまたはブルーエッグウォーター(BEW)で優しくすすぎてゴミを取り除き、その後使い捨ての移植ピペットを使って100mmのペトリ皿に胚を移植します。取り扱いを最小限にし、胚を長時間空気にさらさないようにしましょう。
    2. 胚を1皿あたり50〜60個の密度で30 mLのBEWを含む100 mmペトリ皿に移植します。安定した発育と酸素供給を維持するために、1皿あたり60個を超えないようにしてください。
    3. 胚は28.5°Cで14時間の光と10時間の暗循環で培養します。
    4. 受精していない卵や生存できない胚は毎日取り除きましょう。
      注:BEWは60mgのインスタントオーシャンシーソルト、1%メチレンブルー50μL、脱イオン水1Lを用いて準備します。
  3. 1-フェニル-2-チオウレア(PTU)溶液を準備し、塗布します
    1. ジメチルスルホキシド(DMSO)中の100 mM PTUストック溶液を準備します。
    2. PTUのストック溶液は光を遮断して4°Cで保存してください。
    3. 受精(hpf)後24〜36時間後、各皿に30 mL BEWを含むPTUストック溶液60 μLを加え、最終濃度200 μMにします。
    4. ペトリ皿を円を描くように5〜10回優しく回してPTUを混ぜます。機械的ストレスを最小限に抑えるために、胚に直接ピペッティングするのは避けてください。
      注意:PTUは呼吸器や皮膚の刺激を引き起こす可能性があります。手袋を着用し、換気の良い場所で準備を行いましょう。
  4. トリカイン麻酔薬を準備してください
    1. 400 mgのトリカインメタンスルホン酸塩を97.9 mLのミリQ水に溶かします。
    2. 溶液に1 M Tris base(pH 9)を2.1 mL加えます。
    3. 0.1 Mの水酸化ナトリウムまたは塩酸を使って溶液をpH 7.0に調整します。
    4. 溶液をラベル付きのチューブに分割し、4°Cで保存します。
    5. 低用量用途では、ストック溶液を1:25で希釈して作動濃度160 μg/mL、1:100で希釈して40 μg/mLを得ることができます。
      注意:トリカインメタンスルホン酸塩は化学麻酔薬です。適切な個人用防護具の使用を心がけましょう。
  5. アウトクロスを行う
    1. 交配ホモ接合体Tg(th:Gal4;UAS:NTR-mCherry)は、ホモ接合体1匹の異性トランスジェニック成体と1匹のAB野生型成魚を交配槽に隔てて一晩置き、AB野生型ゼブラフィッシュの成魚を捕獲します。光のサイクル開始時に仕切りを外し、固定された2時間の産卵ウィンドウ後に胚を採取してください。
  6. スクリーントランスジェニック幼虫
    1. 受精後3日目(DPF)に、最終濃度160 μg/mLのトリカインを用いて幼虫を麻酔します。
    2. mCherryフィルターセット(励起~587 nm、発光~610 nm)を用いて蛍光立体顕微鏡で幼虫を観察します。実験内のすべての幼虫に対して、対物レンズ倍率、露光時間、ゲイン、照明強度など、同じスクリーニング設定を適用します。
    3. 既知の陽性トランスジェニック幼虫を用いて曝露とゲインを設定し、DAニューロン蛍光が飽和なしで明確に見えるようにし、実験内の残りの幼虫にもこの設定を維持します。
    4. mCherry陽性シグナルが、眼の間の腹側間脳および中央線のやや腹側に局在するDAニューロンクラスターの存在を確認します(図1A)。
    5. 陽性の幼虫は、腹側間脳の予想されるDAニューロンクラスターで明確に検出可能なmCherry蛍光を示すものと特定します。固定スクリーニング設定下で背景にmCherry信号が見えない場合、非遺伝子組みまたは既知の陰性幼虫を背景対照として用いて幼虫を陰性に分類します。
      注:3 dpfは腹側間脳のDAニューロンが定量化のために信頼できる蛍光信号を生成する最も初期の段階です。

figure-protocol-1
図1:遺伝子転換スクリーニング、幼虫埋め込み、プレート設計。 (A) ドーパミン作動性(DA)ニューロンでニトロレダクターゼ(NTR)を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ幼虫の蛍光画像(mCherry channel, 4× objects)。眼の間の腹側間脳にDAニューロンクラスターが見られる。(B) 約1.5mmの開口部にトリミングされた改良型P200ピペットチップ。アガロース埋め込み中の幼虫移植に使用。(C) 高スループット薬物スクリーニングのための代表的な96ウェルプレートレイアウト(車両制御、メトロニダゾール(MTZ)処理ウェル、スクリーニング化合物条件を含む。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

