患者由来の骨髄および末梢血単核細胞に適応したコロニー形成ユニットアッセイ

サマリー

このプロトコルは、患者の骨髄および末梢血単核細胞から由来するヒト造血幹細胞および前駆細胞の分化誘導手順を概説しています。このアッセイは半固体培養培地を用いて赤血球および骨髄系譜のコミットメントを支持し、前臨床薬物特性評価のための再現性コロニー分類の標準化された指標を取り入れています。

要約

コロニー形成単位(CFU)アッセイは、骨髄異形成症候群(MDS)や急性骨髄性白血病(AML)を含む血液疾患の研究における基礎的な技術です。このアッセイは、半固体培地に定義されたサイトカインの組み合わせを補足し、赤血球および骨髄前駆細胞の三次元増殖および系統特異的分化を支援します。しかし、患者由来の末梢血液および骨髄サンプルは、生存率の低下、取り扱いの感受性の増加、コロニー成長の変動性により技術的課題を抱えています。さらに、コロニーの同定とカウントに関する既存のガイドラインでは、コロニーの規模や系統タイプの定義に大きなばらつきがあり、研究間での再現性が制限されています。本プロトコルは、MDSおよびAML患者サンプルから分離した造血幹細胞および前駆細胞の増殖と分化に最適化されています。プロトコルは、穏やかな細胞取り扱い、患者標本の無菌処理、最適化された培養条件、患者由来細胞に合わせた成長期間を重視しています。このプロトコルは、患者由来サンプルを用いたCFUアッセイの実用的な枠組みを提供し、血液悪性腫瘍研究における一貫したコロニーカウントと解析のための標準的な指標を確立します。

概要

造血は、骨髄ニッチに存在する造血幹細胞(HSC)がすべての成熟した血球系統を生み出す厳密に制御されたプロセスです。階層的な分化イベントの連鎖を通じて、HSCは多能性の前駆細胞を生成し、これらは徐々に赤血球、骨髄系、リンパ系の系統に移行し、最終的に機能的な循環血球へと成熟します。この過程は骨髄微小環境内の協調シグナル伝達と、内在的な転写およびエピジェネティックな調節機構によって制御されています。これらの調節経路の乱れ、特にHSCにおける遺伝的または体細胞変異の蓄積は、正常な分化を妨げ、異常な前駆体のクローンの拡大を引き起こす可能性があります。このような変化は最終的に、非効果的な造血や細胞減少を特徴とする血液学的障害、すなわち骨髄異形成症候群(MDS)や急性骨髄性白血病(AML⁾1,2,3,4,5を引き起こす可能性があります。

コロニー形成単位(CFU)アッセイは、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の分化可能性を評価するための確立されたin vitro技術です。もともとは造血前体^6,7,8の増殖および分化能力を測定するための短期アッセイとして開発されましたが、その後臨床および実験的^{血液学の両方}で広く使われるツールとなっています。前臨床実験室では、このアッセイは遺伝的撹乱や候補治療薬が造血分化に与える影響を評価するために頻繁に用いられます。MDSおよびAML研究の文脈において、CFUアッセイは分子および遺伝的変化が患者由来の骨髄や末梢血球の分化能力にどのように影響するかを理解するための機能的な指標を提供します。

CFUアッセイでは、系統特異的拡張と分化を支える成長因子を補いたメチルセルロースベースの半固体培地でHSPCを培養します。これらの条件下では、前駆細胞が増殖し、系統の同一性に応じて形態学的に分類できる離散的なコロニーを形成します。このプロトコルでは、赤血球および骨髄系分化に最適化された市販のメチルセルロースベースの半固体培地が使用されます。この培地には、インターロイキン-3(IL-3)、インターロイキン-6(IL-6)、幹細胞因子(SCF)、エリスロポエチン(EPO)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)などのサイトカインが組み合わされています。これらの因子は、コロニー形成型ユニットエリスロイド(CFU-E)やバースト形成型ユニットエリスロイド(BFU-E)、骨髄顆粒球マクロファージ前駆体(CFU-GM)、および多能性前身である顆粒球、赤血球、単球、メガ核細胞前駆体(CFU-GEMM)^10,11の成長を支えています。

広範な用途があるにもかかわらず、前述の半固体培地はメガ核細胞や血小板の分化を十分に支援できないため、分化能力に限界があります。これらの用途には、血小板成長因子を含むより専門的な製剤が適しており、しかし、これらは定められたプロトコルの範囲外です。全体として、培地の慎重な選定と形態学的評価、フローサイトメトリーなどの下流解析を組み合わせることで、研究者は系統のコミットメントや分化ポテンシャルの解析を通じて薬物感受性を効果的に評価できます^。

