本プロトコルは、ネットワーク薬理学、ドッキング、MDシミュレーションを用いてQUF3がPCOSにおける子宮内膜受容性を改善するメカニズムを探ることを目指します。
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研究記事
PCOSにおける子宮内膜受容性改善のためのQuの公式3のメカニズム:ネットワーク薬理学と分子動力学シミュレーションの組み合わせ
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
子宮内膜受容能力の障害は、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)における不妊の主な原因です。Qu氏フォーミュラ3(QUF3)は、PCOS患者の子宮内膜受容性を改善するために臨床的に用いられる漢方薬の処方です。本研究では、ネットワーク薬理学、分子ドッキング、分子動力学(MD)シミュレーションを用いて、その基礎となるメカニズムを調査しました。TCMSPデータベースを用いてQUF3の活性成分を特定し、子宮内膜受容性およびPCOSに関連する潜在的な標的はDrugBankやその他のリソースから取得しました。Cytoscapeを通じて、化合物-標的相互作用ネットワークおよびタンパク質-タンパク質相互作用(PPI)ネットワークを構築し、主要な標的を特定しました。コアターゲットはGOおよびKEGG濃縮解析を受けました。分子ドッキング、MDシミュレーション、主成分解析(PCA)、自由エネルギー地形(FEL)、動的交差相関行列(DCCM)を用いて結合相互作用の評価を行いました。91種類の有効成分と294の潜在的な薬物標的から、60の疾患関連標的が特定されました。ルテオリンとセサミンは主要な薬理動態成分の一つでした。10のコアターゲットが特定されました:AKT1、EGFR、TNF、TP53、IL6、BCL2、ESR1、IL1B、STAT3、およびMMP9。KEGG濃縮により132のシグナル伝達経路が明らかになり、GO解析では678のエントリーが特定されました。MDシミュレーションでは、上位5つの活性成分とそれぞれのターゲット間の結合が安定していることが示されました。PCA、FEL、DCCMはこれらの錯体の高い熱力学的安定性と構造剛性をさらに示しました。結論として、QUF3は多成分、多標的、多経路の相互作用を通じてPCOSにおける子宮内膜受容性を改善します。本研究は、PCOS関連不妊に対する標的型中国漢方薬の開発に計算シミュレーションの理論的基盤を提供し、将来的にPCOS女性の妊娠結果改善に前向きな示唆をもたらす可能性があります。
概要
多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)は、女性に最も多い内分泌疾患の一つです。主な特徴は慢性持続性排卵機能障害、臨床的または生化学的な高男性ホルモン血症、多嚢胞性卵巣形態であり、無月経、不妊、多毛症、ニキビ、肥満などの臨床症状を示します。近年、排卵誘導や補助生殖技術(ART)の進歩により、PCOS患者の妊娠率が大幅に改善されました。しかし、妊娠の転帰は健康な女性よりも依然として悪いままです 2,3。子宮内膜受容性はARTの結果に影響を与える重要な要因です。子宮内膜受容性とは、特定の生理学的段階で胚を受容する子宮内膜の能力を指し、胚の着床およびその後の発生に決定的な役割を果たします5,6。肥満、インスリン抵抗性、慢性炎症などPCOSでよく見られる病理的状態は、子宮内膜受容性を低下させ、受精卵の着床や胚の発生を妨げ、最終的には不妊や流産につながることがある7,8。しかしながら、PCOSにおける子宮内膜受容性の調節メカニズムは依然として大部分が不明瞭であり、さまざまな影響因子間の相互作用ネットワークもまだ解明されていません。曲氏のフォーミュラ3(QUF3)は、PCOS患者の子宮内膜受容性を改善するために臨床的に用いられる漢方薬の処方であり、婦人科における伝統中国医学(TCM)の堅実な古典理論によって支えられています。この処方は、Paeoniae Radix Alba(白少)、Rehmanniae Radix Praeparata(シュディホアン)、Cuscutae Semen(Tusizi)、フルクタス・リグストリ・ルチディ(Nvzhenzi)、Herba Taxilli(サンジシェン)、Radix Salviae(ダンシェン)、そしてCornus Officinalis Sieb(コルヌス・オフシナリス・シエブ)で構成されています。エト・ズック。(山珠玉)2:4:3:4:3:2:2の比率で、エタノール逆流抽出で調製された。QUF3は複数のハーブの相乗効果を発揮し、腎臓を強健させ、エッセンスを豊かにし、血液を栄養し、血行を促進します。PCOS患者における子宮内膜受容性の改善における臨床的有効性は十分に検証されていますが、その主要な薬理学的メカニズムはまださらなる調査が必要です。