3. 化学遺伝性アブレーションおよび蛍光イメージング

  1. アガロース埋め込み培地を準備します
    1. 埋め込み当日、4 dpfで1.2%の低融点アガロース(LMA)をミリQ水に準備します。
    2. アガロース溶液を電子レンジで5〜10秒間隔で短く加熱し、間隔間で優しく渦巻きながら、アガロースが完全に溶けて溶液が透明になるまで加熱します。蒸発によって最終的なアガロース濃度が変化するため、沸騰や長時間加熱を避けること。
    3. アガロースを1.5 mLのマイクロ遠心分離管にアリコートします。
    4. 使用前に70°Cで溶かし、42°Cの熱ブロックで平衡します。
    5. 各アガロースアリコートにトリカインストック溶液20 μL(4 mg/mL)を加え、約40 μg/mLの作動濃度を得ます。
    6. トリカインを溶融アガロースに混ぜ、P200ピペットで5〜10回優しく上下に動かします。渦巻きや気泡の導入は避けてください。泡は幼虫の位置決めや撮影に干渉することがあります。
  2. 麻酔と幼虫の埋め込み
    1. 4匹のdpf幼虫を含むペトリ皿にトリカインストック溶液を加え、最終濃度を160 μg/mLにします。
    2. 幼虫をトリカインで約5分間抱卵させるか、自発的な泳ぎが減り、プローブによる優しい接触に反応が見られないまで待つ。この麻酔終点に達してから埋め込みを進めてください。
    3. P200ピペットの先端をきれいなハサミや滅菌刃でトリミングし、約1.5mmの開口部を作ります。使用前に定規や校正済みの目盛りで立体顕微鏡で開口サイズを確認してください。幼虫が接触せずに通過できないほど狭い縁や狭い先端は捨てます(図1B)。
    4. 改造ピペットの先端を使って最小限の液体で1隻の幼虫を吸引します。
    5. ピペットの先端をアガロースのアリコートに浸します。
    6. 幼虫1匹を含むアガロース40μLを、平底96ウェルプレートの1つのウェルに投与します。実験内のすべてのウェルに対して同じアガロース体積を使いましょう。異なるタイプのプレートを使用する場合は、実験開始前にアガロース体積を最適化し、選択した体積をすべてのウェルで維持してください。
      注意:一貫したイメージングを確保するために平底プレートを使用してください。プレートの形状に基づいてアガロース体積を最適化します。
  3. オリエントおよび埋め込み幼虫
    1. プレートを立体顕微鏡(解剖顕微鏡)に置きます。
    2. 細かい鉗子や0.25mmプローブを使って、幼虫の向きをつけて腹側間脳が目標物に向くようにします。
    3. 逆立顕微鏡の場合は幼虫を背側を下に、直立顕微鏡では背側を上に配置してください。
    4. アガロースが固まる1〜2分以内に完全な配向。
    5. あらかじめ定められた96ウェルのプレートマップに従って、1つの井戸に1体の幼虫を埋め込みます。A行を車両制御用に、H行をMTZのみ制御用に、B〜G行を候補化合物条件または線量反応グループに割り当てます。位置バイアスを減らすために、可能であればB〜G行内の複合配置をランダム化します。ベースラインおよび治療後の画像診断には同じプレートマップを使用します。
    6. アガロース固化後、各ウェルにトリカインなしのBEWを加え、最終ウェル容積を正確に200 μLにします。プレート内のすべてのウェルに同じ最終体積を用い、一貫した拡散と処理曝露を維持します。
  4. MTZ処理ソリューションを準備します
    1. BEWで1%のDMSOと200μM PTUを補ったMTZ作業液を準備します。MTZ粉末を溶液に加え、目に見える粒子が残らなくなるまで渦を巻きます。ロッカーまたはチューブローテーターで、光を遮った場所で室温で15〜30分間混ぜます。使用前に溶液が透明で目に見える沈殿物がないことを確認してください。
    2. 3、4.5、9 mMの濃度を準備し、線量応答の最適化を行います。
    3. 200μM PTUでBEW中に1%DMSOを含む車両制御を準備します。