本研究では、CFUアッセイを用いて再発・難治性高リスクMDSの治療における併用療法の治療可能性を調査しています。ピリメタミンはトキソプラズマ症や寄生虫性マラリアの治療に臨床的に承認された抗葉酸薬であり、最近では抗がん剤として研究^{されています。}最近の研究では、ピリメタミン治療が新規ピリミジン合成を調節する主要な経路の阻害を通じて作用する可能性があることが示されています¹⁶。本プロトコルでは、CFUアッセイを用いて、ピリメタミンの単剤治療および現在MDSおよびAML治療の最前線治療であるベネトクラックスとの併用療法としての臨床的有効性を調査しています^17,18。

CFUアッセイは広く使われているにもかかわらず、いくつかの技術的制約を抱えています。コロニーの同定と分類は形態学的基準に大きく依存しており、観察者間や研究センター間でばらつきが生じることがあります。6,19,20,21。さらに、MDSやAML患者からの患者由来サンプルは、細胞生存率の低下、脆弱性の増加、異質性を示すことが多く、コロニー形成や下流解析を複雑にする^{ことがあります。}したがって、フローサイトメトリーを含むさらなる特性評価のためのコロニー準備は、細胞の完全性を保つために慎重な取り扱いが必要となる場合があります。コロニーの同定、計数、下流解析のための標準化された手順の欠如も、研究間でのばらつきをさらに生み出しています。これらの技術的考慮は、患者由来の造血サンプルに特化した標準化された手技の必要性を強調しています。

このプロトコルは、血液悪性腫瘍患者の一次骨髄または末梢血検体から抽出された単核細胞を用いたCFUアッセイを行う最適化されたワークフローを示しています。このアプローチは、感受性の高い患者由来細胞の取り扱い、信頼できる培養条件の確立、コロニー同定と定量のための一貫した基準の実装に焦点を当てています。詳細な方法論的指導と再現性のある分析手法の重視により、MDSおよびAMLの前臨床試験における造血分化および治療反応のより信頼性の高い評価を促進することを目指しています。

プロトコル

本研究は、アルベルト・アインシュタイン医科大学/モンテフィオーレ医療センターの機関審査委員会承認プロトコル「良性および悪性血液疾患の分子生物学」(IRBプロトコル#200536)に基づき、バイオバンクから取得した同名化されていないヒト生体標本を利用します。すべての手続きは機関倫理ガイドラインに従って実施されました。すべての試薬および機器は材料表に記載されています。

1. 患者由来の骨髄または末梢血単核細胞の調製

注意:一般的な患者サンプル取り扱いガイドラインによると、血液媒介病原体曝露から身を守るために、全身の白衣と涙に強い使い捨て手袋を着用し、実験室の細胞培養フードの下で作業することが推奨されています。患者細胞に接触するすべてのピペットチップおよび血清学的ピペットは、バイオハザード廃棄物として処分する前に、少なくとも30分間10%漂白剤溶液に浸けておくべきです。

1. 実験的調製
   1. 温めたIMDM培地、胎児用牛血清(FBS)、ペニシリン・ストレプトマイシン(ペンストレプ菌)抗生物質を37°Cまで少なくとも30分間投与。
   2. 半固体の媒体を4°Cで一晩解凍します。盛り付け当日には、ボトルを室温(RT)に少なくとも30分間温めてください。
   3. 細胞培養フードをUV滅菌で15分間滅菌し、その後フード表面、ピペット、チューブラックに70%エタノール(EtOH)を散布します。
   4. 汚染されたピペットの先端や血清学的ピペットを回収できるほどの大きさの10%漂白剤溶液を含む廃棄ビーカーを準備します。
   5. 密度勾配遠心分離法で単離された骨髄または末梢血の単核細胞を取得します。細胞は採取当日に使用することも、凍結されたバイオバンクサンプルからも使用できます。
2. サンプルを凍結する場合は、37°Cの水浴で急速に解凍し、氷の大部分が溶けて小さな氷結晶だけが残るまで続けます。解凍後はすぐにサンプルを氷に置きます。
   注意:患者のサンプルは解凍に非常に敏感です。細胞死を最小限に抑えるために、サンプルはできるだけ早く、かつバッチで解凍することが重要です。
3. 細胞を5mLの温めた完全増殖培地(IMDM培地に4%FBSと1%ペンストレプ菌を補足)に懸浮させます。
4. AO/PI染色染料と自動細胞カウンターを用いて細胞濃度と生存率を測定します。
5. 細胞を室温で350 x g の遠心分離機で5分間、細胞にペレットを送ります。上澄液を捨てる。
6. 細胞を5mLの無菌デュルベッコリン酸塩緩衝生食塩水(DPBS)に再懸浮させます。ペレット細胞への遠心分離を繰り返し、上清液を廃棄します。
7. 細胞を完全な培養培地にサスペンドし、200万個の生細胞/mLの濃度にします。6ウェルプレートのウェルあたり100Kセル分のセルを準備します。