ネットワーク薬理学は、多層的な「ハーブ成分-標的-疾患」ネットワークを構築し、薬物が疾患ネットワークに与える介入効果を全体的に明らかにするシステム生物学に基づく分析アプローチです。従来の「単剤・単一標的」モデルとは異なり、ネットワーク薬理学はTCM処方の「多成分・多標的・多経路」作用の相乗効果を包括的に捉えることができ、TCMの複雑なメカニズムの研究に特に適しています。一方、分子動力学(MD)シミュレーションはニュートン力学に基づく計算手法であり、原子レベルでタンパク質-リガンド複合体の立体構造変化や動的挙動を時間とともにシミュレートします。静的分子ドッキングと比較して、MDシミュレーションは結合安定性、自由エネルギー地形、構造剛性などの動的パラメータを評価できるため、薬物分子と標的タンパク質間の相互作用をより現実的に評価できます。ネットワーク薬理学はTCM製剤の潜在的な標的や経路をグローバルにスクリーニングするのに適しており、MDシミュレーションは主要成分と標的タンパク質間の結合安定性を動的に評価できます。これら二つのアプローチを組み合わせることで、TCMの多成分・多標的相乗メカニズムのより信頼性の高い解析が可能になります。この理論に基づき、本研究はネットワーク薬理学と医学シミュレーションを組み合わせた手法を用いて、PCOS患者におけるQUF3の子宮内膜受容性改善の潜在的な薬理学的メカニズムを体系的に探求しました。
この複合計算ワークフローは、特に有効成分や標的がほとんど不明な複雑なシステムにおいて、中国漢方薬や天然製品の多成分・多標的メカニズムの初期探究に最適です。ユーザーは、データベース検索やネットワーク解析を含む基本的なバイオインフォマティクスの知識を持つほか、一般的なソフトウェアパッケージを用いて分子ドッキングや分子動力学シミュレーションなどの基礎的な計算生物学解析を行う能力も持っている必要があります。少なくとも16GBのRAMを持つLinuxベースのコンピューティング環境と、伝統的な中国医学システム薬理学データベース・解析プラットフォーム(TCMSP)、PubChem、UniProtなどの関連する公開データベースへのアクセスが推奨されます。このワークフローで使用されるすべてのソフトウェア(例:Cytoscape、AutoDockTools、GROMACS)はオープンソースまたは学術用途の無料であり、読者は Table of Materialsの情報から入手可能です。
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プロトコル
QUF3の有効成分および潜在的標的のスクリーニング
薬剤QUF3に含まれる百韶、樹帝皇、屠思子、煙津子、桑吉生、丹申、山珠瑜の有効成分が、2025年4月1日(10)にTCMSPを用いて確認されました。有効成分は経口バイオ利用能(OB)≥30%)および薬剤類似性(DL)≥0.1811の条件に基づいて事前にスクリーニングされました。これらの閾値は、十分な吸収性と薬剤様特性を確保するための標準的な実証基準として選ばれました。各化合物の標準的なSMILES配列はPubChemデータベースで検索され、得られた配列を用いてSwiss Target Predictionオンラインデータベースの化合物標的を予測し、その後UniProtデータベース12,13,14から標的タンパク質遺伝子名とUniProt IDを収集しました。中間チェックポイントとして、重複除去後に取得したユニークな目標の数が記録されました。
PCOSにおける子宮内膜受容性の作用標的の特定
「多嚢胞性卵巣症候群」および「子宮内膜受容性」というキーワードが、オンラインメンデル遺伝の人間(OMIM)、DrugBank、治療的ターゲットデータベース(TTD)、GeneCardsデータベースで潜在的な標的15、16、17、18の検索語として使用されました。GeneCardsでは、関連性スコア>5のターゲットのみが保持されました。その他のデータベースでは、回収されたすべてのターゲットが含まれていました。重複エントリーの統合および削除後、疾患関連標的の一意数が中間出力として記録されました。
コンポーネントとターゲットのネットワーク構築