    4. 最適化後の定期スクリーニングには検証済みMTZ濃度のみを準備してください。
      注意:MTZは光に敏感です。各実験ごとに新鮮な溶液を準備し、ホイルで光を守り、余った溶液を再利用しないでください。
      注意:すべての治療群および対照群で最終DMSO濃度を同一に保ってください。代替のMTZ処方を代替しないでください。
  5. 治療前蛍光画像の取得
    1. 4 dpfで埋め込み後、20×対物レンズを持つ蛍光顕微鏡でベースライン蛍光画像を取得します(図2)。
    2. 各井戸はmCherryチャネル(励起~587 nm、放出~610 nm)を用いて画像化します。
    3. 実験内のすべての井戸で同一のイメージング設定を用いましょう。車両制御幼虫を用いて露光時間、照明強度、検出器利得を設定し、最も明るいDAニューロンのピクセルが飽和なしに検出器のダイナミックレンジの約70%〜80%に達するようにします。最終露光時間、照明強度、検出器利得、対物鏡、取得プロファイルを記録し、すべての基準および処理後画像でこれらの設定を維持してください。
    4. 可能な限り、すべての画像を1回のセッションで取得し、ランプの強度や検出器感度の時間間での変動を最小限に抑えましょう。自動ステージ制御システムでは、多位置取得を用いて画像セッション間で同一座標を維持します。
    5. 取得プロファイルは、処理後の画像検査(ステップ3.7)やその後の実験で再利用するために保存してください。
      注:20×の目的物は、間脳性DAニューロンクラスターの画像化において視野角と解像度のバランスを提供します。
  6. ベースライン画像診断後にMTZ処理を適用してください
    1. 4 dpfでのベースラインイメージング直後、MTZ含有溶液または車両溶液を各ウェルに直接添加し、最終ウェル容積を200 μLにします。
    2. 化合物スクリーニング実験では、この段階で候補化合物とMTZを組み合わせて加え、幼虫が同じ24時間の処理期間中にMTZ±化合物にさらされるようにします。
    3. プレートを28.5°Cで14時間の光と10時間の暗いサイクルで24時間、4 dpfから5 dpfの間に培養します。
    4. 孵化中にプレートを乱さないようにしてください。
      注:用量反応実験では、治療条件を最適化するために追加の潜伏時間(例:12時間および48時間)を評価してください。
      一時停止点:プレートは画像診断に進む前に、定められた処理期間の潜伏条件下で維持できます。
  7. 治療後の蛍光画像を取得する
    1. 5dpfで、4dpfのベースラインイメージングに用いられるのと同じ顕微鏡設定(露光時間、照明強度、検出器利得、対物レンズ、取得プロファイルを含む)を用いて処理後画像を取得します(図2)。
    2. ウェル間や処理前・処理後イメージングセッション間で、露光時間、検出器利得、照明強度、焦点、対物レンズ、取得設定を調整しないでください。
    3. もしセッション間に顕微鏡の電源が切られていた場合は、保存した取得プロファイルを再読み込み、画像化前に記録されたパラメータに対してすべての設定を確認してください。
    4. 可能な限りベースライン画像で同じ順序で画像ウェルを作成し、処理後の画像は同じ画像セッション内で取得します。
    5. この治療前および治療後の画像設計は、基線DAニューロン蛍光の個人間変動を制御し、信号の変化が獲得の違いではなく治療によるものであることを保証します。

figure-protocol-2
図2:メトロニダゾール治療後のDAニューロン蛍光の用量依存的減少。 24時間処理後に異なるMTZ濃度を用いたトランスジェニックゼブラフィッシュ幼生の代表的な蛍光画像(mCherryチャンネル、20×目的)。蛍光強度は線量依存的に減少し、NTR発現ニューロンの化学遺伝学的アブレーションが成功していることを示しています。スケールバー=50μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