2. 薬剤の調製および治療投与。

注:ピリメタミンは凍乾粉末として得られ、100 mM濃度のジメチルスルホキシド(DMSO)で社内で再構成されます。アリコートは−80°Cで保存されます。 ベネトクラックスはDMSOにあらかじめ溶解された状態で10 mMの濃度で購入され、-20°Cで保存されます。 本実験では、ベネトクラックスとピリメタミンを単回投与し 、車両対照 DMSO治療条件と並行して遊離取り込みを行います。
注意:ピリメタミン、ベネトクラックス、DMSOは生物有害物質です。ボンネットの下だけを触り、PPEを着用し、特に注意して使用してください。

1. 盛り付け当日、氷の上で解凍薬剤を溶かし、渦を巻き、卓上型のミニ遠心分離機で最大速度で30秒回転させます。
2. ボルテックスし、半固体媒体のボトルを激しく混ぜて、すべての成分が均質化されるまで繰り返します。気泡が表面に上がるのを待つために、室温のフード内で30分間そのまま放置してください。
3. 半固体培地3 mLのアリコートを無菌15 mL円錐管に準備します。チューブを30分間動かさずに置き、泡が表面に浮かび上がるのを待ちます。半固体のメディアアリコートは再冷凍し、後で使うために-20°Cで保存することができます。
4. 半固体培地に最大10μLの薬剤量を加えます。この実験では、ベネトクラックスとピリメタミンの濃度を経験的に決定された相乗効果条件に従って調整します。車両対照群に、同等量のDMSOを加えます。各疾患ごとに3mLのアリクオートを複製して準備します。
   注意:半固体培地中の最終濃度に影響を与えないよう、添加された薬物の量は無視できる程度に保つことが重要です。
5. ボルテックスメディアは4〜5回の短いバーストで投与され、薬剤を完全にメディアに取り入れる。
   注意:細胞混合物をボルテクサーに長時間保持しないでください。これは細胞死を引き起こす可能性があります。
6. 半固体培地の3 mLアリコートに加え、100 μLの細胞、または同等の200,000細胞を加えます。ボルテックス混合は短時間で行われ、完全に混入・均質化されるまで続けます。
7. 16Gの鈍い針を3mLの注射器に取り付け、その針と注射器を細胞混合物に落とします。泡が表面に浮かび上がるまで、30分間そのままにしておきましょう。

3. 薬物処理された細胞懸濁液の板付け。

1. 浸した針と注射器を使って細胞と薬物の混合物を取り込み、気泡を吸引しないように注意してください。3〜5分待ってから、15mL円錐形チューブの側面に溜まった残りの混合物を取り出します。
2. 滅菌6ウェルプレートでは、セル混合物を滴ごとに加え、プレートの外側カラムの2つのウェル間に大きな滴を交互に加えます。プレートを円を描くように優しく傾けて、井戸の底全体を均等に覆い、混合物を広げます。これら2つの井戸は技術的な複製を構成しています。
   注意:気泡ができたり誤ってウェルに加えられた場合は、ピペットフィルターチップを使って気泡を優しく弾き飛ばしたり、プレートの端に移動させてください。プレートに大きな気泡が残ると、コロニーの成長に影響を与えることがあります。
3. コロニーアッセイ混合物は6ウェルプレートの外側の柱にのみ添加します。中央の柱に各井戸に5mLの滅菌水を加えます。井戸に水を加えることで、半固体培地が乾燥するのを防ぐために十分な水分が確保されます。
4. プレートを5%_CO2の37°Cインキュベーターで培養します。細胞の成長と水分量を週2回観察しましょう。細胞はプレートから約7日後に目で見えるコロニーを形成し、プレートはプレートから14〜21日の間に75%〜80%のコンバーシティに達するべきです。