交差標的は、QUF3、PCOS、子宮内膜受容性の可能な標的をオンラインのベン図ツールに入力することで生成されました。これらの交差標的は、QUF3がPCOSにおける子宮内膜受容性の改善に有効性を発揮する主要な標的と考えられました。その後、Cytoscape19を用いてこれらの交差標的とQUF3の活性成分標的データを照合することで、「ハーブ成分標的」(H-C-T)ネットワークが作成されました。ネットワークは「ネットワークアナライザー」ツールを使って可視化されました。
タンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク構築
PCOSにおける子宮内膜受容性改善のためのQUF3の潜在的な標的遺伝子がSTRINGデータプラットフォームに入力として提出されました。種は「ホモ・サピエンス」に設定され、信頼度閾値は「中程度の信頼度(0.4)」に設定され、タンパク質間相互作用データのTSVファイルが得られました。このファイルはネットワーク解析ソフトウェアに取り込まれ、PPIネットワーク21を構築し解析しました。ネットワーク内のノードの重要度は「Degree」値で示され、Degree値が高いほどより重要なノードを示します。その後、主要有効成分が学位ごとに分類され、学位ランキングに基づいて上位10のコアターゲットが選ばれました。
遺伝子オントロジー(GO)および京都遺伝子・ゲノム経路豊富百科事典(KEGG)分析
DAVIDデータベースを用いてGOおよびKEGG経路の濃縮解析を行い、QUF3がPCOS22における子宮内膜受容性を改善する生物学的経路とメカニズムを探りました。種は「ホモ・サピエンス」に分類され、有意性閾値はP < 0.05に設定されました。GO解析は生物学的プロセス(BP)、細胞成分(CC)、分子機能(MF)をカバーしました23。結果は濃縮ターゲットの数で分類されました。その後、ヒトの代謝や疾患に関連する経路を除外し、上位20のKEGG経路を可視化のために選定しました。その後、「成分-疾患-KEGG経路」の多次元ネットワークがネットワーク解析ソフトウェアを用いて構築されました。
分子ドッキング解析
上位10の主要活性成分と上位10のコアターゲットが、AutoDockToolsおよびPyMOLソフトウェアを用いて分子ドッキング解析のために選定されました。主要標的のPDBファイルはタンパク質構造データベース26からダウンロードされ、主要な活性成分のSDFファイルは化学データベース27から取得されました。タンパク質分子は分子ドッキングソフトウェアで前処理され、脱塩、水素添加、電荷計算が含まれていました。半柔軟なドッキングは、タンパク質結合部位全体を覆うグリッドボックスを用いて行われました。結合エネルギーが負で、トップポーズの平均二乗根偏差(RMSD)が≤2.0 Åであった場合、ドッキングプロセスは成功したとみなされました。ドッキング後、QUF3の主要な活性成分とコアターゲットの結果を分子可視化ソフトウェアで可視化しました。
分子動力学(MD)シミュレーション
GROMACSソフトウェアを用いてタンパク質-リガンド複合体のMDシミュレーションを行い、受容体とリガンドの相互作用を探った。amber99sb-ildn力場と一般アンバー力場(GAFF)は、それぞれタンパク質と配位子のパラメータと位相を生成するために用いられました。シミュレーションボックスのサイズは、各タンパク質原子とボックスの縁の間の距離が1.0 nmを超えるように設定されました。箱は単純な点電荷モデル(SPC216水分子)を用いた明示的な溶媒で満たされ、水分子はNa⁺およびCl⁻のカウンターイオンに置き換えられ、シミュレーションシステムを電気的に中性にしました。システム全体は、不合理な接触や原子の重なりを減らすために、最も急な降下法によって最適化されました。シミュレーションシステムの十分な前平衡化は、それぞれ300 Kおよび1バールでそれぞれ100 psのNVTおよびNPTアンサンブルを実施することで達成されました。その後、温度(300 K)と圧力(1バール)をそれぞれV-リスケール法とパリネロ・ラフマーン法で制御する周期的境界条件下で100 ns MDシミュレーションが実施されました。ニュートン運動方程式は、時間ステップ2 fsのリープフロッグ積分器を用いて解かれました。長距離静電相互作用は、0.16 nmのフーリエ間隔で粒子メッシュ・エヴァルト法(PME)を用いて計算され、すべての結合長はLINCS法で制約されました。VMDソフトウェアは軌道の表示、解析、アニメーションに使用されました。各化合物の結合自由エネルギーは結合自由エネルギー計算スクリプトを用いて計算されました。