4. 高スループットプレートベースの薬物スクリーニング

  1. 遺伝子組み換え幼虫の生成とスクリーニング
    1. ホモ接合型の新しいトランスジェニック幼虫のコホートを生成します。
    2. 胚を採取してBEWで育てます。
    3. 受精後24〜36時間(hpf)で200μM PTUを投与し、ステップ2.3で説明しています。
    4. 3dpfで、mCherryチャンネルを用いて実験内のすべての幼虫を固定顕微鏡設定でスクリーニングします。既知の陽性幼虫を使って露光時間、検出器利得、照明強度を設定し、飽和せずにDAニューロン蛍光を明確に検出し、スクリーニング中はこれらの設定を変更せずに維持します。
    5. 固定スクリーニング設定下で腹側二脳の期待されるDAニューロンクラスターに明確なmCherry蛍光が見られる場合、幼虫を陽性と分類します。この領域で背景上に信号がない場合、または弱い、拡散性、または異所性蛍光を持つ幼虫は捨てます。
  2. 幼虫を埋め込み、ベースライン画像を取得する
    1. 4dpfで、ステップ3.2–3.3に記載された通り、1つのウェルに1匹の幼虫を用いて96ウェルのプレートに埋め込みます。
    2. ステップ3.5で説明された処理前のベースライン蛍光画像を取得します。
  3. MTZおよび候補化合物を適用してください
    1. 4 dpfでベースライン蛍光画像を取得した後、プレートマップに従って処理溶液を直接ウェルに加えます(図1C)。
    2. 車両制御井戸の場合は、化合物処理井で使用される最終DMSO濃度を含むBEWを追加してください。
    3. MTZのみのコントロールウェルの場合は、候補化合物を含まないMTZ溶液を加えます。
    4. 化合物スクリーニングウェルでは、MTZと候補化合物を一緒に添加し、幼虫が同じ24時間の処理期間中に両方にさらされるようにします。
    5. 初期スクリーニングでは、化合物特異的な溶解度、毒性、または過去の用量反応データが異なる濃度を用いることを示さない限り、10μMなどの単一化合物濃度を使用します。
    6. 各井戸を最終体積200μLに調整してください。車両制御井戸、MTZ単独制御井戸、MTZプラス複合井を含むすべての井戸で最終DMSO濃度を同一に保ちます。
    7. プレートを28.5°Cで14時間の光と10時間の暗いサイクルで24時間、4 dpfから5 dpfの間に培養します。
      注意:このプロトコルには、化合物曝露前のMTZ除去や洗浄は含まれていません。候補化合物はベースライン画像直後にMTZと同時に適用されます。
  4. 治療後の画像を取得し、蛍光保持を計算します
    1. 5 dpfで、4 dpfでのベースライン画像と同じ取得設定で治療後の蛍光画像を取得します。
    2. 可能な限り、ベースラインイメージング時に同じ順序で画像ウェルを配置します。
    3. 各幼虫の蛍光保持率は次のように計算します:
      figure-protocol-3
    4. 蛍光保持値を同じプレートの平均車両制御値に正規化します。
    5. MTZのみ対照群よりも蛍光保持値が有意に高いものを保護化合物として特定します。
  5. ヒット化合物の特定
    1. ヒット化合物は、陰性対照群(MTZのみ)よりも蛍光保持率が有意に高い化合物と特定します。
    2. ウェルチのt検定を用いて統計解析を行い、MTZのみの対照群とMTZおよび化合物処理群を比較します。
    3. 独立した生物学的複製と用量反応アッセイを用いてヒット化合物を検証します。ヒットをMTZのみ対照群と比較して蛍光保持率を再現性的に高める化合物として確認し、p < 0.05で幼虫毒性や異常形態が目に見えない。
    4. 運動行動分析、線量反応の検証、独立した生物学的複製試験などの二次アッセイに対する事前検証済みヒット。
      注:化合物ライブラリースクリーニングでは、各プレートのZファクターを陽性および陰性対照を用いて計算してください。Zファクター>0.5はヒット識別に適した堅牢なアッセイを示します。