4. コロニーイメージングとカウント

注:このプロトコルはEVOS M7000イメージングシステムで使用されるために検証されたパラメータを記述しています。これらの設定は他のプレートイメージングシステムとの互換性のために最適化または適応が必要になる場合があります。

1. 顕微鏡のプラットフォームから保護光フィルターカバーを外してください。顕微鏡を起動し、関連するソフトウェアを開いてください。
2. 顕微鏡装置の上部レンズに光の拡散器を挿入します。
3. プレートの位置をプラットフォームに挿入し、A1が左上隅に位置するようにします。
4. イメージングソフトで以下のフォーカス設定を入力します:
   1. 画像化する容器を選択します。このプロトコルでは6ウェルプレートが使用されます。
   2. 目標を 4倍に設定してください。
   3. 光源を トランス(Trans )にするか、顕微鏡を明視野モードに切り替えます。
   4. 顕微鏡のライトをつけ、粗いスライダーを使って手動で光の強度を調整します。このプロトコルで使用される機器の場合、コロニーの画像診断に最適な範囲は約0.03です。
   5. 楽器にオートフォーカス機能があれば、それを使ってフォーカスを調整してください。必要に応じて、マニュアルのファインフォーカス設定でさらにフォーカスを調整してください。
5. 以下の自動画像キャプチャ設定を入力してください:
   1. 各井戸で画像化する井戸全体を選択します。
   2. 自動画像キャプチャを選択して、井戸の中心から始まり、井戸の端に向かって螺旋状に外側へと進みます。
   3. 各ウェルで機器が再ピントするように自動フォーカス設定を選択します。
   4. 各ウェルのRAW画像をタイル化・マージするオプションを選択してください。
   5. 画像を水平・垂直に反ささせる選択をしてください。
   6. 「タイル画像」と「統合画像」を収集するためにデータ保存設定を選択してください
   7. 自動ナンバープレートスキャンを実行してください。このプロトコルで使用される機器は1.5分/ウェルの速度で動作します。
   8. プレートを取り外し、保護フィルターカバーを顕微鏡プラットフォームにかぶせ、顕微鏡の電源を切り、ソフトウェアを閉じます。
   9. 画像検査後、タイル状の結合井戸画像を使って、各ウェル内の個々のコロニー数および骨髄および赤血球サブタイプを手動で数えます。
6. コロニーは以下の形態的特徴付けに従って定義します。
   1. 個々のコロニーまたはコロニークラスターが、他の細胞集団から十分に離れている距離、つまりその細胞群の長さに等しい距離にあると考えます。この距離制限内にいる個体群は一つのコロニーカウントにまとめられます。
   2. 赤血球コロニーが深く色素化し、濃い赤色に見えることを確認してください。これらのコロニーは、明確に縁を持つ密に成長する単一集団またはクラスターとして現れます。成長が遅い未成熟細胞集団からなるより小さな赤胞菌コロニーはCFU-Eに分類されます。より成熟した個体群を持つ大きなコロニーはBFU-Eに分類されます。
   3. 骨髄コロニーに、より透き通っていて色が明るい細胞が含まれているか確認してください。骨髄状コロニーはより分散しており、明確な縁を持たない。骨髄系コロニーはクラスターよりも単一集団として成長する傾向がありますが、時折クラスターが見られることがあります。いずれの場合も、骨髄コロニーはCFU-GMに分類されます。
   4. エリスロイドおよび骨髄型の両方を含む混合コロニーをCFU-GEMMに分類します。

5. フローサイトメトリー による 細胞採取および下流解析のための凍結

1. 始める前に以下のステップを実行してください:
   1. a.蛍光活性化細胞選別バッファー(FACSバッファー、DPBS/4% FBS構成)および培地(FBS/10% DMSO)を37°Cの水浴で少なくとも30分間加熱します。
2. 各井戸の表面に5mLの温めたFACSバッファーを加えます。半固体培地を溶解するために、37°Cのインキュベーターで少なくとも30分間培養皿を培養します。
3. 5 mLピペットで細胞を徹底的に再懸濁し、無菌の50 mL円錐形チューブに移します。
4. 5mLの温めたFACSバッファーを使用し、各ウェルを3回洗浄し、全量を50mLの円錐形チューブに移します。
5. 細胞を4〜5回の短時間で渦巻きさせて適切に再懸浮させ、その後400 x g で10分間RTで遠心分離してペレットセルに送り込みます。遠心分離後にペレットが見えない場合、細胞は半固体培地に懸浮したままです。吸引せずに、チューブにさらに10〜15 mLのDPBSを加え、半固体培地をさらに希釈し、良好に再懸濁させます。必要に応じて、37°Cで10〜15分間培養して培地を完全に溶解させ、その後再びペレット細胞を採取します。
6. 上清液を吸引し、細胞を10 mLのFACSバッファーに再懸濁させます。400 x g で離心分離機を10分間RTでセルにペレットを入れます。
7. 細胞を冷凍培地に再懸浮させ、300万個の細胞を冷凍保存で分離します。バイアルを-80°Cの制御速度冷凍容器で24時間冷凍し、1°C/分の冷却速度を実現します。
8. クライオバイアルはできるだけ早く液体窒素貯蔵に移してください。
   注:-20°Cで長期間保管すると、サンプルの生存率は低下します。細胞を液体窒素に移して長期保存することが重要です。