主成分解析(PCA)、自由エネルギー地形解析(FEL)、および動的相互相関行列解析(DCCM)
PCAはMDシミュレーションソフトウェアを用いて、apoおよびリガンド結合錯体の優位立体構造運動を解析しました。Cα原子ゆらぎの共分散行列を生成し、そこから固有ベクトル(集団運動)および固有値(運動の大きさ)32を得ました。この解析を通じて、リガンド結合に関連する主要な動的領域と構造的柔軟性が特定されました。分子軌道はgmx anaeigツールを用いて最初の2つの主成分(PC1およびPC2)に投影し、本質的な動き33を捉えました。PCAおよびFEL計算には、平衡状態の最終100ns(RMSD安定相)のみが使用されました。FELはPCAデータからgmx shamを用いてGibbs自由エネルギー34を計算し、安定した立体構造とエネルギー最小値を明らかにし、立体構造の多様性や状態遷移を反映しました。Cα原子の動力学的相互相関行列(DCCM)解析を行い、構造的動力学および残基間運動結合を評価しました。この解析により、タンパク質-リガンド複合体の安定性、分子間相互作用、集合運動が明らかにされました。残基iとjの間の交相係数Cijは次のように計算されました。
式の文字iとjは2つの残基のCα原子を表します。Cijの値が正でゼロより大きい場合、同じ方向に動く2つの原子は相関運動とみなされます。Cijの値が負かつゼロ未満の場合、逆方向に動く2つの原子は反相関運動中とみなされます。Cij値がゼロの場合、2つの原子の運動に関係がないことを示します。さらに、Cij値が0.7を超える場合は、強相関(正)または強反相関(負)運動として解釈されました。収束を検証するために、RMSDとRgプロファイルが調査されました。安定したプロファイルは、最後の100ナショナルがDCCM解析に十分であることを確認しました。これらの運動パターンは、リガンド結合が分子内コミュニケーションやドメイン再配置をどのように調節するかを明らかにしました。動的安定性と収束を確保するため、平衡軌道の最後の100nsのみを解析し、相関マップを可視化して動的相互作用が大きい領域を強調しました。
タンパク質とリガンド間の相互作用エネルギーをよりよく説明するために、結合自由エネルギー計算スクリプトを用いて、平衡状態にあるすべてのタンパク質-リガンド複合体の結合エネルギーを計算しました。結合自由エネルギー計算法36の応用において、総結合エネルギーは静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、極性溶溶剤化、非極性溶剤化相互作用の4つの独立した部分に分解されました。非極性溶媒化の項は通常SASAと呼ばれます。
ターゲットおよび経路選択のための手続的エンドポイントの結論
ワークフローの最後に、PPIネットワークで上位10度のコアターゲットと、H-C-Tネットワークで上位10度の主要な活性成分を基準に、最終検証済みのターゲットと経路が選定されました。KEGG経路については、ヒトの代謝や疾患に関連するものを除外した後、上位20の経路が濃縮標的の数に基づいてランキング・選定されました。MDシミュレーション結果を用いて、上部成分とコアターゲット間の安定した結合を確認しました。これらのステップが総合的にプロトコルの最終出力を定義しました。
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結果
QUF3の有効成分および潜在的標的のスクリーニング
OB ≥ 30%およびDL ≥ 0.18をスクリーニング基準として用い、TCMSPデータベースを検索した結果、QUF3は126の化学成分を特定しました。そのうち、Paeoniae radix alba(白少)は13個の活性成分を含み、Rehmanniae Radix Praeparata(Shudihuang)は2個、Cuscutae Semen(Tusizi)は13個、Fructus Ligustri Lucidi(Nvzhenzi)は13個、Herba Taxilli(Sangjisheng)は2個、Radix Salviae(Danshen)は65個、Cornus Officinalis Siebは含まれていました。エト・ズック。(山主書)は20人( 補足表1参照)を含んでいました。126の化学成分はスイスターゲット予測オンラインデータベースに登録されました。重複を除去した後、91個の化学成分と284個の標的を得ました。
PCOSにおけ...