5. 運動行動評価

  1. 幼虫を処理群に割り当てる
    1. 4 dpfで、各遺伝子型の幼虫を3つの処理群に分け、各群に少なくとも10匹の幼虫を配置します:BEWのみ、DMSO車両対照、MTZ処理。
    2. グループを以下の通りに割り当てます:(1) BEWのみ(未処理ベースライン)、(2) 1% DMSO車両対照、(3) 最適化されたMTZ濃度(200 μM PTUで1% DMSO/BEWで4.5 mM)
    3. 同一条件下でビークルやMTZで処理したAB野生型幼虫も含めます。MTZがTg(th:Gal4;UAS:NTR-mCherry)幼虫ですが、AB野生型幼虫には含まれていません。
  2. 処理を行い、幼虫をプレートで洗いましょう
    1. ステップ5.1.2で定義された条件を用いて、28.5°Cで24時間処理します:BEWのみ、DMSO車両制御1%、または200μM PTUで1% DMSO/BEWに4.5 mM MTZを投与します。
    2. 広口径の移送ピペットを用いて、6ウェルプレートの各ウェルに5隻の幼虫を移送します。そこに2.5mLの新鮮なBEWが入っています。幼虫の持ち越し量を最小限に抑え、ストレスや怪我を避けるために優しく扱いましょう。
      注:1井戸あたり5羽の幼虫を使用することで、データの収量を均和し、過密状態を最小限に抑えます。密度が高いと経路交差が増え、行動解析における追跡誤差が生じます。
  3. 照明条件の設定
    1. 6ウェルプレートを白いLEDライトパッドに置き、均一な拡散照明を25°C〜28°Cに保ちます。 実験内のすべての記録に同じライトパッド、明るさ設定、プレート位置を用いてください(図3A)。
    2. 影、まばゆみ、反射を最小限に抑えるために、上下両方から光を照らします。
  4. ビデオ録画セットアップの設定
    1. 高解像度カメラをプレートの上に固定されたトップダウン向きで固定し、安定した支持(例:三脚やアームマウント)を用いて取り付けます(図3B)。
    2. 空間キャリブレーションのために、視野内のプレートの隣に定規を置きます。
    3. 視差歪みを最小限に抑えるために、カメラがプレート表面に対して垂直であることを確認しましょう。
  5. 運動活動の記録
    1. 概日リズムの変動を最小限に抑えるため、14時間の光:10時間の暗いサイクルの光フェーズ中に記録を行うこと。
    2. 幼虫が1時間慣れるまで待ってから記録してください。
    3. 60分間の運動活動を記録しろ。
    4. 録画中はセットアップを妨害しないでください。
      注意:概日リズムの変動を最小限に抑えるため、実験全体で同じ時間帯に記録を行うこと。
  6. 行動追跡ソフトウェアの設定
    1. 録画した動画をEthoVision XT(行動追跡ソフトウェア)にインポートします(図3C)。
    2. 以下の設定を設定してください:6つのアリーナ、1アリーナあたり5人の被写体、中心点検出、ミリメートル単位の距離、秒単位の時間。
    3. 映像フレーム内の定規を使って空間スケールをキャリブレーションします。
    4. 各井戸のアリーナ境界を定め、井戸の端を超えずに井戸内部を完全に包み込むようにしてください。
  7. 検出設定の最適化
    1. ソフトウェアインターフェース(検出設定→参照画像→学習開始)を使って参照画像を生成します。
    2. 誤検出なしですべての幼虫を正確に追跡できるように検出閾値を調整してください。
    3. 短いテスト取得(~2分)を実行してください。
    4. 追跡された経路を目視で確認してから、完全な分析に進みます。すべての幼虫が検出されていること、気泡、破片、反射、井戸の縁が誤って幼虫と識別されていないか確認してください。
      注意:一般的なアーティファクトには、オーバーサイズのアリーナによるエッジトラッキング、バブルや破片による誤検出、長時間の非活動によるトラッキング喪失などがあります。
    5. 持続的な追跡故障、過度な経路交差、目に見える破片や気泡、死んだ幼生、異常な形態、または井戸縁に閉じ込められた幼虫が信頼できる定量を妨げている場合は、解析から井戸を除外します。
    6. 統計解析前にすべての治療群に同じ除外基準を適用してください。
  8. 完全な分析を行い、データをエクスポートします
    1. 買収全文を実行してください。
    2. トラックの可視化やヒートマップ(結果→分析→トラックとヒートマップ)を生成します。
    3. 被験者ごとの指標を含む生データスプレッドシートをエクスポートしてください。これには総移動距離(mm)、平均速度(mm/s)、移動回数が含まれます。
    4. 60分以上の総移動距離を主要な運動エンドポイントとして用いてください(図3D)。