結果

図1は、患者サンプル分離からコロニー数およびコロニー形態の解析に至るまでのコロニーアッセイパイプラインを示しています。 図2 は明視野顕微鏡上のコロニーイメージングの主要設定を示しています。 図3および図4 は、単一患者由来サンプルからプレートプレート後13日目のコロニー形成の代表的な画像を示しています。 図3では、コロニーが自動蛍光イメージングシステムで画像化されています。画像は形態に基づいてコロニー数を手動で数えることで採点されます。 図3A は、対照DMSO処理細胞とピリメタミン単剤、ベネトクラックス単剤、および併用治療条件の比較を示しています。

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、患者の一次骨髄および末梢血サンプルを用いたCFUアッセイを行う最適化されたワークフローを示し、特に細胞の生存率の維持と再現性のあるコロニー成長の確保に重点を置いています。患者由来サンプルを扱う際には、信頼性の高いコロニー形成を達成するためにプロトコルのいくつかのステップが重要です。凍結保存された単核細胞の急速解凍と即時冷却は、細胞の生存率を維持するために不可欠です。なぜなら、長時間の解凍は脆弱な一次サンプルの細胞死を大幅に増加させる可能性があるからです。洗浄や再懸濁作業中の優しい取り扱いも同様に重要であり、過度の機械的ストレスは前駆虫の生存を低下させ、コロニー形成に悪影響を及ぼす可能性があります。

メチルセルロース系半固体培地の製備も慎重な取り扱いが必要です。培地内でサイトカインやサプリメントを均質化するためには徹底的な混合が必要であり、メッティング前に混合物を休ませることで、コロニーの成長を妨げる気泡を除去するのに役立ちます。さらに、半固体マトリックス内のセルの均一な混合は、技術複製間...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Blunt-End 16 G needles	STEMCELL Technologies	28110	MethoCult培地の注入とプレート化用
Cellometer Auto 2000	Nexelcom Bioscience	26407	細胞カウンター
CHT4 Counting Chambers (細胞カウンタースライド)	Revvity	CHT4-SD100-002	細胞カウンター用スライド
ジメチルスルホキシド	Fisher Bioreagents	BP231-100	薬物再構成および細胞凍結培地用
Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水	Sigma-Aldrich	D8537	細胞培養用
エタノール 200プルーフ	Decon Laboratories, Inc.	2701	細胞培養表面の滅菌用
EVOS M7000 イメージングシステム	ThermoFisher Scientific	AMF7000	コロニーおよびプレートのイメージング用
胎児ウシ血清	BenchMark	100-106	細胞培養および凍結用培地補充剤
IMDM改変培地	Cytiva	SH30228.01	患者サンプル処理に適した強化培地
LuerLok チップ 3 mLシリンジ	BD	309657	MethoCult培地の注入とプレート化用
MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	04435	コロニーアッセイ用メチルセルロースベースの半固形培地
マルチウェル 6ウェルプレート	FALCON	353046	コロニーアッセイプレート化用
ニコン エクリプス TS2FL 倒立式三眼相差蛍光顕微鏡	Coastal Microscopes	51623	コロニー形態イメージングと特性評価用
ペニシリン・ストレプトマイシン	Gibco	15140-122	細胞培養用抗生物質サプリメント
ピリメタミン	Sigma-Aldrich	46706	FDA承認された抗葉酸薬
UltraPure 蒸留水	Invitrogen	10977-015	コロニーアッセイプレート化用
ベネトクラックス	Selleck Chemical LLC	50-136-6419	FDA承認化学療法
ViaStain AOPI染色溶液	Revvity	CS2-0106	生細胞カウント用バイアビリティ染色