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ディスカッション
PCOS患者の子宮内膜に機能障害が見られるという証拠が増えており、これは着床失敗率や妊娠不良の発生率と相関している可能性があります(40)。PCOS女性の子宮内膜の違いは主に、着床ウィンドウ(WOI)41におけるピノポード、核小体チャネル系、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体の発現低下に特徴づけられます41。さらに、ホメオボックスA10(HOXA-10)、ホメオボックスA11(HOXA-11)、インテグリンαVベータ3(αvβ3)、白血病阻害因子(LIF)の子宮内膜マーカーの発現も減少し、PCOS女性の不妊の原因となる可能性があります。ミヨイノシトール(MYO)は、PCOSに関連する新しい子宮内内膜マーカーです。インスリン感作剤として、MYOはインスリンシグナル伝達に関与し、アデノシン...
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開示事項
本原稿の提出には利益相反はなく、すべての著者により出版の承認が認められています。
謝辞
著者らは、本研究に関して追加の謝辞はないと述べています。
資金提供元:中国浙江省自然科学基金(番号:LZ26H270001 F.Q.へ);中国国家自然科学基金(番号82575119、F.Q.);中国浙江省衛生委員会の健康高レベル人材育成プロジェクト(助成金番号)[2021] 40 to F.Q.)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (Version 2.3) | Lab of Systems Pharmacology | https://www.tcmsp-e.com/load_intro.php?id=43 | 活性成分のスクリーニングデータベース |
| Swiss Target Prediction online database (2019 version) | Molecular Modelling Group, University of Lausanne & SIB Swiss Institute of Bioinformatics | http://www.swisstargetprediction.ch/ | オンラインターゲット予測データベース |
| PubChem database | National Library of Medicine, NIH | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ | 化合物のSMILES/SDF検索のための化学データベース |
| UniProt database | NIH | https://www.uniprot.org/uniprotkb | UniProt IDと遺伝子名のタンパク質データベース |
| Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) | Johns Hopkins University | https://www.omim.org/ | 疾病ターゲットデータベース |
| DrugBank | University of Alberta | https://www.drugbank.ca/ | 疾病ターゲットデータベース |
| Therapeutic Target Database (TTD) | Zhejiang University | https://ttd.idrblab.cn/ | 疾病ターゲットデータベース |
| GeneCards (Version 5.26) | Weizmann Institute of Science, LifeMap Sciences | https://www.genecards.org/ | 疾病ターゲットデータベース（関連スコア>5） |
| Venny visualization platform (Version 2.1.0) | Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC) | https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ | ターゲット交差表示のためのオンラインベン図ツール |
| Cytoscape (Version 3.10.3) | National Resource for Network Biology, NHGRI | https://cytoscape.org/ | H-C-T、PPI、および経路ネットワークのためのネットワーク分析・可視化ソフトウェア |
| STRING database (Version 12.0) | STRING Consortium | https://string-db.org/ | PPIネットワーク構築のためのタンパク質-タンパク質相互作用データベース |
| DAVID database (Version v2025-2) | U.S. Department of Health & Human Services, NIH | https://davidbioinformatics.nih.gov/ | GOおよびKEGGの遺伝子エンリッチメント分析データベース |
| AutoDockTools (Version 1.5.7) | The Scripps Research Institute | https://autodock.scripps.edu/ | 前処理および計算のための分子ドッキングソフトウェア |
| PyMOL software (Version 3.0.3) | Schrödinger | https://pymol.org/ | ドッキング可視化のための分子可視化ソフトウェア |
| Protein Data Bank (PDB) | RCSB | https://www.rcsb.org/ | ターゲットPDBファイルのダウンロードのためのタンパク質構造データベース |
| GROMACS (Version 2023.2) | GROMACS development team | https://www.gromacs.org/ | 分子動力学シミュレーションソフトウェア |
| VMD (Version 1.9.3) | University of Illinois | https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/ | 分子可視化および軌道分析ソフトウェア |
| gmx_MMPBSA | Open-source (GitHub) | https://github.com/Valdes-Tresanco-MS/gmx_MMPBSA | MD軌道からの結合自由エネルギー計算ツール |
| Science Data Bank | Chinese Academy of Sciences, Computer Network Information Center | https://www.scidb.cn/ | データ可用性および保管のための科学データリポジトリ |