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図3:ロコモーター行動記録のセットアップと解析ワークフロー。 (A) 6ウェルの実験装置で、ゼブラフィッシュの幼虫をライトパッドに置き、空間キャリブレーション用の定規と実験条件を維持するための温度制御熱源を配置しています。(B)幼虫の動きを記録するためのトップダウンカメラを用いたビデオ取得セットアップで、代表的な追跡オーバーレイを用いています。(C) EthoVision XT(行動追跡ソフトウェア)を用いた行動追跡で、幼虫の動きを自動検出・追跡したことを示しています。(D) ビデオ取得から運動行動の定量的分析までのステップをまとめたワークフローの概要。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

6. データ分析

  1. 解析用画像準備
    1. フィジーのオープンな事前処理および処理後画像ペア(ImageJ、画像解析ソフトウェア)。
    2. 画像をZスタックで取得する場合は、最大強度投影(画像→スタック→Zプロジェクト→最大強度)を生成します。
    3. データセット内のすべての画像に対して、同じ固定表示設定で明るさやコントラストを調整します。定量測定には自動スケーリングを使わず、元の未調整画像に対して蛍光定量を行ってください。
  2. 関心領域(ROI)を定義する
    1. ポリゴン選択ツールを使って、治療前の画像内の間脳DAニューロンクラスターの周りにROIを描画します。蛍光画像に見える解剖学的ランドマーク、例えば目の内側縁や間脳の腹側正中線(図2)を用いてROI境界を定義します。ROIが隣接する蛍光構造にまで及ぶことなく、DAニューロンクラスター全体を包含するようにしてください。オペレーター間の一貫性を確保するために、代表的なROIテンプレートを保存し、全チームメンバーに空間的な参照として配布してください。
    2. 「t」を押してROIマネージャーに追加してください。
    3. ROIを適用する前に、眼や腹側間脳などの解剖学的ランドマークを用いて治療前後の画像を整列させます。アライメントを確認した後にのみ、同じROIを治療後の一致画像に適用してください。
    4. 各プレートごとにすべてのROIを保存し、再現性と再解析を可能にします。
  3. 蛍光強度を定量化する
    1. 測定設定(分析→測定セット)を設定し、「面積」と「平均グレー値」を選択してください。
    2. 各画像を測定(分析→測定)。
    3. 同じ画像内の隣接する非ニューロン領域からの背景蛍光を測定し、DAニューロンROI測定から差し引く。背景補正後の積分密度を次のように計算します:補正後IntDen = IntDenROI −(面積ROI×平均背景)。
    4. 各幼虫の蛍光保持比率をIntDen(処理後)/IntDen(前処理)として計算します。
    5. 蛍光保持比を同じプレートの平均車両制御値に正規化します。処理群を比較する前に、各プレートの車両制御平均を個別に計算してください。
      注:高スループット解析の場合は、CellProfiler(画像解析ソフトウェア)と自動ROI検出20を用いて同じ定量を行います。
  4. ペアワイズ統計解析を行う
    1. 1つの治療群と1つの対照群の比較については、群間の分散が等しいとは仮定しない非ペアの両側ウェルチ検定を行う。
    2. この検定は、グループ間で分散が異なる場合に使用してください。
  5. 多グループ統計解析の実施
    1. 複数の処理群を含む実験に対して一方向ANOVAを実施します。
    2. GraphPadのPrismまたは同等の統計ソフトウェアを用いて、Dunnettの事後検定を適用して各治療群と対照群を比較します。
  6. 統計結果報告
    1. 有意性閾値をα = 0.05に設定します。
    2. カテゴリカルな閾値ではなく、正確なp値を報告してください。
    3. 平均±標準誤差(SEM)としてデータを提示し、個々のデータ点をGraphPad Prismまたは同等のグラフソフトウェアを用いて散布図として重ねます。
    4. 報告書のサンプルサイズ(n)、統計検定、検定統計量、自由度、そして図の凡例内の正確なp値。大規模なデータセットの場合は、補足表に完全な統計出力を含めてください。
      注:スクリーニングアッセイの場合、各プレートのZファクターをZ = 1 − [3(σp + σn)/|μp − μ n|]と計算します。ここでσpとμpは車両制御グループの標準偏差と平均、nσとμ nはMTZのみのコントロールグループの標準偏差と平均です。スクリーニング>許容されるZファクター0.5が許容されます。

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結果

MTZ治療は用量依存的なドーパミン作動性ニューロンの喪失と運動障害を引き起こします

MTZ介在によるDAニューロンアブレーションの最適パラメータを決定するため、DAニューロン生存の代理指標として用いられた蛍光強度および運動距離を、24時間治療後のMTZ濃度3、4.5、9 mMで評価しました。各処理群はn=10個の個体で構成されていました。Tg(th:Gal4;UAS:NTR-mCherry)幼虫は、適合した車両対照群(200 μM PTUを用いたBEWで1% DMSO、n = 10)を対象としました。幼虫は、検証済みホモ接合繁殖者から採取した単一のクラッチから派生しました。MTZ処理は、代表的な蛍光画像(図2)および蛍光定量(図4B)で示されるように、車両処理対照群と比較してDAニューロン蛍光の線量依存性低下を示しました。行動分析では、MTZ処理後の総移動距離が線...

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ディスカッション

このプロトコルは、トランスジェニックゼブラフィッシュにおけるNTR–MTZ化学遺伝系を用いて、DA神経細胞の喪失を定量化し神経保護化合物をスクリーニングするためのスケーラブルなin vivoパイプラインを提供します。標準化されたプレートベースのワークフローは、オペレーターの離職率が高く、学術期間によって研究者の経験が異なる学部研究チーム向けに特別に開発されました。ワークフローの各ステップは再現性とトレーニングの容易さを優先するように構成されており、複数のユーザー間で最小限の変動で一貫した実行を可能にします。このプロトコルは、治療前後のDAニューロン画像診断とプレートベースの行動分析を標準化されたワークフローで組み合わせることで、既存のゼブラフィッシュを用いた神経変性手法を進化させ、構造ニューロンの損失測定と機能的運動アウトカムを同一のスケーラブルスクリーニングプラットフォーム内で比較できるようにします。このワークフローを用いると、96ウェルプレート1枚を埋め込み、4 dpfでベースラインイメージングを行い、24時間処理し、5 dpfで再イメージングできます。埋め込みは通...

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開示事項

著者たちは金銭的な利益相反を一切認めていない。

謝辞

トランスジェニックゼブラフィッシュを提供してくれたカリフォルニア大学サンフランシスコ校のスー・グオ博士、そして野生型胚の提供とゼブラフィッシュの飼育・施設の維持に関する指導をいただいたダエソク・エム博士、マイケル・パーソンズ博士、エディ・ハロ(カリフォルニア大学アーバイン校)に感謝します。また、ロバート・A・マー分子イノベーションセンターおよびカリフォルニア大学アーバイン校のフォーリングリーブズイノベーションビルのスタッフの皆様にも、水泳施設のインフラを提供していただき感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
成魚ゼブラフィッシュの餌、0.5 mmのペレットZeiglerAH271日常的な飼育中に成魚のゼブラフィッシュに与える
アガロース、低融点（LMA）Sigma-AldrichA9414-10Gイメージング中における安定した位置決めのためにウェルに幼生を埋め込むのに使用
アルミニウム箔ULINES-20197MTZのような光に敏感な試薬を準備とインキュベーション中に保護するために使用
CellProfilerBroad InstituteRRID: SCR_007358オプションの自動蛍光イメージ解析に使用
コーニカルチューブ、15 mLCorning352097試薬の準備とサンプルの取り扱いに使用
コーニカルチューブ、50 mLCorning352070試薬の準備と溶液の保管に使用
交配用タンク（1.0 L）AquaneeringZHCT100ゼブラフィッシュの制御された交配と胚の収集に使用
ダニオレリオ（AB野生型）——ニトロレダクターゼ依存効果の特異性を検証するために使用される非トランスジェニックコントロールライン
ダニオレリオ（Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry))——標的化された化学遺伝学的アブレーションのためにドーパミンニューロンでニトロレダクターゼ-mCherryを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュライン
ジメチルサルフォキシド（DMSO）、無水（≥99.9%）Sigma-Aldrich472301-500MLPTU、MTZ、およびスクリーニング化合物の溶媒
EthoVision XTNoldusRRID: SCR_000441幼生の運動量を定量化するために使用される行動追跡ソフトウェア
Fiji（ImageJ）NIHRRID: SCR_003070蛍光定量に使用されるイメージ解析ソフトウェア
先の細い鉗子または0.25 mmのプローブWorld Precision InstrumentsWPI0118アガロース埋め込み中に幼生を向くために使用
蛍光顕微鏡Zeiss11845460mCherry蛍光によるドーパミンニューロンのイメージングに使用
Gemma Micro 150 ZF（幼生用飼料、100–200 μm）Skretting10818945幼生のゼブラフィッシュに与える
Gemma Micro 75 ZF（幼生用飼料、50–100 μm）Skretting10818935幼生のゼブラフィッシュに与える
GraphPad PrismGraphPadRRID: SCR_002798データ分析とプロットに使用される統計解析ソフトウェア
ヒートブロック（42°Cと70°C可能）Thermo Fisher88870001アガロースを制御された温度で溶解し保持するために使用
高解像度カメラ（トップダウンマウント対応）Basler88-327幼生の運動活動を記録するために使用
塩酸（HCl）、0.1 MFisher ScientificSA48-500トリカイン調製時のpH調整に使用
インキュベーター（28.5°C、14時間光：10時間暗光周期）MilliporeZ763314ゼブラフィッシュの発育に制御された環境条件を維持
インスタントオーシャン海塩Instant OceanSS15-10ブルーエッグウォーター（BEW）を準備するために使用
光拡散シート（または同等品）Edmund Optics27-103行動記録中に均一な照明を提供し、グレアを最小限に抑えるために使用
ライトパッドLightcraftLC2004LED運動追跡中に底部からの照明を提供
メトロニダゾール（MTZ）Sigma-AldrichM3761-100Gドーパミンニューロンの化学遺伝学的アブレーションに使用
メチレンブルー、1%水溶液Sigma-AldrichM9140BEWに添加し、胚の微生物成長を防ぐ
マイクロ遠心管、1.5 mLEppendorf22363204試薬の分液と保管に使用
マイクロピペット、P200GilsonFP10005S幼生の取り扱いと溶液の調製に使用
ペトリ皿、100 mmCorningCLS430167胚の収集とインキュベーションに使用
ピペットチップ、200 μLRAININ30389188液体処理と幼生の移送にマイクロピペットと一緒に使用
塩化ナトリウム（NaCl）、≥99.0%Sigma-AldrichS9888-500Gバッファ溶液と水溶液の調製に使用
水酸化ナトリウム（NaOH）、0.1 MFisher ScientificSS256-500トリカイン調製時のpH調整に使用
ステレオ顕微鏡NikonSMZ-745埋め込み中の幼生の操作と向き付けに使用
温度制御ヒートマット（25°C–28°C）VivosunV-SHMDT行動記録中の安定した温度を維持
トリカインメタンスルホン酸塩（MS-222）Sigma-AldrichE10521-10Gゼブラフィッシュ幼生のための麻酔として使用
トリス塩基Fisher ScientificBP152-1緩衝トリカイン溶液の調製に使用
水浄化システムMilliporeZIQ7003T0溶液調製用の脱イオン水を生成するために使用
ゼブラフィッシュ保管タンクAquaneeringZS560成魚のゼブラフィッシュの集団を維持するために使用
1-フェニル-2-チオ尿素（PTU）Sigma-AldrichP7629-10Gメラノジェネシスを阻害し、光学的透明性を維持するために使用
6ウェルプレート、フラットボトムCorning07-200-83運動行動アッセイに使用
96ウェルプレート、フラットボトムGreiner Bio-One655096高スループットイメージングとスクリーニングアッセイに使用

参考文献

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